发明内容
本发明的目的是提供一种作物根系益生菌的微生态菌群。
为了实现以上目的,本发明所采用的技术方案是提供一种作物根系益生菌的微生态菌群,包括以下菌群:领头菌群、平衡菌群、基础菌群、次功能菌群及特殊功能菌群;所述领头菌群为固氮菌25-35质量份;所述平衡菌群包括解磷菌17-23质量份、解钾菌17-23质量份;所述基础菌群包括酵母菌2-7质量份、根瘤菌2-7质量份、光合细菌2-7质量份;所述次功能菌群包括芽孢杆菌2-7质量份、放线菌2-7质量份;所述特殊功能菌群包括白腐菌2-4质量份及假单胞菌1-3质量份。
所述菌种均为抗氯霉素菌种,可在培养基中加入氯霉素进行抗性筛选。
所述的固氮菌为圆褐固氮菌、棕色固氮菌、印度贝氏固氮菌及巴西固氮螺菌按照任意比混合,优选为质量比1:1:1:1。
所述固氮菌的分离方法为:将土壤与无菌水以2:1的质量比混合,搅拌均匀后,取土壤悬液接种在固氮菌分离培养基上,培养3~4d,培养基上生长出4种大小不一,颜色有差别的菌落,分别为圆褐固氮菌、棕色固氮菌、印度贝氏固氮菌及巴西固氮螺菌。
所述固氮菌分离培养基的组分为:甘露醇(或葡萄糖)10g,KH2PO40.2g,MgSO4·7H2O0.2g,NaCl0.2g,CaSO4·2H2O5g,CaCO31000mL,蒸馏水1000mL,pH7.0~7.2,灭菌。
所述的解磷菌为蜡质芽孢杆菌及栗褐芽孢杆菌按照任意比混合,优选为质量比1:1。
所述解磷菌的分离方法为:将梯度浓度稀释的土壤悬液接种于解磷菌分离培养基上,采用稀释平板法对菌种进行筛分,得到2种大小不一的白色菌落,分别为蜡质芽孢杆菌及栗褐芽孢杆菌。
所述解磷菌分离培养基的组分为:每1L蒸馏水中含有葡萄糖10.0g、(NH4)2SO40.5g、NaCl0.3g、KCl0.3g、MgSO4·7H2O0.3g、FeSO4·7H2O0.03g、MnSO4·4H2O0.03g、Ca3(PO4)210g、琼脂18g。
所述的解钾菌为胶质芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌按照任意比混合,优选为质量比1:1。
所述解钾菌的分离方法为:将梯度浓度稀释的土壤悬液接种于解钾菌分离培养基上,并采用稀释平板法对菌种进行筛分,得到2种大小不一的白色菌落,分别为胶质芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌。
所述解钾菌分离培养基的组分为:每100g培养基中含蔗糖1.5g、MgSO4·7H2O0.02g、CaSO4·7H2O0.01g、NaCl0.02g、钾长石粉0.5g、琼脂2.0g、pH7-10。
所述的酵母菌为产朊假丝酵母菌、球拟酵母菌及粘红酵母菌按照任意比混合,优选为质量比1:1:1。
所述酵母菌的分离方法为:将梯度浓度稀释的土壤悬液接种于在麦芽汁培养基上,在25-28℃条件下48h,培养基上生长出2种菌落,分别为产朊假丝酵母菌、球拟酵母菌;将梯度浓度稀释的土壤悬液接种于在孟加拉红培养基上,在25-28℃条件下48h,培养基上生长出1种菌落,为粘红酵母菌。
所述麦芽汁培养基的组分为:每150mL麦芽汁中含有氯霉素0.1g/L、琼脂3g,灭菌20min。
所述孟加拉红培养基的组分为:蛋白胨5.0g/L、葡萄糖10g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO40.5g/L、孟加拉红0.033g/L、氯霉素0.1g/L、琼脂15g/L,灭菌。
所述的根瘤菌为茎瘤固氮根瘤菌、华癸根瘤菌及百脉根根瘤菌按照任意比混合,优选为质量比1:1:1。
所述根瘤菌的分离方法为:选取带根的根瘤,经过清水浸泡、95%乙醇浸泡、HgCl2表面灭菌后,冲洗干净;将根瘤夹破后在YAM培养基上划线,在28℃的条件下培养3~5d,挑取菌体划线培养,分离纯化得到3种白色菌落,分别为茎瘤固氮根瘤菌、华癸根瘤菌及百脉根根瘤菌。
所述YAM培养基的组分为:培养基中含有甘露醇10g/L、酵母粉3g/L、MgSO4·7H2O0.20g/L、NaCl0.10g/L、K2HPO40.25g/L、KH2PO40.25g/L、固体琼脂15~18g/L、pH7.0。
所述的光合细菌为深红红螺菌及沼泽红假单胞菌按照任意比混合,优选为质量比1:1。
所述光合细菌的分离方法为:将梯度浓度稀释的土壤悬液接种于土壤菌悬液富集培养基中,在37℃的条件下培养2d,培养基中生长出红色菌落,挑取菌体接种于深红红螺菌分离培养基中,采用划线法反复分离纯化,得到红色菌落,为深红红螺菌;将梯度浓度稀释的土壤悬液接种于土壤菌悬液富集培养基中培养,培养基中生长出红色菌落,挑取菌体接种于沼泽红假单胞菌分离培养基中,采用划线法反复分离纯化,得到红色菌落,为沼泽红假单胞菌。
所述土壤菌悬液富集培养基的组分为:CH3COONa3.0g、CH3CH2COONa0.3g、NaCl1.0g、(NH4)2SO40.3g、MgSO4·7H2O0.5g、K2HPO40.7g、CaCl20.05g、MnSO40.0025g、FeSO40.005g、氯霉素0.1g,酵母膏0.1g、谷氨酸1.0g,蒸馏水定容至1L,调pH至7.4。
所述深红红螺菌分离培养基的组分为:NH4Cl0.1g、MgCl20.02g、酵母膏0.01g、K2HPO40.05g、NaCl0.2g、氯霉素0.1g、琼脂2g,蒸馏水90mL,灭菌20min;再加入过滤除菌的NaHCO30.5g/5mL、Na2S·9H2O0.1g、乙醇、戊醇或4%丙氨酸5mL、H3PO3调节pH至7.0。
所述沼泽红假单胞菌分离培养基的组分为:CH3COONa3.0g/L,酵母膏3.0g/L,CaCl20.3g/L,MgSO4·7H2O0.5g/L,氯霉素0.1g/L,琼脂20g/L,调pH7.4。
所述的芽孢杆菌为地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌按照任意比混合,优选为质量比1:1:1。
所述芽孢杆菌的分离方法为:将梯度浓度稀释的土壤悬液接种于普通琼脂培养基中培养,采用划线法反复分离纯化,得到3种菌落,分别为地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌。
所述芽孢杆菌普通琼脂培养基:牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,琼脂15~20g,水1000mL,pH7.0~7.2,121℃灭菌20min。
所述的放线菌为诺卡氏放线菌。
所述放线菌的分离方法为:污水液在LB富集培养基中富集培养,采用梯度浓度法稀释菌悬液,并涂布在改良高氏培养基中,得到白色菌落,为诺卡氏放线菌。
所述LB富集培养基的组分为:胰蛋白胨(Tryptone)10g/L、酵母提取物(Yeastextract)5gL氯化钠(NaCl)10g/L、pH7.4,灭菌20min。
所述改良高氏培养基的组分为:可溶性淀粉2g、KNO30.1g、K2HPO40.05g、MgSO4·7H2O0.05g、NaCl0.05g、FeSO4·7H2O0.001g、氯霉素0.1g/L、琼脂2g、自来水100mL,pH7.2~7.4,灭菌20min。
所述的白腐菌为黄孢原毛平革菌及胶质射脉菌按照任意比混合,优选为质量比1:1。
所述假单胞菌为荧光假单胞菌。
所述的荧光假单胞菌的分离方法为:将土壤与无菌水以2:1的质量比混合,搅拌均匀后,取土壤悬液浓度梯度稀释后,分别接种在KMB培养基上,在KMB培养基上37℃培养,24h后可形成1.2mm菌落,菌落可产生橙色色素,圆形,表面凸起,光滑,较粘稠,易挑起,边缘整齐。
所述KMB培养基的组分为:蛋白胨20g,无水氯化镁1.4g,无水硫酸钾10g,琼脂15g,甘油10ml,蒸馏水1L,灭菌20min。
本发明作物根系益生菌的微生态菌群的构建,包括以下步骤:
1、菌种的分离:
a)分别配制固氮菌、解磷菌、解钾菌、酵母菌、根瘤菌、光合细菌、芽孢杆菌、放线菌、假单胞菌的分离培养基,并在培养基中加入氯霉素0.1g/L;
b)采用浓度梯度法对菌悬液进行培养,分离纯化筛选出具有所需功能的菌种;
c)将具备所需功能的菌种进行氯霉素梯度浓度抗性筛选驯化,进一步确定筛选具有氯霉素抗性的菌种;
d)将筛选出的具有氯霉素抗性的菌种进行测序,确定其种属,如下:
固氮菌4株,分别为圆褐固氮菌、棕色固氮菌、印度贝氏固氮菌及巴西固氮螺菌;
解磷菌2株,分别为蜡质芽孢杆菌及栗褐芽孢杆菌;
解钾菌2株,分别为胶质芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌;
酵母菌3株,分别为产朊假丝酵母菌、球拟酵母菌及粘红酵母菌;
根瘤菌3株,分别为茎瘤固氮根瘤菌、华癸根瘤菌及百脉根根瘤菌;
光合细菌2株,分别为沼泽红假单胞菌及深红红螺菌;
芽孢杆菌3株,分别为地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌;
放线菌为诺卡氏放线菌;
假单胞菌为荧光假单胞菌。
白腐菌为黄孢原毛平革菌及胶质射脉菌,购自中国农业微生物菌种保藏中心。
2、菌种的培养:
发酵培养基的制备:蛋白胨10g/L,大豆粉1g/L,红糖10g/L,氯霉素10g/L,氯化钠10g/L。
各菌种均从斜面挑接一至二环菌苔,同一菌种多菌株均接一至二环接种于发酵培养基中培养,培养条件如下:
固氮菌在28-30℃,200r/min条件下,培养2d;
解磷菌在35-37℃条件下,静置培养2d;
解钾菌在35-37℃条件下,静置培养2d;
酵母菌在28-30℃,200r/min条件下,培养2d;
根瘤菌在28-30℃,200r/min条件下,培养3-5d;
放线菌在28-30℃,200r/min条件下,培养5-7d;
芽孢杆菌在30-37℃,180-200r/min条件下,培养18-24h;
光合细菌在28-30℃,200r/min条件下,培养2d;
白腐菌在28-30℃,200r/min条件下,培养2d;
假单胞菌在28-30℃,200r/min条件下,培养2d。
3、菌种的发酵:
将固氮菌、解磷菌、解钾菌按比例加入发酵培养基中发酵,调节培养基pH值至7.8,待固氮菌生长达到对数期时(OD600=1.8)再加入红糖,使pH值降至5.0,发酵时间总长72h,整个发酵过程发酵的温度始终维持在25-40℃,pH5.0-7.8;继续加入比例量的光合细菌、酵母菌及放线菌,在200r/min条件下培养,每4h搅拌1.5-2h,间歇搅拌3d;然后加入比例量的芽孢杆菌、根瘤菌、白腐菌及假单胞菌,搅拌发酵24-36h后,静置培养10-15d,发酵温度25-40℃,菌种总接种量为3%。
本发明的目的还在于提供一种作物根系益生菌的微生态菌群在用于制备微生物有机肥方面的应用。
本发明所采用的技术方案还在于提供一种作物根系益生菌的微生态菌群在用于制备微生物有机肥方面的应用。
本发明以农业部公布的植物益生菌为基础,构建了23株包含八大功能微生物的菌群,包括领头菌群(固氮菌)、平衡菌群(解磷、解钾菌)、基础菌群(产油等给养菌)、次功能菌群(腐熟菌、产维生素B菌、潮霉素菌)以及特殊功能菌群(解毒重金属菌)等,如图1所示。
本发明的微生态菌群中的菌株无相互抑制作用,如图2所示,可达到菌株间共生促生的状态。本发明的微生态菌群中的各菌种都有其各自的功能:
固氮菌能有效固氮,为植物提供氮源。
解磷菌、解钾菌分别具有解磷、解钾的作用。
酵母菌、根瘤菌及光合细菌能提供植物营养基质。另外,光合细菌还能够明显促进放线菌、固氮菌的生长,从而进一步增加土壤肥力,光合细菌本身含60%以上的蛋白质、多种维生素,特别是维生素B、叶酸、生物素、辅酪Q,抗病毒物质及多种生理活性物质。酵母菌在EM中可以提供促进其它有效微生物增殖所需要的基质,为微生物生长提供重要的给养保障。
芽孢杆菌能够提供植物生长所需的激素。
放线菌能够产生抗生素对抗病虫害。
白腐菌具有解毒重金属的功能。
荧光假单胞菌可以降解人工合成的化合物,如塑料,同时具有解毒重金属的功能。
本发明微生态菌群具有以下优点:
1、菌种稳定性好,功能微生物可有效定植于土壤中;
2、微生态菌群能够显著提高作物的产量和品质;
3、微生态菌群中的微生物在土壤中繁殖后,分泌大量的几丁质酶、胞外酶和抗生素等物质,可以有效裂解有害真菌的孢子壁、线虫卵壁和抑制有害菌的生长,有效控制土传性病虫害的发生,起到防病防虫的作用;
4、微生态菌群中包括白腐菌及假单胞菌,一方面可通过带电荷的细胞表面吸附重金属离子或通过摄取必要的营养元素主动吸收重金属离子,将重金属离子富集在细胞表面或内部;另一方面微生物对重金属离子的氧化还原作用能降低重金属的毒性,能够有效降解土壤中重金属的含量,降低并修复被重金属污染的土壤。
另外,本发明的微生态菌群中菌种具有氯霉素抗性,可在氯霉素环境下大规模生长。
实施例3
本实施例的作物根系益生菌的微生态菌群,包括以下质量份的菌种:固氮菌35份、解磷菌17份、解钾菌23份、酵母菌2份、根瘤菌7份、光合细菌7份、芽孢杆菌2份、放线菌2份、白腐菌2份、假单胞菌3份。
其中,固氮菌为质量比6:4:1:3的圆褐固氮菌、棕色固氮菌、印度贝氏固氮菌及巴西固氮螺菌;
解磷菌为质量比2:3的蜡质芽孢杆菌及栗褐芽孢杆菌;
解钾菌为质量比2:1的胶质芽孢杆菌及巨大芽孢杆菌;
酵母菌为质量比5:4:6的产朊假丝酵母菌、球拟酵母菌及粘红酵母菌;
根瘤菌为质量比1:3:1的茎瘤固氮根瘤菌、华癸根瘤菌及百脉根根瘤菌;
光合细菌为质量比3:2的沼泽红假单胞菌及深红红螺菌;
芽孢杆菌为质量比2:3:1的地衣芽孢杆菌、侧孢芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌;
放线菌为诺卡氏放线菌;
白腐菌为质量比2:3的黄孢原毛平革菌及胶质射脉菌;
假单胞菌为荧光假单胞菌。
实验例1、本发明的微生态菌群的功能微生物在土壤中的定植情况:
在大田中施用实施例1的产品(总菌数2.5×109/亩),在对照大田中同标准施用喜星微生物菌肥。施肥后1个月,2个月,3个月,4个月,5个月,6个月分别取土壤样品进行活菌数测定,有效活菌数的测定采用平板计数法,根据所测微生物的种类选用适宜的培养基。结果如图3、4、5所示。
图3、4、5结果表明,施用实施例1产品的土壤,其含有的植物益生菌其总菌数和单菌数均远远高于喜星微生物菌肥,并且稳定性也远远大于该微生物菌肥。本发明的植物益生菌数不仅高于国家标准,并且可以更好的定植于土壤中。
实验例2、本发明的微生态菌群的功能微生物改良土壤的情况:
在大田施用实施例1的产品前后,分别对大田的土壤进行采样,采样点采取随机分布的原则,分别进行各项数据的测定,结果如图6所示。
图6结果表明,施用实施例1的产品后土壤中的重金属含量明显下降,说明施用本发明的微生态菌群可以改善土壤的污染状况。
实验例3、本发明的微生态菌群提高作物产量和品质的情况:
表1为实施例1的产品对不同地区小麦增产效果分析。
表1实施例1产品对不同地区小麦增产效果分析
从表1中可以看出,施用实施例1产品的小麦增产效果明显。
表2为实施例1的产品对油菜增产效果分析。
表2实施例1产品对油菜增产效果分析
从表2中可以看出,施用实施例1产品的油菜增产效果明显。
表3为实施例1的产品对不同果品品质的影响分析。
表3实施例1产品对不同果品品质的影响分析
从表3中可以看出,施用实施例1产品的果品品质有显著提高。
实验例4、本发明的微生态菌群抗病虫害效果分析
本发明的微生态菌群抗病虫害效果分析,如图7、8、9、10、11所示。从图7、8、9、10、11可以看出,施用实施例1产品具有明显的抗病虫害作用。
本发明的产品用于微生物肥料的制备:
能够提供微生物生长的碳源、氮源及无机盐等这些营养元素的物质,都可与本发明的产品混合,制备成各种微生态肥料。