CN102972444B - 一种用于棉花采摘前促脱叶的生物菌剂的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种棉花采摘前促脱叶的生物菌剂，所述生物菌剂采用3种菌株ACCC30387：灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.ex Fr.、ACCC30384：葡萄孢Botrytis sp.和ACCC36247：禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis vander Hoven，经发酵后与其它辅料混合制得，该生物菌剂可以促进棉花在采摘前叶片脱落，提高机械化作业的效率，解决化学脱叶剂对环境的污染问题。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物菌剂，特别是涉及一种用于棉花采摘前促脱叶的生物菌剂的制备方法。
背景技术
新疆地区棉花在采摘前，需要喷施大量的脱叶剂，但现有的脱叶剂均为化学产品，对环境污染很大，因此新疆农六师农科所领导与科研人员多年来一直在研究和探索一种生物促脱落的技术与产品来解决这个难题。
本发明以3个菌株ACCC30387：灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.ex Fr.、ACCC30384：葡萄孢Botrytis sp.和ACCC36247：禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealisvander Hoven(这3个菌种均购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心)的发酵液为棉花促脱叶的生物菌剂的活性成分，辅以天然载体物质(腐植酸钾)、保护剂(海藻酸钾)和pH值调节剂(柠檬酸、碳酸氢钠)配制成专用于棉花采摘前促进叶片脱落的生物菌剂。
本发明的生物菌剂，产生的次生物质可以促进棉花在采摘前叶片脱落，提高机械化作业的效率，目的是替代目前施用量巨大的化学药剂，而且是进口的产品成本很高，重点解决化学脱叶剂施用后造成的土壤、水源、大气的等环境污染问题，以及人畜的生存安全问题，本发明的生物菌剂为生物制剂，能够满足国家对安全环保的战略要求，以实现经济效益、生态效益、社会效益的高度统一。
发明内容
本发明的生物菌剂是采用如下方法制备的：
步骤一、制备发酵液
(1)制备菌株ACCC30387：的发酵液：液体发酵培养基配方：20％马铃薯汁-1000ml，葡萄糖-20g，KH2PO4-3g，MgSO4·7H2O-1.5g，硫胺素-0.05g，羟烯腺嘌呤-0.3g，烯酰腺嘌呤-0.3g，黄原胶-3g，琼脂-5g，pH值调至6.0；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在28℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子；然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度28℃，通气量开始在1∶1.2v.v.m，培养24小时后增至1∶1.5v.v.m，48小时后降至1∶1v.v.m，发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC30387：灰葡萄孢的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液；
(2)制备菌株ACCC30384：的发酵液：液体发酵培养基配方：蔗糖-30g，MgSO4·7H2O-0.5g，FeSO4·4H2O-0.01g，NaNO3-3g，KCl-0.5g，K2HPO4-1g，黄原胶-3g，琼脂-5g，清水补齐至1000g；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在28℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子；然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度28℃，通气量开始在1∶1v.v.m，培养24小时后增至1∶1.2v.v.m，48小时后继续增至1∶1.5v.v.m。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC30384：葡萄孢的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液；
(3)制备菌株ACCC36247：的发酵液：液体发酵培养基配方：20％马铃薯汁-1000ml，葡萄糖-20g，KH2PO4-3g，MgSO4·7H2O-1.5g，硫胺素-0.05g，羟烯腺嘌呤-0.3g，烯酰腺嘌呤-0.3g，黄原胶-3g，琼脂-5g，pH值调至6.0；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在25℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子；然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度25℃，通气量开始在1∶1v.v.m，培养24小时后增至1∶1.2v.v.m，48小时后继续增至1∶1.5v.v.m。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC36247：禾谷丝核菌的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液。
菌株ACCC30387为灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.ex Fr.；
菌株ACCC30384为葡萄孢Botrytis sp.；
菌株ACCC36247为禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis vander Hoven；
上述3种菌株均购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
步骤二、生物菌剂的制备
将按重量计的菌株ACCC30387的发酵液20％，菌株ACCC30384的发酵液20％，菌株ACCC36247的发酵液20％，腐植酸钾10％，海藻酸钾10％，用少量柠檬酸或碳酸氢钠将pH值调节至6.0，余量用清水补齐后混合搅拌溶解均匀，制得所述生物菌剂。上述百分比均为重量百分比。
本发明的生物菌剂可以促进棉花在采摘前叶片脱落，提高机械化作业的效率，解决化学脱叶剂对环境的污染问题。本发明的生物菌剂应该在棉花采摘前20天开始整株喷施，每隔5-7天施用一次，连续使用3次以上效果显著。
但在实际的生产应用中，本发明的生物菌剂促棉叶脱落的效果比化学药剂略低，所需要喷施的次数比化学药剂多，发挥作用所需要的时间比化学试剂要长，这是本发明与目前大量应用的化学药剂(乙烯利与脱落酸的复配产品)比起来存在的不足之处，仍需要我们科研工作者继续努力研究，开发出促脱落效率更高、施用一次就见效、发挥效果所需时间短的更好的产品。
但是本发明为生物制剂，使用成本低廉，安全环保无污染，在面对国家对环境保护与生活安全的战略要求时，本发明的生物菌剂便成为值得推广和应用的有经济效益、生态效益和社会效益的好产品了。
具体的实施方式：
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实例进行说明，但本发明不局限于这些具体实施例。
实施例1：制备本发明的生物菌剂
所使用的菌株：菌株ACCC30387为灰葡萄孢Botrytis cinerea Pers.ex Fr.；菌株ACCC30384为葡萄孢Botrytis sp.；菌株ACCC36247为禾谷丝核菌Rhizoctoniacerealis vander Hoven；这3种菌株均购自于中国农业微生物菌种保藏管理中心。
首先，制各菌株ACCC30387：的发酵液：液体发酵培养基配方：20％马铃薯汁-1000ml，葡萄糖-20g，KH2PO4-3g，MgSO4·7H2O-1.5g，硫胺素-0.05g，羟烯腺嘌呤-0.3g，烯酰腺嘌呤-0.3g，黄原胶-3g，琼脂-5g，pH值调至6.0；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在28℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子；然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度28℃，通气量开始在1∶1.2v.v.m，培养24小时后增至1∶1.5v.v.m，48小时后降至1∶1v.v.m，发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC30387：灰葡萄孢的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液；
其次，制备菌株ACCC30384：的发酵液：液体发酵培养基配方：蔗糖-30g，MgSO4·7H2O-0.5g，FeSO4·4H2O-0.01g，NaNO3-3g，KCl-0.5g，K2HPO4-1g，黄原胶-3g，琼脂-5g，清水补齐至1000g；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在28℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子；然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度28℃，通气量开始在1∶1v.v.m，培养24小时后增至1∶1.2v.v.m，48小时后继续增至1∶1.5v.v.m。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC30384：葡萄孢的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液。
再次，制备菌株ACCC36247：的发酵液：液体发酵培养基配方：20％马铃薯汁-1000ml，葡萄糖-20g，KH2PO4-3g，MgSO4·7H2O-1.5g，硫胺素-0.05g，羟烯腺嘌呤-0.3g，烯酰腺嘌呤-0.3g，黄原胶-3g，琼脂-5g，pH值调至6.0；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在25℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子；然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度25℃，通气量开始在1∶1v.v.m，培养24小时后增至1∶1.2v.v.m，48小时后继续增至1∶1.5v.v.m。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC36247：禾谷丝核菌的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液；
最后将菌株ACCC30387的发酵液200g，菌株ACCC30384的发酵液200g，以及菌株ACCC36247的发酵液200g，腐植酸钾100g，海藻酸钾100g，用少量柠檬酸或碳酸氢钠将pH值调节至6.0，余量用清水补齐至1000g后混合搅拌溶解均匀，制得本发明所述生物菌剂。
拮抗试验：将菌株ACCC30387、ACCC30384、ACCC36247在PDA培养基上，三点放置相互间距3cm，每个组合重复三次，进行交叉拮抗试验，结果表明三者相互之间不存在拮抗，能够共同生长。
实施例2：测定本发明生物菌剂的生物活性
表1.菌剂ACCC30387、ACCC30384、ACCC36247、本发明生物菌剂的促脱叶效果
从表1.数据可以看出单一菌剂促进脱落的效果明显不如混配在一起的复合菌剂的效果好，说明三种菌剂按一定比例混配在一起可以发挥微生物之间优势互补与协同增效的作用。
在田间将上述制得生物菌剂稀释1000倍后，采用喷施的办法于棉花采摘前20内天连续喷施3次，第一次喷施后，每间隔5-7天喷施一次，可使90％以上的棉叶在20天内迅速衰老脱落。
本发明的一种用于棉花采摘前促脱叶的生物菌剂的制备方法已经通过具体的实施例进行了描述。本领域技术人员可以借鉴本发明的内容适当改变原料、工艺条件等环节来实现相应的其它目的，其相关改变都没有脱离本发明的内容，所有类似的替换和改动对于本领域技术人员来说是显而易见的，都被视为包括在本发明的范围之内。
Claims (2)
1.一种用于棉花采摘前促脱叶的生物菌剂，所述生物菌剂是采用如下方法制得的：
步骤一、制备发酵液
(1)制备菌株ACCC30387的发酵液：液体发酵培养基配方：20％马铃薯汁-1000ml，葡萄糖-20g，KH2PO4-3g，MgSO4·7H2O-1.5g，硫胺素-0.05g，羟烯腺嘌呤-0.3g，烯酰腺嘌呤-0.3g，黄原胶-3g，琼脂-5g，pH值调至6.0；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在28℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子，然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度28℃，通气量开始在1∶1.2v.v.m，培养24小时后增至1∶1.5v.v.m，48小时后降至1∶1v.v.m，发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC30387：灰葡萄孢的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液；
(2)制备菌株ACCC30384的发酵液：液体发酵培养基配方：蔗糖-30g，MgSO4·7H2O-0.5g，FeSO4·4H2O-0.01g，NaNO3-3g，KCl-0.5g，K2HPO4-1g，黄原胶-3g，琼脂-5g，清水补齐至1000g；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在28℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子，然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度28℃，通气量开始在1∶1v.v.m，培养24小时后增至1∶1.2v.v.m，48小时后继续增至1∶1.5v.v.m。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC30384：葡萄孢的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液；
(3)制备菌株ACCC36247的发酵液：液体发酵培养基配方：20％马铃薯汁-1000ml，葡萄糖-20g，KH2PO4-3g，MgSO4·7H2O-1.5g，硫胺素-0.05g，羟烯腺嘌呤-0.3g，烯 酰腺嘌呤-0.3g，黄原胶-3g，琼脂-5g，pH值调至6.0；按上述比例配置好所需发酵培养基的量，然后将菌株于无菌条件下接入液体发酵培养基中，在25℃条件下于摇床上振荡培养72小时后，至有效活菌数均达到2.0×109个／ml制得一级种子，然后将培养好的一级种子按3％的比例，接入装有按上述比例配好的已经灭菌并冷却后的发酵罐中进行发酵生产，发酵培养温度25℃，通气量开始在1∶1v.v.m，培养24小时后增至1∶1.2v.v.m，48小时后继续增至1∶1.5v.v.m。发酵至72小时发酵完毕，经过镜检发酵液中ACCC36247：禾谷丝核菌的菌量达到20-30亿个／ml时为合格菌液。
步骤二、生物菌剂的制备
将按重量计的菌株ACCC30387的发酵液20％，菌株ACCC30384的发酵液20％，菌株ACCC36247的发酵液20％，腐植酸钾10％，海藻酸钾10％，用少量柠檬酸或碳酸氢钠将pH值调节至6.0，余量用清水补齐后混合搅拌溶解均匀，制得所述生物菌剂，所述％均为重量百分比。
2.权利要求1的生物菌剂用于棉花采摘前促脱叶的用途。
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