CN102115772B

CN102115772B - 微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法

Info

Publication number: CN102115772B
Application number: CN2010105926022A
Authority: CN
Inventors: 陈启和; 傅明亮; 刘婧; 何国庆; 刘晓杰; 董亚晨; 冯宇
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2010-12-16
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2030-12-16
Also published as: CN102115772A

Abstract

本发明公开了一种微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法，包括：向灭过菌的培养液中接入爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706，得到预反应体系；再加入含有异黄腐酚的底物溶液，于25-30℃转化反应5-7天得到转化后的培养液，其中异黄腐酚用量以每升培养液计为0.01-0.1g；转化后的培养液经后处理得到8-异戊烯基柚皮素。该方法较直接提取法和化学合成法具有操作简单、转化条件温和，效率高、安全性好、成本低、转化过程安全可靠等特点。

Description

微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法

技术领域

本发明涉及生物工程和微生物发酵领域，具体涉及一种微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法。

背景技术

8-异戊烯基柚皮素(8-Prenylnaringenin，简称8PN)是啤酒花中发现的一种具有雌激素作用的异戊烯基黄酮，文献报道8PN是迄今为止发现的最具潜力的植物雌性激素。体内外研究表明8PN具有较强的雌激素作用，在低剂量下就能发挥功效，较已发现的大豆异黄酮、金雀异黄素等植物雌激素的作用都要强，可有效减缓妇女绝经期的各种症状，而且副作用弱，被认为是取代激素代替治疗法(Hormone Replacement Therapy，HRT)的一种新型植物雌性激素。除了雌激素作用外，8-异戊烯基柚皮素还具有预防癌症、防止骨质疏松、抑制血管增生、抗氧化等其他功效。

8-异戊烯基柚皮素在实际生产中来源主要有两类，一类是直接提取法，另一类是化学合成法。酒花是8-异戊烯基柚皮素的主要来源，因此，早期8-异戊烯基柚皮素的制备大多采用从酒花中直接提取的方法获得。然而，8-异戊烯基柚皮素在酒花中的含量极低，据文献报道1kg酒花中仅含10-100mg。用直接提取法原料消耗量大，成本高，所得到的8-异戊烯基柚皮素杂质含量比较高，且不易除去，无法满足商业需要。目前以异黄腐酚或柚皮素为底物，经过化学合成方法制备的8-异戊烯基柚皮素较多地应用于生产实践。化学合成法制备8PN效果较好，但存在操作复杂、污染大、安全性低、需要保护基团、专一性较差等缺点，这限制了其在实际中的应用。

生物转化是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器，以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰的生化反应。微生物作为一个完整个体，其体积虽小，但也具有一套自身特异性的酶体系。同时由于微生物资源丰富，种类繁多，对于特异的底物，可供筛选的菌株很多。以多种不同催化功能的酶系对天然活性成分进行生物转化，可产生新的组合性的天然化合物库，再通过活性筛选，可寻找新的高效低毒的天然活性先导化合物，或通过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系的分析发现关键活性成分。利用微生物转化可以发现新一代的先导化合物，已取得了巨大的社会效益和经济效益。生物转化规律还可以指导新药的结构修饰，获得高效长效的新一代药物，足以说明生物转化对新药开发的重要性。

微生物转化是通过微生物整体细胞或酶将复杂的底物进行结构修饰，也就是利用生物代谢过程中产生的某个或某一系列的酶对底物进行催化反应，是近年来新兴起的获得目标产物的又一途径。微生物转化具有许多优点，譬如，微生物倍增时间短，生物量积累快，产生的酶丰富，转化时间短；微生物的基因工程研究工作成熟，转化酶的高效表达成为可能；微生物发酵工艺成熟，便于工业化生产。随着现代提取、分离、鉴定手段的进步，使微生物技术的应用不再局限于传统酿造及小分子化合物的转化，正广泛地应用于药物前体化合物的转化、生物催化不对称合成、光学活性化合物的拆分、新药开发、药物代谢体外模型预测等领域，已成为生物转化技术中发展最为迅速的分支之一。利用微生物对天然产物进行修饰转化获得产物已成为新药开发较为有力的一种手段。

有关8-异戊烯基柚皮素生物法合成的研究甚少，国外仅有利用植物离体细胞合成8-异戊烯基柚皮素的研究，而未见利用微生物进行的生物合成，国内研究则几乎空白。Yamamoto等在研究苦参黄酮G(SFG)合成路径时发现8-异戊烯基柚皮素是合成SFG过程中的一个中间产物。以柚皮素为底物合成SFG的过程中存在着两步异戊烯基化，第一步反应为柚皮素C8位上的异戊烯基化，生成的产物即为8-异戊烯基柚皮素。Sasaki等对苦参细胞中异戊烯基转移酶基因进行了克隆，并将基因导入到酿酒酵母中，构建获得重组酿酒酵母。利用重组酵母对柚皮素进行转化，发现有8-异戊烯基柚皮素的生成，但得率较低。因此，如果筛选获得合适的菌株就能够实现微生物转化合成8-异戊烯基柚皮素，并建立合适的转化体系和方法，再利用发酵便可以获得大量8-异戊烯基柚皮素，这将为进一步做好8-异戊烯基柚皮素的药理研究和临床实验，以及8-异戊烯基柚皮素的工业化生产奠定良好基础，具有重要的理论价值和经济社会效益。

发明内容

本发明提供了一种微生物细胞转化合成8-异戊烯基柚皮素的方法，利用爪哇正青霉将异黄腐酚经生物转化合成8-异戊烯基柚皮素，该方法具有操作简单、转化条件温和，效率高、安全性好、成本低等特点。

本发明所使用的爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)购买于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，编号为CGMCC NO.3.5706。

一种微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法，包括：

(1)向培养液中接入爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)CGMCC NO.3.5706，得到预反应体系；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入异黄腐酚溶液，于25-30℃，优选28℃，转化反应5-7天，优选6天，得到转化后的培养液；其中，异黄腐酚用量以每升培养液计为0.01-0.1g，优选0.02g；

(3)转化后的培养液经后处理得到8-异戊烯基柚皮素。

本发明方法步骤(1)中，为得到预反应体系可采用直接生长转化法、静息细胞转化法或微乳液体系转化法。

采用直接生长转化法时：

所述的培养液选用低葡萄糖马铃薯液体(即马铃薯培养基)，其原料质量百分比组成为：马铃薯20％，葡萄糖1％，余量为水。

所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706选用爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液；所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液中爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子的浓度优选为10⁶个/毫升-10⁸个/毫升。

所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液是将葡萄糖马铃薯固体培养基上斜面培养的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706菌株刮入无菌水后振摇制得的。

所述的培养液与爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液的体积比为20-40，优选30；接入菌种后于25-30℃，优选28℃，培养0-3天，优选3天，得到预反应体系。

采用静息细胞转化法时：

所述的培养液优选葡萄糖的质量百分比浓度为1％-2％，进一步优选为2％的葡萄糖溶液或pH值为6.0-7.2，进一步优选为7.2的磷酸缓冲液；

所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706选用爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞；

其中培养液的毫升数：爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞的克数＝6-10。

采用微乳液体系转化法时：

所述的培养液选用含有吐温80的磷酸缓冲液溶液，其中吐温80的体积百分比浓度优选为0.2%-0.8%，进一步优选为0.5%，pH值优选为6.0-7.2，进一步优选为7.2；

本发明方法所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞，可通过如下方法制备：

将活化的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706种子接入发酵培养基，优选马铃薯葡萄糖液体培养基，于28℃，120rpm条件下培养3天后停止发酵，通过冷冻离心或者无菌过滤的方法除去发酵液，得到爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞。

本发明方法步骤(2)中的异黄腐酚溶液优选为异黄腐酚的无水乙醇溶液，即该溶液的溶剂为无水乙醇，该溶液中异黄腐酚的浓度并不需要严格的限定。

所述的异黄腐酚用量以每升培养液计优选为0.02g，选择该添加量是为了进一步保证所添加的异黄腐酚对培养液中的菌体细胞生长无负面影响并且保证所加入的异黄腐酚绝大多数能被利用。

本发明方法步骤(3)中的后处理包括：将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，用乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩得到8-异戊烯基柚皮素；得到的8-异戊烯基柚皮素可以根据需要进一步进行提纯。

所述的异黄腐酚可采用市售商品。

本发明方法所采用的异黄腐酚和8-异戊烯基柚皮素同步检测方法已在申请号为201010187676.8的中国发明专利申请中公开。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明方法能有效合成8-异戊烯基柚皮素，8-异戊烯基柚皮素转化率高，与现有的直接提取法或化学合成法相比，具有周期短、操作简便、易于控制、安全可靠、成本低廉、专一性好等特点，为工业化生产8-异戊烯基柚皮素提供了理论依据和技术前提，同时为解决8-异戊烯基柚皮素的工业化生产难题提供了新思路。

具体实施方式

实施例1 采用直接生长转化法生物转化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素

（1）向灭菌过的低葡萄糖马铃薯液体中接入爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液，于28℃，120rpm条件下培养3天得到预反应体系；其中低葡萄糖马铃薯液体与爪哇正青霉CGMCCNO.3.5706孢子悬浮液的体积比为30，爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液中爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子的浓度为10⁶个/毫升；

(2)向步骤(1)得到的预反应体系中加入异黄腐酚的无水乙醇溶液，于28℃，120rpm的摇床中转化反应6天得到转化后的培养液，异黄腐酚用量以每升培养液计为0.02g；

(3)转化后的培养液经后处理：将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，用乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩，得到8-异戊烯基柚皮素。

对比例1-6

将实施例1中的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液分别用黄绿蜜环菌(Armillaria luteo-virens Sacc)、黑曲霉(Aspergillus niger)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis Subvermispora)、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、短刺小克银汉霉(Cunninghamellablakesleana)替代，其余步骤相同，将异黄腐酚转化成8-异戊烯基柚皮素。

对实施例1、对比例1-6中得到的8-异戊烯基柚皮素进行检测，检测结

计算后见表1：

表1 不同菌株转化能力测定与比较

序号	菌种名称	8-异戊烯基柚皮素得率％
			对比例1	黄绿蜜环菌	0.202
对比例2	黑曲霉	0.908
			对比例3	虫拟蜡菌	1.485
对比例4	拉曼被孢霉	-
			对比例5	深黄被孢霉	0.85
对比例6	短刺小克银汉霉	2.407
			实施例1	爪哇正青霉	5.93

注：-表示无8-异戊烯基柚皮素生成。

从表1中可见，虫拟蜡菌、短刺小克银汉霉、爪哇正青霉这三个菌株生物转化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素能力相对较强，而这其中爪哇正青霉的转化能力远远高于其他两株。

实施列2 采用直接生长转化法生物转化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素

(1)向灭菌过的低葡萄糖马铃薯液体中接入爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液得到预反应体系；其中低葡萄糖马铃薯液体与爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液的体积比为30，悬浮液中爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子的浓度为10⁶个/毫升；

实施例3 采用静息细胞转化法生物转化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素

(1)向灭菌过的质量百分比浓度为2％的葡萄糖溶液中接入爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞得到预反应体系；其中葡萄糖溶液的毫升数与爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞的克数比为10；

实施例4 采用静息细胞转化法生物转化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素

(1)向灭菌过的pH为7.2的磷酸缓冲液中接入爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞得到预反应体系；其中磷酸缓冲液的毫升数与爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞的克数比为10；

实施例5 采用微乳体系转化法生物转化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素

(1)向灭菌过的含有吐温80体积百分比浓度为0.5％的吐温80磷酸缓冲液(pH值为7.2)中接入爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞得到预反应体系；其中吐温80磷酸缓冲液的毫升数与爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞的克数比为10；

针对不同转化体系下爪哇正青霉生物合成8-异戊烯基柚皮素的效果对比

比较实施例1-5中爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706生物合成8-异戊烯基柚皮素的能力，结果见表2：

表2不同转化体系下爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706生物合成8-异戊烯基柚皮素的能力

从表2中可看出，采用实施例1中所述的直接生长转化法合成8-异戊烯基柚皮素能力最强，8-异戊烯基柚皮素产率达到5.93％，采用其他转化方式则合成8-异戊烯基柚皮素能力相对较弱。

Claims

1.一种微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法，包括：

（1）向培养液中接入爪哇正青霉(Eupenicillium javanicum)CGMCCNO.3.5706，得到预反应体系；

（2）向步骤（1）得到的预反应体系中加入异黄腐酚溶液，于25-30℃转化反应5-7天得到转化后的培养液；其中，异黄腐酚用量以每升培养液计为0.01-0.1g；

（3）转化后的培养液经后处理得到8-异戊烯基柚皮素；

步骤（1）中，所述的培养液为低葡萄糖马铃薯液体，其中马铃薯的质量百分比浓度为20%，葡萄糖的质量百分比浓度为1%；

所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706为爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液；所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液中爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子的浓度为10⁶个/毫升-10⁸个/毫升；

所述的培养液与爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706孢子悬浮液的体积比为20-40；接入菌种后于25-30℃培养0-3天得到预反应体系；

或者，步骤（1）中，所述的培养液为葡萄糖溶液，其中葡萄糖的质量百分比浓度为1%-2%；

所述的爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706为爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞，其中培养液的毫升数：爪哇正青霉CGMCC NO.3.5706湿细胞的克数=6-10；

或者，步骤（1）中，所述的培养液为pH值为6.0-7.2的磷酸缓冲液；

或者，步骤（1）中，所述的培养液为含有吐温80的磷酸缓冲液溶液，其中吐温80的体积百分比浓度为0.2%-0.8%，pH为6.0-7.2；

步骤（2）中，所述的异黄腐酚溶液为异黄腐酚的无水乙醇溶液。

2.根据权利要求1所述的微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的转化反应条件温度为28℃；所述的转化时间为6天。

3.根据权利要求1所述的微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述的异黄腐酚用量以每升培养液计为0.02g。

4.根据权利要求1所述的微生物细胞催化异黄腐酚合成8-异戊烯基柚皮素的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述后处理包括：将转化后的培养液进行离心处理得到上清液，用乙酸乙酯萃取后得到萃取液，经浓缩得到8-异戊烯基柚皮素。