CN102399827B

CN102399827B - 一种高效制备天然脱落酸的方法

Info

Publication number: CN102399827B
Application number: CN 201110369946
Authority: CN
Inventors: 谭红; 周金燕; 钟娟; 杨杰; 肖亮
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2011-11-18
Filing date: 2011-11-18
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2031-11-18
Also published as: CN102399827A

Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种在发酵过程中流加乙酰辅酶A作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况来制备天然脱落酸的方法。该方法包括下列步骤：将能够产生天然脱落酸的真菌在第一级液体培养基中培养；将培养好的第一级种子液接种于第二级液体培养基上培养；在第三级液体培养基中流加补料，并同时加入吐温-20和流加乙酰辅酶A进行发酵培养；以及从发酵培养液中收集所得的脱落酸。本发明方法可提高菌株对氧的利用效率和产酸率，使菌株以较高的底物转化率和产物合成速率生产脱落酸，提高了产量和生产效率，降低能耗，从而降低生产成本。

Description

一种高效制备天然脱落酸的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种发酵生产制备天然脱落酸(AbscisicAcid，ABA)的新方法。

背景技术

脱落酸(ABA)是目前世界上已发现的五大植物激素之一。天然型的脱落酸由于对农作物的生长发育具有很强的调节活性，能促进果实类、谷类、豆类的成熟发育，能大幅度提高其产量和质量，又能大大增强其耐寒、抗旱和抗盐碱能力，因而具有广阔的应用前景。目前，脱落酸在基础领域的研究已深入到植物细胞与基因工程水平。然而，由于存在于植物体内的天然脱落酸的光学构型仅为(S)-(+)-脱落酸，单纯的(S)-(+)-脱落酸的生产成本极高，售价昂贵，而人工合成的脱落酸是外消旋体，活性远小于天然型的脱落酸。因此，脱落酸应用于农业生产几乎是空谈。

为了解决和满足脱落酸应用于农业生产的需要，近二十年来，国内外(中国、日本等)一直在研究利用微生物发酵法来生产天然脱落酸。例如，已知可用真菌灰葡萄孢(Botrytiscinerea)来生产天然脱落酸，并公开了例如采用纤维素泡沫作载体的液体发酵，发酵产量有所提高，最高的产量达300毫克/升发酵量(参见，例如JP-A-6-247927、JP-A-6-197775、JP-A-6-133786、JP-A-6-7180、JP-A-2-10988、JP-A-2-60590、JP-A-63-296696、JP-A-58-51895)；另外，CN1182798A公开了一种通过真菌发酵生产天然脱落酸的方法，该方法采用三级发酵，在第三级发酵中采用连续流加补料出料以及菌种固定化，并添加关键底物，使产酸量稳定，脱落酸的最高产量达到1.2克/升发酵液。专利ZL00132024.6公开了制备天然脱落酸的方法，该方法是通过采用真菌批次液体培养基流加补料工艺来制备天然脱落酸的方法。专利200710002609.2公开了一种新的制备天然脱落酸方法，该方法通过在发酵过程中流加肌醇解除葡萄糖阻遏的工艺来提高脱落酸的产量。

但现有技术菌种的底物转化率低，合成脱落酸的前体物质供应速率低，脱落酸产量受到局限；且发酵工艺(固体发酵、液体批次发酵和连续流加补料出料工艺、批次液体培养基流加补料工艺等)由于油脂类副产物较多，造成发酵液溶氧不均，导致溶氧利用率较低，能耗较大，成本居高不下。

发明内容

针对现有技术中已知的用微生物发酵生产天然脱落酸工艺中所存在的菌种发酵产量较低，能耗较大，生产成本高等的不足，本发明者进行了深入的研究，寻找更为有效的提高脱落酸产量的方法，以及生产成本更低的改进工艺。研究发现，葡萄糖等碳源氧化后会生成乙酰辅酶A(Acetyl Coenzyme A)进入三羧酸循环，同时，乙酰辅酶A也是真菌生物合成脱落酸的甲羟戊酸(Mevalonic acid，MVA)途径的重要前体，因此，一定程度增加发酵体系中乙酰辅酶A的浓度，有利于脱落酸的合成。

吐温-20(聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯，Tween-20)，分子式与分子量：C58H114O26，1227.5，非离子表面活性剂，对发酵液中某些成份尤其油脂成份，具有乳化、扩散、增溶、稳定等作用，能较好改善发酵液溶氧状况，提高菌体对溶氧的利用率，从而提高脱落酸产量，降低能耗和成本。

本发明人还利用微生物分子遗传学技术，如基因组改组(重排)技术、基因定向诱变技术等，对天然脱落酸产生菌株灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)TB-3-A3(谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株，应用与环境生物学报1998，4(3)：281-285)进行遗传改良，经过大量的菌种选育工作，获得一株能较好利用乙酰辅酶A、天然脱落酸产量提高幅度较大的菌株TBC-20。

本发明人利用葡萄孢霉属(Botrytis)菌株，(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)，尤其是灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)遗传改良菌株TBC-20，发酵生产脱落酸，在发酵工艺中将乙酰辅酶A和吐温-20分别作为前体物质和表面活性剂加入发酵体系，发现能有效提高脱落酸的产量，从而完成了本发明。

本发明的目的是提供一种通过流加乙酰辅酶A(Acetyl Coenzyme A)

作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况，发酵生产脱落酸的方法。

本发明的另一目的是提供一种用于产生天然脱落酸的新菌株。

更具体地说，本发明提供一种发酵制备天然脱落酸的新方法，它包含如下步骤：

将能够产生天然脱落酸的真菌在一级液体培养基(例如，下文所述的培养基A)中培养，制得第一级种子液，所述的真菌选自：葡萄孢霉属(Botrytis)(例如，灰葡萄孢霉Botrytiscinerea)及上述菌株的遗传改良菌等；

将在上述第一级液体培养基中培养好的第一级种子液接种到第二级液体培养基(例如，下文所述的培养基B)中培养，制得第二级种子液；

将在上述第二级液体培养基中培养得到的第二级种子液接种到第三级液体培养基(例如，下文中所述的培养基C)中培养12-72小时后，加入表面活性剂吐温-20以改善发酵液溶氧状况，并开始进行第三级液体培养基流加补料发酵培养，同时流加乙酰辅酶A作为菌株合成脱落酸的前体物质，提高脱落酸的产量。

从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。

本发明的具体实施方案是，采用产生天然脱落酸的葡萄孢霉属菌株或其遗传改良菌，在液体培养基中进行三级发酵培养，在每级发酵阶段选用不同的培养基。在第三级发酵中，以适合于第三级发酵的液体培养基，例如下文中描述的培养基C，作为发酵培养基，23℃-29℃温度下培养12-72小时后，加入生物表面活性剂吐温-20，开始液体培养基流加补料，并同时流加乙酰辅酶A。

第三级液体培养基(例如培养基C)流加补料方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，间歇流加方式是优选的。

乙酰辅酶A流加方式可以采用连续(匀速或非匀速)流加和/或间歇式流加方式，连续(匀速或非匀速)流加方式是优选的。

所述的连续(匀速或非匀速)流加方式，是以0.01-10mg/L·h(匀速或非匀速)将浓度100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A，连续流加入第三级发酵罐，直至停止发酵(下罐)前例如大约50小时。

所述的间歇式流加方式，是以间隔一段时间加一次料的方式，间歇式将100U/mg-500U/mg浓度的乙酰辅酶A，流加入第三级发酵罐。间歇时间优选为每隔2-30小时补料1-5次，更优选为大约间隔5小时补料1次。本领域技术人员也可根据需要，采用其它的适合时间间隔补料流加。

发酵条件：温度23℃-29℃，pH：4-7

发酵时间：8-11天。

采用本发明工艺，通过流加一定浓度的乙酰辅酶A，作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况，提高菌株对氧的利用效率和产酸率，降低能耗，从而降低生产成本。

发酵培养液中的脱落酸用常规方式回收，例如采用有机溶剂萃取法、薄膜过滤法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色或淡黄色结晶脱落酸；按照下述文献中提供的脱落酸立体化学结构鉴定方法，确定为天然脱落酸：谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株，应用与环境生物学报1998，4(3)：281-285。

在优选的具体实施方案中，本发明还采用例如新菌株等技术方案来进一步提高天然落脱酸的产量。

本发明方法可以采用已知的产生天然脱落酸的菌株，例如，已知的、或由微生物遗传工程方法获得的产生天然脱落酸的葡萄孢霉属菌株(例如，灰葡萄孢霉Botrytis cinerea)或其遗传改良菌。在优选的本发明方法中，使用已知的产生脱落酸的高产菌种，例如Botrytiscinerea TB-3-H8、TBI-9(CGMCC No.0500，已在专利ZL00132024.6中公开)、TBC-10(CGMCC No.1889，已在专利200710002609.2中公开)、Ferm P-6156，B.C.FD338等。在最优选的本发明方法中使用新菌株：脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)TBC-20，其已在2011年3月9日保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所(邮编610041)中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.4645，该菌株是将灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)TB-3-A3采用微生物分子遗传学技术，如基因组改组(重排)技术、基因定向诱变技术等，获得的遗传改良菌株。

本发明工艺过程采用三级发酵技术，采用三级发酵来制备脱落酸是已知的(参见，例如，CN1182798A，ZL00132024.6)。根据三级发酵的不同要求，分别选择三种不同的培养基来进行发酵，这些培养基可以是本领域技术人员已知的适合于此目的的培养基或是发明专利ZL00132024.6中公开的培养基。使用发明专利ZL00132024.6中公开培养基是优选的。发明专利ZL00132024.6中公开了培养基A、B、C，其具体组成如下：

培养基A

葡萄糖	0.2％-3％	牛肉膏	0.1％-1％
				麦麸	1％-5％	蔗糖	1％-4％
硝酸铵	0.1％-2％	硫酸镁	0.01％-0.1％
				麦芽糖	0.1％-3％

培养基B

淀粉	1％-5％	麦麸	1％-5％
				葡萄糖	1％-4％	麦芽糖	0.1％-3％
豆饼粉	0.1％-2％	硝酸钠	0.1％-5％

培养基C

成分	一般范围	优选范围	最优选范围
				糊精	1.0％-30.0％	5.0％-20.0％	5.0％-10.0％
麦麸	0.1％-20.0％	0.1％-5.0％	0.3％-2.0％
				乙二醇	0.01％-10.0％	0.01％-5.0％	0.02％-0.5％
甘油	0.1％-20.0％	0.1％-3.0％	0.1％-0.3％
				脂肪酸	0.1％-10.0％	0.1％-5.0％	0.1％-2.0％
葡萄糖	0.1％-25.0％	0.1％-5.0％	0.5％-2.0％
				麦芽糖	0.1％-20.0％	0.1％-7.0％	0.5％-3.0％

蔗糖	0.1％-30.0％	0.5％-30.0％	1.0％-5.0％
				废糖蜜	0.1％-50.0％	0.1％-20.0％	1.0％-10.0％
乳糖	0.1％-50.0％	0.1％-20.0％	0.1％-1.0％
				豆饼粉	0.01％-20.0％	0.01％-2.0％	0.01％-1.0％
硫胺素	0.0001％-5.0％	0.0001％-5.0％	0.0001％-0.5％
				磷酸氢钾	0.001％-10.0％	0.01％-1.0％	0.01％-0.1％
磷酸二氢钾	0.001％-10.0％	0.01％-1.0％	0.01％-0.1％
				硫酸镁	0.01％-2.0％	0.03％-0.2％	0.03％-0.1％
硫酸锰	0.01％-2.0％	0.03％-0.2％	0.03％-0.1％
				硫酸镍	0.001％-2.0％	0.003％-0.2％	0.003％-0.1％

本发明优选实施方案是在已知的发酵工艺过程(发明专利ZL00132024.6中公开)基础上，在第三级发酵培养中流加一定浓度的乙酰辅酶A和添加吐温-20。即：将活化的菌种接种于培养基A中，固体培养或三角瓶内23℃-29℃下摇瓶培养24-76小时后，以10％-50％的接种量接种于已加有灭菌培养基B的种子罐中，在23℃-29℃下发酵培养24-60小时，然后按优选10％-40％的接种量接种于第三级发酵罐中进行发酵生产。第三级发酵以培养基C作为发酵培养基，在24℃-28℃发酵培养12-72小时后，加入一定浓度的吐温-20，并开始培养基C和一定浓度的乙酰辅酶A的流加补料。

乙酰辅酶A流加方式有两种：一种是连续(匀速或非匀速)流加，一种是间歇式流加，前者是优选的。

采用前一种方式时，以0.01-10mg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加乙酰辅酶A(100U/mg-500U/mg)，直至停止发酵(下罐)前约50小时。

采用后一种方式时，则间歇式流加乙酰辅酶A(100U/mg-500U/mg)，间歇时间为每隔2-30小时补料1-5次，优选为间隔5小时补料1次，每次补加量为0.01-50.0mg/L发酵液，优选0.01-10.0mg/L发酵液。

吐温-20添加方式采用一次性加入，在第三级发酵培养24℃-28℃发酵培养12-72小时后，一次性加入，加入量为发酵液体积的0.01％-5.0％，优选为0.05％-0.5％。

采用本发明工艺时，底物流加补料不用出料。在调节(升高或降低)发酵液溶解氧浓度，控制温度、泡沫等手段降低菌的新陈代谢等基础上，通过流加一定浓度的乙酰辅酶A，作为菌株合成脱落酸的前体物质，同时，添加生物表面活性剂吐温-20改善发酵液溶氧状况，提高菌株对氧的利用效率和产酸率，降低能耗，从而降低生产成本。

发酵结束后将发酵液用有机溶剂萃取法、薄膜过滤法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、硅胶柱层析法及活性碳吸附法等提取后，即得白色结晶脱落酸。

发酵条件：温度23℃-29℃，pH4-7

发酵时间：8-11天。本发明的全工艺流程见附图1。

采用现有工艺与本发明工艺生产脱落酸的比较结果见下文表1

*TB-3-H8(灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea))(谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株，应用与环境生物学报1998，4(3)：281-285)，(申请人向国家知识产权局提交了开放证明)。

在最优选的本发明方法中，通过使用产生天然脱落酸的新高产菌株，大幅度提高了脱落酸产量。最优选方法中使用的新菌株灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)TBC-20(CGMCC No.4645)，是通过微生物分子遗传学技术改良后获得的，其基因序列具有如下特征：

1.脱落酸合成基因簇bcaba1，bcaba2，bcaba3，bcaba4，[即bcaba(1-4)]基因序列特征

已知灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)菌株中脱落酸合成基因簇bcaba(1-4)，其中bcaba1和bcaba2为P450单加氧酶编码基因，bcaba3编码未知蛋白，而bcaba4编码蛋白与短链脱氢酶家族蛋白(SDRs)同源；

国际上对Botrytis.cinerea B05.10菌株基因组测序已经完成，(http://www.broad.mit.edu/annotation/genome/)并建立了数据库，其中B05.10菌株脱落酸合成基因簇bcaba(1-4)基因序列已知，基因簇中各基因在B05.10菌株中的排列如图2。

本发明使用的新菌种TBC-20菌株的脱落酸合成基因簇bcaba(1-4)的基因序列(碱基序列)，在一些位点进行了替换或重排。其特征为：

〔一〕TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba(1-4)的基因序列与氨基酸序列比对分析，具有如下特征：

(1).TBC-20菌株与B05.10菌株的bcaba1基因序列存在两个位点(18，271)的差异。其中18位点的差异为无义差异(翻译成氨基酸后没有引起氨基酸的变化)，另一处差异(271)翻译成氨基酸后导致一个氨基酸位点(91)的变化：在B05.10菌株为F(苯丙氨酸)，在TBC-20菌株中为I(异亮氨酸)。

(2).菌株TBC-20与B05.10的bcaba2基因序列存在三或四个位点(196，420，634，991)的碱基差异(634位为G时不是差异位点，634位为A时是差异位点)。其中991位的差异翻译成氨基酸后没有引起氨基酸的变化，196，420两处差异翻译成氨基酸后导致两个位点的差异，即：在B05.10中为终止密码子(66，141)，在TBC-20分别为E(谷氨酸)和S(丝氨酸)。对于634位点，其为G时，翻译成氨基酸不会引起氨基酸序列的变化，其为A时，翻译成氨基酸(212位点)在B05.10中为V(缬氨酸，)，在TBC-20中为I(异亮氨酸)。

(在菌株TBC-20中634位为兼并碱基R(代表G或A)。当R代表G时，其所在密码子为GTC，是V(缬氨酸)的密码子。当R代表A时，其所在密码子为ATC，是I(异亮氨酸)的密码子。)

(3).菌株TBC-20与B05.10的bcaba3基因序列存在13个位点(138，163，192，348，474，482，618，879，942，981，1107，1117，1218)的碱基差异，其中10个位点(138，192，348，474，618，879，942，981，1107，1218)碱基为无义差异(不会引起编码氨基酸的变化)，基因163位点差异翻译成氨基酸后导致55位的氨基酸发生差异，即：TBC-20中为T(苏氨酸)，在B05.10中为A(丙氨酸)。基因482位点差异翻译成氨基酸后导致161位的氨基酸发生差异，即：TBC-20中为V(缬氨酸)在B05.10中为A(丙氨酸)。另一处位点(1117)差异翻译成氨基酸后导致一个位点(373)的氨基酸差异即：TBC-20中为S(丝氨酸)在B05.10中为A(丙氨酸)。

(4).TBC-20与B05.10两株菌的bcaba4基因序列存在六个位点(169，598，826，827，834，841)的差异，三处(598，826，827)的碱基差异没有引起氨基酸序列变化。169位点差异翻译成氨基酸后导致57位的氨基酸发生差异，即：TBC-20中为H(组氨酸)，在B05.10中为Y(酪氨酸)。此外，与B05.10相比，TBC-20菌株834位缺失了一个碱基，导致该位点后读码框发生变化，氨基酸序列也相应发生变化，在TBC-20中为ADGDV(丙氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-缬氨酸)，在B05.10中为RDGRC(精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸-半胱氨酸)。

(5).TBC-20与B05.10两株菌中，基因bcaba1与bcaba3之间的连接部分的基因碱基序列(图3中虚线部分)也存在较大差异，如图3。在TBC-20菌中，连接部分的碱基序列做了缺失处理，余下的基因序列为3349bp，在B05.10菌中该连接部分的基因序列为10530bp(分别编码两个蛋白，Blast比对与两个反转录转座子有较高的相似性)。

〔二〕TBC-20菌株与botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba(1-4)的基因序列与氨基酸序列比对具有如下特征：

(1)两株菌bcaba1基因序列与氨基酸序列比对

基因序列比对如图4。

氨基酸序列比对如图5。

(2)两株菌bcaba2基因序列与氨基酸序列比对

基因序列比对如图6。

氨基酸序列比对如图7。

(3)两株菌bcaba3基因序列与氨基酸序列比对

基因序列比对如图8。

氨基酸序列比对如图9。

(4)两株菌bcaba4基因序列与氨基酸序列比对

基因序列比对如图10。

氨基酸序列比对如图11。

(5)菌株TBC-20与B05.10两株菌基因bcaba1到bcaba3之间连接的基因序列比对结果如图12。

2.TBC-20菌株的萜类合成酶基因特征

脱落酸(ABA)属于倍半萜类化合物，它在真菌灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)菌中的生物合成的关键成环步骤可能由多个萜类环化酶催化，其中萜类环化酶C2(C2为自编号，其对应国际上已经完成测序的Botrytis cinerea B05.10菌株中的同源基因BC1G_10537)是较重要的一个催化酶。本发明人对TBC-20菌的C2酶基因进行了定向改良，在其C2基因序列位点618bp后插入一长度为575bp的片段，是一段反转录转座子。此外，还分别在3个位点(27，140，2853)处插入6bp，2bp，16bp短片段，在301bp位点处进行11bp的短片段缺失，它们都位于非编码区。除此之外，对照国际上已经完成测序的B.cinerea B05.10菌株中对应的同源基因BC1G_10537的基因组注释数据进行分析，TBC-20菌株萜类环化酶基因C2序列与B.cinerea B05.10菌株中BC1G_10537基因除上述片段差异外，还有41处碱基差异(替换)，(有些情况下，测序17位点为T，这时则有42处碱基差异)。

对高产菌TBC-20的萜类环化酶基因C2和B05.10菌中对应的基因BC1G_10537进行了基因序列和氨基酸序列比对分析。具体如下：

基因序列比对分析如图13。

氨基酸序列比对结果如图14。共有4处氨基酸差异，分别为12位V-I，181位E-D，206位I-V，244位G-S。

3.法尼基焦磷酸酯合成酶(FPPS：Farnesyl diphosphate/pyphosphate synthase)的cDNA序列特征

TBC-20菌株的法尼基焦磷酸酯合成酶(FPPS：Farnesyl diphosphate/pyphosphatesynthase)的基因，其cDNA序列为：

1 ATGGCGAAGG CTACCACTCT CAAGGAGTTC GGATCCGTCT TCCCAAAATT GGTTGATGAT

61 TTACTCGCCC ATGCCCAAAA GTACAACCTC CCTCAACAGG GTCAAGATTG GCTCAAGGCT

121 TCCCTAAGTG CCAACACGAT TGGCGGAAAA TGCAATCGTG GAATGTCTGT TCCCGACTCA

181 GTATCTCTCC TCCTCGAAGC TCCACTATCT GAAGAACAAT ACTTCGAATC TGCCACATTA

241 GGATGGATGA CTGAGCTCCT CCAAGCTTTC TTCCTTGTAT CAGACGATAT CATGGACAGC

301 AGCATCACTC GTCGTGGTCA ACCTTGTTGG TACAGACAGC CAGGTGTTGG TATGATCGCT

361 ATCAACGACG CTTTCCTCCT CGAAGCCGCG ATCTACTCTT TATTGAAGAA ATATTTCCGC

421 TCTCACCCTT CCTACCTTGA TCTCATCGAA CTCTTCCACG AAGTTACATA CCAGACAGAA

481 CTTGGTCAAT TGTGCGATTT GTTGACAGCA CCAGAGGACA AGGTCGACTT GGACAACTTT

541 TCTACTACCA AGTATGACTT CATTGTCACA TACAAGACTG CTTATTATTC CTTCTACCTT

601 CCTGTCGCCC TCGCACTTCA CCACCAGAAG ATCGCGACTC CAAAGAATCT TAAGCAAGTC

661 GAAGATATCT TGATTCCGCT TGGCCAATAT TTCCAAATCC AAGATGATTA TCTTGACAAC

721 TTTGGTCTAC CAGAGCACAT TGGCAAGATT GGAACTGATA TCATGGACAA CAAGTGCTCT

781 TGGCTCGTAA ACAAAGCATT GGCTATTGCA ACACCCGAGC AACGTCAAAT ACTCGAGGAG

841 AACTATGGTC ACAAAGACAA GACTAAGGAA GCCGCTGTGA AGAAGCTATT CGATGAGTTA

901 AATCTCAAGC AGATCTACGA GGACTATGAA GAGAAGAGGG TTGGTGAAAT AAGAGAAATG

961 ATTTCACAAG TTGATGAGTC TGAAGGTTTA AAGAAGACTG TGTTTGAGAG CTTCTTGAGC

1021 AAGATTTACA AGAGAAGCAA GTAA

(注：某些情况下，在32位点的碱基G会转变为A)

附图说明

图1为本发明的工艺流程图。

图2为脱落酸合成基因簇bcaba(1-4)中各基因在B05.10菌株中的排列图。

图3为TBC-20与B05.10两株菌中，基因bcaba1与bcaba3之间的连接部分的基因碱基序列图。

图4为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba1基因序列对比图。

图5为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba1氨基酸序列对比图。

图6为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba2基因序列对比图。

图7为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba2氨基酸序列对比图。

图8为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba3基因序列对比图。

图9为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba3氨基酸序列对比图。

图10为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba4基因序列对比图。

图11为TBC-20菌株与Botrytis.cinerea B05.10菌的基因簇bcaba4氨基酸序列对比图。

图12为菌株TBC-20与B05.10两株菌基因bcaba1到bcaba3之间连接的基因序列比对结果图。

图13为TBC-20的萜类环化酶基因C2和B05.10菌中对应的基因BC1G_10537基因序列比对图。

图14为TBC-20的萜类环化酶基因C2和B05.10菌中对应的基因BC1G_10537氨基酸序列比比对图。

具体实施方式

本发明方法采用下文的非限定性实施例作进一步说明。

实施例1

用1000ml三角瓶25个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉TBC-20(CGMCC No.4645)孢子悬液，置于25℃温度下，摇瓶培养24-46小时。将培养好的一级种子液按13％-15％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-28℃温度下通气搅拌培养24-40小时。

用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，26℃-27℃通气搅拌发酵20-40小时后，一次性加入吐温-20，加入量为发酵液体积的0.05％，然后间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔10-15小时补料1次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％；间歇式流加乙酰辅酶A(250U/mg)，间歇时间为每隔12小时补料2次，每次补加量为0.5-3.0mg/L发酵液。

实施过程中所用培养基组合如下：

发酵温度为26℃-27℃，发酵pH 4-7。发酵时间达到10天时下罐。

下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得纯度80％-95％白色或淡黄色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过10天的稳定发酵，杂菌污染率为5.0％，产物产量达4.5克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达85％。

实施例2

用1000ml三角瓶50个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉TBC-20(CGMCC No.4645)孢子悬液，置于23℃-25℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按15％-18％接种量接种于内装100升培养基B的200立升发酵罐中(二级种子罐)，在24℃-26℃温度下通气搅拌培养24-30小时。

用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按20％-25％接种量接种二级罐种子液，在24℃-26℃温度通气搅拌发酵15-24小时后，一次性加入吐温-20，加入量为发酵液体积的0.08％，同时，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔20-28小时补料1-3次，每次补料量为发酵液总体积的0.05％-0.3％。以0.1-1.0mg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加乙酰辅酶A(350U/mg)，直至停止发酵(下罐)前约50小时。

实施过程中所用培养基组合如下：

发酵温度为约24℃-26℃，发酵pH 4-7，发酵时间达到10天时下罐。

下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得纯度80％-90％白色或淡黄色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过10天的稳定发酵，杂菌污染率为5.0％，产物产量达6.0克脱落酸/升发酵液。经薄膜过滤法及重结晶回收，产品回收率达85％。

实施例3

用1000ml三角瓶30个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢TBC-10(CGMCC No.1889)孢子悬液，置于27℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在24℃-27℃温度下通气搅拌培养24-30小时。

用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，在26℃-28℃温度通气搅拌发酵15-24小时后，一次性加入吐温-20，加入量为发酵液体积的0.1％，同时以0.1-5L/h的速度连续流加培养基C，直至停止发酵(下罐)前10小时。以0.1-5.0mg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加乙酰辅酶A(150U/mg)，直至停止发酵(下罐)前约50小时。

实施过程中所用培养基组合如下：

发酵温度为26℃-28℃温度，发酵pH 4-7，发酵时间达到10天时下罐。

下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得纯度75％-85％白色或淡黄色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过10天的稳定发酵，杂菌污染率为8.0％，产物产量达4.0克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达84％。

实施例4

用1000ml三角瓶25个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株TB-3-H8孢子悬液，置于约24℃-26℃温度下，摇瓶培养40-56小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在26℃-27℃温度下通气搅拌培养24-26小时。

用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，在23℃-25℃温度通气搅拌发酵20-48小时后，一次性加入吐温-20，加入量为发酵液体积的0.2％，同时间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔15-28小时补料1-2次，每次补料量为发酵液总体积的0.1％-0.5％。以0.1-3.0mg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加乙酰辅酶A(250U/mg)，直至停止发酵(下罐)前约50小时。

实施过程中所用培养基组合如下：

发酵温度为23℃-25℃，发酵pH 4-7。发酵时间达到10天时下罐。

下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得纯度80％-95％白色或淡黄色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过10天的稳定发酵，杂菌污染率8.0％，产物产量达3.0克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达82％。

对比实施例5

采用连续流加补料出料工艺。

用1000ml三角瓶30个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株TB-3-H8，孢子悬液，置于约26℃温度下，摇瓶培养40-56小时。将培养好的一级种子液按15％-20％接种量接种于内装50升培养基B的100立升发酵罐中(二级种子罐)，在24℃-27℃温度下通气搅拌培养24-26小时。

用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L及微孔陶瓷珠(粒径0.9-160mm3，1.0-5g/L，购自江西景德镇特种陶瓷研究所)，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按10％-15％接种量接种二级罐种子液，在23℃-26℃温度通气搅拌发酵20-48小时后，一次性加入吐温-20，加入量为发酵液体积的0.2％，然后通入氨将pH控制在3-8，降低发酵温度至10℃-25℃，以0.01-5L/h的速度连续流加培养基C，以0.5-1.0mg/L·h的速度连续(匀速或非匀速)流加乙酰辅酶A(500U/mg)。每隔10小时出料一次。发酵温度为约26℃，发酵pH 4-7。

实施过程中所用培养基组合，与对比实施例4相同。

发酵时间达到25天时下罐。

下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得纯度60％-80％白色或淡黄色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过25天的稳定发酵，杂菌污染率为30.0％，产物产量达2.5克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达82％。

实施例6

用1000ml三角瓶50个，每瓶装300ml培养基A于120℃灭菌，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢霉TBC-20(CGMCC No.4645)孢子悬液，置于25℃温度下，摇瓶培养24-33小时。将培养好的一级种子液按15％-18％接种量接种于内装100升培养基B的200立升发酵罐中(二级种子罐)，在24℃-26℃温度下通气搅拌培养24-30小时。

用1吨发酵罐做三级罐发酵，罐内装培养基C约500L，用常规高压热蒸汽灭菌法灭菌后，按20％-25％接种量接种二级罐种子液，在25℃-28℃温度通气搅拌发酵15-24小时后，间歇式流加补料液培养基C，间歇时间为每隔20-28小时补料1-3次，每次补料量为发酵液总体积的0.05％-0.3％。直至停止发酵(下罐)前约10小时。

实施过程中所用培养基组合如下：

发酵温度为25℃-28℃，发酵pH 4-7。发酵时间达到10天时下罐。

下罐发酵液以离子交换树脂法回收产品，并用乙醇洗脱，经重结晶，得纯度70％-85％白色或淡黄色结晶状脱落酸产品。经检测：发酵系统经过10天的稳定发酵，杂菌污染率为5.0％，产物产量达4.0克脱落酸/升发酵液。经离子交换法及重结晶回收，产品回收率达85％。

上述所有实施例中，获得的白色或淡黄色结晶状脱落酸产品，按照下述文献中提供的脱落酸立体化学结构鉴定方法，确定为天然脱落酸。

谭红等，利用原生质体诱变技术筛选脱落酸高产菌株，应用与环境生物学报1998，4(3)：281-285。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院成都生物研究所

<120> 一种高效制备天然脱落酸的方法

<130> 说明书

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1044

<212> DNA

<213> Botrytis cinerea

<400> 1

atggcgaagg ctaccactct caaggagttc ggatccgtct tcccaaaatt ggttgatgat 60

ttactcgccc atgcccaaaa gtacaacctc cctcaacagg gtcaagattg gctcaaggct 120

tccctaagtg ccaacacgat tggcggaaaa tgcaatcgtg gaatgtctgt tcccgactca 180

gtatctctcc tcctcgaagc tccactatct gaagaacaat acttcgaatc tgccacatta 240

ggatggatga ctgagctcct ccaagctttc ttccttgtat cagacgatat catggacagc 300

agcatcactc gtcgtggtca accttgttgg tacagacagc caggtgttgg tatgatcgct 360

atcaacgacg ctttcctcct cgaagccgcg atctactctt tattgaagaa atatttccgc 420

tctcaccctt cctaccttga tctcatcgaa ctcttccacg aagttacata ccagacagaa 480

cttggtcaat tgtgcgattt gttgacagca ccagaggaca aggtcgactt ggacaacttt 540

tctactacca agtatgactt cattgtcaca tacaagactg cttattattc cttctacctt 600

cctgtcgccc tcgcacttca ccaccagaag atcgcgactc caaagaatct taagcaagtc 660

gaagatatct tgattccgct tggccaatat ttccaaatcc aagatgatta tcttgacaac 720

tttggtctac cagagcacat tggcaagatt ggaactgata tcatggacaa caagtgctct 780

tggctcgtaa acaaagcatt ggctattgca acacccgagc aacgtcaaat actcgaggag 840

aactatggtc acaaagacaa gactaaggaa gccgctgtga agaagctatt cgatgagtta 900

aatctcaagc agatctacga ggactatgaa gagaagaggg ttggtgaaat aagagaaatg 960

atttcacaag ttgatgagtc tgaaggttta aagaagactg tgtttgagag cttcttgagc 1020

aagatttaca agagaagcaa gtaa 1044

Claims

1.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)TBC-20,CGMCC No.4645作为发酵菌种。

2.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)TBC-20,CGMCC No.4645作为发酵菌种，在发酵过程中添加乙酰辅酶A。

3.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)TBC-20,CGMCC No.4645作为发酵菌种，在发酵过程中添加吐温-20。

4.一种高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：采用灰葡萄孢霉菌(Botrytis cinerea)TBC-20,CGMCC No.4645，在第一级液体培养基中培养，将在第一级液体培养基中培养好的第一级种子液接种到第二级液体培养基上进行培养；将在上述第二级液体培养基中培养得到的第二级种子液接种到第三级液体培养基中，在24℃-28℃发酵培养12－72小时后，一次性加入发酵液体积的0.01%-5.0%的吐温-20，开始进行第三级液体培养基流加补料，并同时流加乙酰辅酶A发酵培养；从上述发酵培养液中收集所得的脱落酸。

5.根据权利要求4所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：所述的流加乙酰辅酶A流加补料为连续流加和/或间歇式流加方式。

6.根据权利要求5所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：所述的连续流加为匀速或非匀速流加。

7.根据权利要求5所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：所述的连续流加方式是以0.01－10mg/L·h的流加速率将浓度为100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A连续流加入第三级发酵罐，直至停止发酵前50小时。

8.根据权利要求5所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：所述的间歇式流加乙酰辅酶A方式，是每间歇2－30小时补料1－5次浓度为100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A。

9.根据权利要求8所述的高效制备天然脱落酸的方法，其特征是：所述的间歇式流加乙酰辅酶A方式是每间隔5小时补料1次浓度为100U/mg-500U/mg的乙酰辅酶A，每次补加量为0.01－10.0mg/L发酵液。