CN101457250B

CN101457250B - 一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法

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Publication number: CN101457250B
Application number: CN2008101638207A
Authority: CN
Inventors: 陈启和; 刘婧; 章海锋; 何国庆; 傅明亮
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2008-12-25
Filing date: 2008-12-25
Publication date: 2010-11-03
Anticipated expiration: 2028-12-25
Also published as: CN101457250A

Abstract

本发明公开了一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括：向灭菌过的培养液中接入黄绿蜜环菌ZJUQH，得到预反应体系；再加入含有白桦脂醇的底物溶液，于25～30℃转化反应5～7天得到转化后的培养液，经后处理得到白桦脂酸，其中白桦脂醇用量以每升培养液计为0.01～0.1g。该方法与直接植物提取白桦脂酸法和化学合成白桦脂酸法相比，主要优点是微生物细胞培养时间短、操作简便、易于控制，整个生物转化周期较短，转化过程安全可靠，成本低，适于工业化生产。

Description

一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法

技术领域

本发明涉及生物工程和微生物发酵领域，尤其涉及一种利用微生物转化反应合成白桦脂酸的方法。

背景技术

白桦脂醇(betulin，lup-20(29)-ene-3β，28-diol)和白桦脂酸(betulinicacid，3β-hydroxy-lup-20(29)-en-28-oic acid)属羽扇烷型三萜类化合物，在自然界中广泛存在，其最丰富的自然资源是白桦树(Betula spp.)。近年科学研究发现，白桦脂醇和白桦脂酸是非常有价值的天然产物。白桦脂醇、白桦脂酸及其衍生物作为生物制剂在抗艾滋病(HIV)和癌症治疗等方面表现出了巨大的潜能，并显示出了与以往药物不同的作用机制。因此，对白桦脂醇和白桦脂酸及其衍生物的研究已成为近年来天然有机药物研究的热点。尤其是白桦脂酸，具有宽范围的生物学以及药理学活性，具有抗疟性、抗炎性和抗肿瘤活性，尤其在抗艾滋病活性及抗各种肿瘤细胞系细胞毒性方面可与一些临床用药相比，已被视为最有潜力的新型药物制剂。在我国，白桦分布范围广，植物资源丰富，但研究开发甚少。研究我国白桦资源，对于我国资源的开发、天然药物的研究都具有非常重要的意义。

生物转化是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器，以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰的生化反应。一方面天然产物一直是人类寻找有效活性成分的源泉；另一方面在开发新药过程中，以天然产物为先导化合物，通过化学或生物的手段，对其结构进行修饰，得到更多结构新颖的化合物，进而发现毒性更低、疗效更好的药物。微生物作为一个完整个体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。同时由于微生物资源丰富，种类繁多，对于特异的底物，可供筛选的菌株很多。以多种不同催化功能的酶系对天然活性成分进行生物转化，可产生新的组合性的天然化合物库，再通过活性筛选，可寻找新的高效低毒的天然活性先导化合物，或通过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系的分析发现关键活性成分。而利用微生物转化可以发现新一代的先导化合物，已取得了巨大的社会效益和经济效益。生物转化规律还可以指导新药的结构修饰，获得高效长效的新一代药物，足以说明生物转化对新药开发的重要性。

微生物转化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化反应，是近年来新兴起的获得目标产物的又一途径。微生物转化具有许多优点，譬如，微生物倍增时间短，生物量积累快，从而产生的酶量就相应较多，转化时间短；微生物的基因工程研究工作成熟，转化酶的高效表达成为可能；微生物发酵工艺成熟，便于工业化生产。随着现代提取、分离、鉴定手段的进步，使微生物技术的应用不再局限于传统酿造及小分子化合物的转化，正广泛地应用于药物前提化合物的转化、生物催化的不对称合成、光学活性化合物的拆分、新药开发、药物代谢体外模型预测等领域，已成为生物转化技术中发展最为迅速的分支之一。微生物作为一个完整的生命体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。在它生长过程中有许多酶的参与，如合成酶、水解酶、异构酶、氧化酶、还原酶等，它们都可能对加入其中的底物发生作用，使其结构发生变化。同时由于微生物资源丰富，种类繁多，对于特异的底物可供筛选的菌株很多。利用微生物还可以模仿生源合成途径，合成贵重药品或者其它化学合成前提，提高原料利用率，有效延缓资源消耗。如，美国施贵宝公司利用微生物转化进行紫杉醇的合成，他们分别从Nocardioides albus SC 13911，Nocardioidesluteus SC 13912，Morexella sp.三种微生物的发酵液中分离出C-13 taxolas，C-7 xylosidase，C-10 deacetylase，分别将红豆杉中的几种紫杉烷的7、10、13位进行水解，得到较多而单一的10-去乙酰-Baccatin II，该产物为紫杉醇合成的重要前体化合物，再利用化学反应，连接上13位的侧链，即可得到紫杉醇。

白桦脂酸在实际生产中的来源主要有两类：一类是从天然植物中提取的；另一类是化学合成的。白桦脂酸广泛分布于多种植物中，如五加科(刺五加)、桦木科(白桦外皮)、鼠李科(酸枣仁)、柿科(白黑柿叶)等。因此，早期的白桦脂酸提取大多采用直接提取法。然而，白桦脂酸在植物中的含量很少，据文献报道在白桦树皮中也仅含有0.025％。用直接提取法原料消耗量大，成本高，所得到的白桦脂酸杂质含量比较高，且不易除去，无法满足商业需要。目前，以白桦脂醇为前体，经过化学合成法制备白桦脂酸较多地应用于生产实践中，虽然合成效果较好，但存在操作复杂、污染大、合成成本高、安全性低等问题，限制了其在实际中的应用。微生物转化法合成白桦脂酸目前研究甚少，但其具有转化条件温和、转化效率高、不良反应少、安全性高、生产成本低等优点，可预见其将会有非常好的研究前景。

有关白桦脂酸的生物法合成目前研究甚少，国外仅有一些关于白桦脂酸及其衍生物的微生物转化研究，而国内研究则几乎空白。Denise等对白桦脂酸和白桦脂酮酸进行了微生物转化研究。在研究中，两种化合物分别经过来自悬铃木树皮的线虫捕捉菌、腔胞菌、暗色孢属，和来自玉米叶片的刺盘孢四种微生物代谢转化。转化后产物经过特征表征，确定分子结构。结果显示：不同菌株生物转化白桦脂酸或白桦脂酮酸得到不同的衍生物，且都是白桦脂酸或白桦脂酮酸的氧化产物。这表明这些真菌有利于羽扇烷型结构物质在C-3，C-7，C-15，C-25和C-30位置有选择的氧化。另外，Parnali等研究了Bacillus megaterzum ATCC 13368菌种生物转化白桦脂酸得到4种相关衍生物。根据国外相关研究不难看出，通过微生物转化，白桦脂酸能被成功氧化为多种衍生物，并且微生物种类不同可以氧化白桦脂酸得到不同的衍生物。为此，如果筛选出合适的菌株能有利于白桦脂醇相应碳位的氧化，实现微生物转化合成白桦脂酸，并能建立合适的转化体系和方法，再利用发酵便可以获得大量白桦脂酸，这将为进一步研究白桦脂酸及其衍生物的药理作用、临床实验，以及白桦脂酸的工业化生产奠定良好基础，具有重要的理论价值和实际开发意义。

发明内容

本发明提供了一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，利用黄绿蜜环菌ZJUQH将白桦脂醇生物转化成白桦脂酸，该方法操作简单、转化条件温和、转化效率高、安全性高、成本低。

本发明所使用的黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc.)ZJUQHCGMCC No 1884，在申请号为200610155189.7的中国发明专利申请中详细描述了其获取、培养方法和形态，并发现其能在特定培养基与培养条件下分泌多糖。该菌株已经保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2006年12月08日，保藏号：CGMCC No 1884。

一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括：

(1)向培养液中接入黄绿蜜环菌ZJUQH，得到预反应体系；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液，于25～30℃(优选28℃)转化反应5～7天(优选6天)得到转化后的培养液，白桦脂醇用量以每升培养液计为0.01～0.1g(优选0.05g)；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

本发明方法步骤(1)中，为得到预反应体系可采用直接生长转化法、静息细胞转化法或微乳液体系转化法。

采用直接生长转化法时：

所述的培养液选用马铃薯葡萄糖液体(即马铃薯培养基)，其原料质量百分比组成为：马铃薯20％，葡萄糖2％，余量为水。

所述的黄绿蜜环菌ZJUQH选用黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液，悬浮液中黄绿蜜环菌ZJUQH孢子浓度为1×10⁶个/毫升～1×10⁸个/毫升。

马铃薯葡萄糖液体与黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为6～30。

所述的黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液是将马铃薯葡萄糖固体培养基上斜面培养的黄绿蜜环菌ZJUQH菌株刮入无菌水后振摇制得的。

所述的预反应体系是在马铃薯培养基中接入黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液后于25～30℃(优选28℃)培养1～3天(优选3天)得到的。

采用静息细胞转化法时：

所述的培养液选用含有葡萄糖的磷酸缓冲液(pH6)，其中葡萄糖的质量百分比浓度为2％；

所述的黄绿蜜环菌ZJUQH选用黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞；

其中培养液的毫升数：黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的克数＝5～6。

采用微乳液体系转化法时：

所述的培养液为葡萄糖水溶液，葡萄糖的质量百分比浓度为2％，自然pH；

所述的黄绿蜜环菌ZJUQH选用黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞；

其中培养液的毫升数：黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的克数＝5～6。

本发明方法所述的黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞，可通过如下方法制备：

将活化的黄绿蜜环菌ZJUQH种子接入发酵培养基(该培养基一般选用马铃薯葡萄糖液体培养基)，于28℃、转速为120r/min的摇床中培养3天后停止发酵，通过冷冻离心或无菌过滤方法除去发酵液，得到黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞。

本发明方法步骤(2)中的白桦脂醇溶液为白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，即该溶液的溶剂为二甲基亚砜。

白桦脂醇溶液中白桦脂醇的浓度为7.5mg/ml，白桦脂醇用量以每升培养液计为0.05g，选择该添加浓度是为了保证所加的有机溶剂二甲基亚砜和白桦脂醇对水相培养液中的菌体细胞无负面影响。

白桦脂醇溶液中的白桦脂醇一般可采用市售商品，白桦脂醇的纯度为80％～95％，优选纯度为90％的白桦脂醇。因为工业化生产中，多以白桦树皮中提取的白桦脂醇为底物制取白桦脂酸，而一般从白桦树皮中提取白桦脂醇并经过初步纯化，可以得到纯度90％左右的白桦脂醇提取物，申请号为200810063260.8的中国申请专利已公开了纯度90％左右的白桦脂醇提取物的制备方法。采用纯度为90％的白桦脂醇作为微生物转化底物对研究白桦脂酸的合成更有现实意义，可以降低生产成本和综合利用资源。

另外，步骤(1)中采用微乳液体系转化法时，在随后加入白桦脂醇溶液时，白桦脂醇溶液中还可以添加无水乙醇和吐温80。由于白桦脂醇不溶于水，底物中添加无水乙醇和吐温80，形成的微乳化体系更有利于白桦脂醇在水相培养液中的分散和溶解，提高微生物细胞和底物接触转化的可能。按体积比：

无水乙醇∶吐温80∶白桦脂醇的二甲基亚砜溶液＝8∶1∶2.25。

本发明方法步骤(3)中的后处理包括：

将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，调节至pH3～4，用乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩得到白桦脂酸，得到的白桦脂酸可以根据需要进一步进行提纯。

调节pH值时可采用通用的酸、碱，如氢氧化钠、盐酸等。

本发明中白桦脂醇、白桦脂酸含量检测方法：取10ml上清液，调节至pH3～4，用等量的乙酸乙酯萃取2～3次，合并有机层(即萃取液)，经旋转蒸发浓缩后，用甲醇定容于10ml容量瓶，用反相高效液相色谱法(RP-HPLC)检测所得物中白桦脂醇、白桦脂酸的含量。

RP-HPLC色谱条件：色谱柱为Diamonsil C 18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相为乙腈/水(体积比)＝91/9；流速1.0ml/min；检测波长210.1nm；柱温25℃；进样量10μl；跑样时间30～45min。

RP-HPLC主要步骤：准确称取2mg白桦脂酸标准品置于100ml容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成0.02mg/ml的标准溶液。依次准确取5ml，1ml上述标准溶液于10mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，与储备液共同形成浓度分别为0.002mg/ml、0.01mg/ml、0.02mg/ml的系列标准溶液。取配制好的白桦脂酸系列标准溶液各1ml，分别于离心管中离心5min，取150μl上清液于洁净干燥的进样瓶中。进样，在色谱检测条件下测定对应的峰面积值(A)，以峰面积值A为纵坐标，白桦脂酸浓度C为横坐标，绘制标准曲线，经统计处理求得白桦脂酸的线性回归方程为：y＝4E+06x+3383.5403(R²＝0.9975)。相同色谱条件下，按照同样方法可得白桦脂醇的线性回归方程为：y＝4E+06x-602.7339(R²＝0.9999)。

本发明方法白桦脂醇转化率高，能有效合成白桦脂酸，与现有的化学合成法或从植物中直接提取白桦脂酸的方法相比，具有微生物细胞培养时间短、操作简便、易于控制，整个生物转化周期较短，转化过程安全可靠，成本低的特点，适于工业化生产；为生物转化合成白桦脂酸的生产和应用提供理论依据和技术前提，同时为解决白桦脂酸工业化生产难题提供新思路。

附图说明

图1为本发明方法的流程示意图。

具体实施方式

实施例1 采用直接生长转化法生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸

(1)向灭菌过的马铃薯葡萄糖液体中接入黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液，于28℃、转速120r/min的摇床中培养3天得到预反应体系；其中马铃薯葡萄糖液体与黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为30，黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1×10⁶个/毫升；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液(其中白桦脂醇浓度为7.5mg/ml)，于28℃、转速120r/min的摇床中转化反应6天得到转化后的培养液，白桦脂醇用量以每升马铃薯葡萄糖液体计为0.05g；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

对比例1～5

将实施例1中的黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液分别用青海黑曲霉ZJU、康氏木霉、黑曲霉、白桦降解菌、米曲霉替代，其余步骤相同，将白桦脂醇转化成白桦脂酸。

对实施例1、对比例1～5中得到的白桦脂酸及对照组(未经微生物转化)中的白桦脂酸进行检测，检测结果见表1：

表1 不同菌株转化能力测定与比较

从表1中可见，黄绿蜜环菌、黑曲霉和米曲霉这三株菌株生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的能力相对较强。

分别对实施例1、对比例3和对比例5中得到的白桦脂酸的检测结果进行进一步验证实验分析，结果见表2：

表2 三种菌株转化能力测定与比较

从表2可看出，本发明采用黄绿蜜环菌生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸，白桦脂酸产率有很大的提高。

实施例2 采用静息细胞转化法生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸

(1)向灭菌过的含葡萄糖的磷酸缓冲液(pH为6，其中葡萄糖的质量百分比浓度为2％)中接入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞，得到预反应体系；其中磷酸缓冲液的毫升数与黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的克数之比为5；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液(其中白桦脂醇的浓度为7.5mg/ml)，于28℃、转速120r/min的摇床中转化反应6天得到转化后的培养液，白桦脂醇用量以每升培养液计为0.05g；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

实施例3 采用微乳液体系转化法生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸

(1)向灭菌过的葡萄糖水溶液(葡萄糖的质量百分比浓度为2％)中接入黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞，得到预反应体系；其中葡萄糖水溶液的毫升数与黄绿蜜环菌ZJUQH湿细胞的克数之比为5；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入含有无水乙醇和吐温80的白桦脂醇溶液(以体积比计，无水乙醇∶吐温80∶白桦脂醇的二甲基亚砜溶液＝8∶1∶2.25，白桦脂醇的二甲基亚砜溶液中白桦脂醇浓度为7.5mg/ml)，于28℃、转速120r/min的摇床中转化反应6天得到转化后的培养液，白桦脂醇用量以每升培养液计为0.05g；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

针对不同转化体系下黄绿蜜环菌ZJUQH生物合成白桦脂酸的效果对比

比较实施例1～3中黄绿蜜环菌ZJUQH生物合成白桦脂酸的能力，结果见表3：

表3不同转化体系下黄绿蜜环菌ZJUQH生物合成白桦脂酸的能力

从表3中可看出，采用直接生长转化法合成白桦脂酸的能力最强，白桦脂酸的产率可达到27.21％，采用静息细胞转化法、微乳液体系转化法合成白桦脂酸的能力相对较弱，但白桦脂酸的产率也可达到10～15％。

实施例4

(1)向灭菌过的马铃薯葡萄糖液体中接入黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液，于25℃、转速120r/min的摇床中培养2天得到预反应体系；其中马铃薯葡萄糖液体与黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为15，黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1×10⁷个/毫升；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液(其中白桦脂醇的浓度为7.5mg/ml)，于25℃、转速120r/min的摇床中转化反应7天得到转化后的培养液，白桦脂醇用量以每升马铃薯葡萄糖液体计为0.1g；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

实施例5

(1)向灭菌过的马铃薯葡萄糖液体中接入黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液，于30℃、转速120r/min的摇床中培养1天得到预反应体系；其中马铃薯葡萄糖液体与黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为6，黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1×10⁸个/毫升；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液(其中白桦脂醇的浓度为7.5mg/ml)，于30℃、转速120r/min的摇床中转化反应5天得到转化后的培养液，白桦脂醇用量以每升马铃薯葡萄糖液体计为0.01g；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

实施例6

(1)向灭菌过的马铃薯葡萄糖液体中接入黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液，于28℃、转速120r/min的摇床中培养3天得到预反应体系；其中马铃薯葡萄糖液体与黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液的体积比为10，黄绿蜜环菌ZJUQH孢子悬浮液中孢子浓度为1×10⁷个/毫升；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液(其中白桦脂醇浓度为7.5mg/ml)，于28℃、转速120r/min的摇床中转化反应6天得到转化后的培养液，白桦脂醇用量以每升马铃薯葡萄糖液体计为0.06g；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸。

分别对实施例4～6中得到的白桦脂酸进行检测，分析结果见表4：

表4 不同转化条件黄绿蜜环菌ZJUQH生物合成白桦脂酸的能力

本发明实施例中采用的菌种均是首先对实验室保藏的20多株菌种(包括细菌、霉菌、酵母)进行生长情况观察后，发现在含有白桦脂醇的基础培养基上，霉菌生长普遍较好，而细菌和酵母几乎不能生长。因此，初步选取的6～8株菌株为：青海黑曲霉ZJU、黑曲霉、康氏木霉、米曲霉、黄绿蜜环菌、白桦降解菌等，再对初步筛选出的6～8株菌株进行微生物转化实验，选出适合的菌种。

Claims

1.一种微生物细胞生物转化白桦脂醇合成白桦脂酸的方法，包括：

(1)向培养液中接入黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc.)ZJUQH CGMCC No.1884，得到预反应体系；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入白桦脂醇溶液，于25～30℃转化反应5～7天得到转化后的培养液；

其中白桦脂醇用量以每升培养液计为0.01～0.1g；

(3)转化后的培养液经后处理得到白桦脂酸；

其中，步骤(1)所述的培养液为马铃薯葡萄糖液体；所述的黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884为黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884孢子悬浮液，培养液与黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884孢子悬浮液的体积比为6～30；接入菌种后于25～30℃培养1～3天得到预反应体系；

或者，步骤(1)所述的培养液为含有葡萄糖的磷酸缓冲液，葡萄糖的质量百分比浓度为2％，该缓冲液的pH为6；所述黄绿蜜环菌ZJUQHCGMCC No.1884为黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884湿细胞，其中培养液的毫升数：黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884湿细胞的克数＝5～6；

或者，步骤(1)所述的培养液为葡萄糖水溶液，葡萄糖的质量百分比浓度为2％，自然pH；所述黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884为黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884湿细胞，其中培养液的毫升数：黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884湿细胞的克数＝5～6。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的转化反应温度优选28℃；所述的转化反应时间优选6天；所述的白桦脂醇溶液为白桦脂醇的二甲基亚砜溶液，白桦脂醇溶液中的白桦脂醇的浓度为7.5mg/ml；白桦脂醇用量以每升培养液计为0.05g。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述黄绿蜜环菌ZJUQHCGMCC No.1884孢子悬浮液中黄绿蜜环菌ZJUQH CGMCC No.1884孢子浓度为1×106个/毫升～1×108个/毫升；接入菌种后于28℃培养3天得到预反应体系。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(2)所述的白桦脂醇溶液中添加有无水乙醇和吐温80，各物质体积比为：

无水乙醇∶吐温80∶白桦脂醇溶液＝8∶1∶2.25。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤(3)中后处理包括：将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，调节至pH3～4，用乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩得到白桦脂酸。