CN111285762A

CN111285762A - 一种脱落酸二醇的分离纯化方法

Info

Publication number: CN111285762A
Application number: CN202010116030.4A
Authority: CN
Inventors: 周金燕; 杨杰; 钟娟; 谭红
Original assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Current assignee: Chengdu Institute of Biology of CAS
Priority date: 2020-02-25
Filing date: 2020-02-25
Publication date: 2020-06-16

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种脱落酸二醇的分离纯化方法。具体技术方案为：将经过微生物发酵后含有脱落酸二醇的发酵液经过离心或者微滤除去菌体等固形物后，发酵清液上大孔吸附树脂柱，进行吸附、解析，收集解析液，减压浓缩得脱落酸二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到脱落酸二醇结晶产物。本发明提供了一种新的从微生物次生代谢产物中分离纯化脱落酸二醇的方法，而且，操作简单、耗时短，易于产业化放大，得到的脱落酸二醇产物的纯度可以达到98％以上。

Description

一种脱落酸二醇的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种脱落酸二醇的分离纯化方法。

背景技术

脱落酸二醇是一种具有调节植物生长活性、与脱落酸结构相似的结构类似物。

脱落酸是一种广泛存在于植物体内调节植物生长的物质，是由三个异戊二烯单位组成的倍半萜酸，化学名为5-(1’-羟基-2’,6’,6’-三甲基-4’-氧代-2’-环己烯-1’-基)-3-甲基-2-顺-4-反-戊二烯酸，结构式如下：

脱落酸应用于农作物的抗逆增产增值栽培，可以激活作物的免疫抗病能力，显著提高作物抗旱、抗寒、抗涝、抗盐碱等抗逆能力，增强植物损伤修复能力，降低病害发生率，减少化学农药用量，大幅度降低灾害损失，促进作物生长，改善品质。

近十年来，在全球发展绿色生态农业的呼声越来越高，对绿色农业生产资料的需求越来越大的环境下，脱落酸的应用技术研究得到快速发展。

但是，脱落酸对紫外光敏感，属强光分解化合物。研究表明，在阳光波长照射下的结果是脱落酸快速的发生异构化，形成反式结构的脱落酸，脱落酸反式异构体较天然顺式脱落酸的植物活性丧失许多。因此，国内外研究者一直在研究寻找具有高活性、性质稳定的脱落酸类似物。

截止目前为止，人们采用多种方法进行全合成，得到了多种脱落酸类似物。但是，由于合成路线长、总收率低，因而价格昂贵，未能应用于农业生产，因此寻找一种简便、同时具有高活性的脱落酸类似物的合成方法，具有重大的现实意义与广阔的应用前景。由于微生物种类繁多,次生代谢产物多样化，因此，从微生物次生代谢产物中发掘脱落酸类似物是一条重要的途径。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种脱落酸二醇的分离纯化方法，使得到的脱落酸二醇产物的纯度可以达到98％以上。

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

本发明公开了一种脱落酸二醇的分离纯化方法，将含有脱落酸二醇的发酵液除去固形物后，将发酵清液进行吸附、解析，收集解析液，减压浓缩得脱落酸二醇粗品；再经硅胶柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到脱落酸二醇结晶产物。

脱落酸二醇的结构式为：

优选的，包括以下步骤：

(1)将经过微生物发酵后的含有脱落酸二醇的发酵液经过滤后，得到发酵清液；

(2)将得到的发酵清液用大孔吸附树脂吸附，然后用低级醇进行解析，得到解析液，并经减压浓缩得到浸膏；

(3)将所述浸膏经吸附柱层析，得到的洗脱液经减压浓缩后，进行结晶、重结晶和干燥得到脱落酸二醇结晶产物。

优选的，步骤(1)中，将发酵液用氢氧化钠调节pH值至2～6。

优选的，步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为S-8、DA-201、D-101、X-5、DM-130、DM301中的任意一种。

优选的，步骤(2)中，所述低级醇为甲醇或乙醇，所述低级醇的体积浓度为20～100％。

优选的，所述低级醇的体积浓度为80～100％。

优选的，步骤(3)中，利用吸附柱层析对浸膏进行多次分离，以硅胶为固定相，以20～50％石油醚/乙酸乙酯为流动相进行洗脱，将得到的洗脱液进行合并。

优选的，步骤(3)中，在减压浓缩后的洗脱液中加入结晶溶剂，进行结晶、重结晶。

优选的，所述结晶溶剂为乙醇或甲醇。

优选的，所述微生物为葡萄孢霉属或尾孢霉属。

本发明具备以下有益效果：

本发明提供了一种新的从微生物次生代谢产物中分离提取脱落酸二醇的方法，操作简单、耗时短，易于产业化放大；且分离纯化后的脱落酸二醇产品的纯度可以达到98％以上。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施举例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本发明公开的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，是通过从微生物发酵液中富集、分离和纯化脱落酸二醇的过程，具体包括以下步骤：

(1)利用能产生脱落酸二醇的微生物(如葡萄孢霉属、尾孢霉属等)，经过液体发酵得到含有脱落酸二醇的发酵液；当然，产生脱落酸二醇的微生物并不仅限于上述两类。

(2)用氢氧化钠调节发酵液的pH值至2～6，然后将发酵液经离心或微滤去除培养基固定物和菌体，得到发酵清液；

(3)将步骤(2)得到的发酵清液用大孔吸附树脂吸附富集其中的脱落酸二醇，大孔吸附树脂S-8、DA-201、D-101、X-5、DM-130、DM301中的任意一种，优选为D-101；然后利用碳链较短的低级醇，如乙醇或甲醇，其体积浓度为20％～100％，优选为80～100％，进行解析，得到解析液，用HPLC(高效液相色谱)测定解析液，然后将解析液进行减压浓缩后得到浸膏后备用；

(4)利用吸附柱层析，对步骤(3)所得到的浸膏进行多次分离，以硅胶为固定相，20％～50％石油醚/乙酸乙酯为流动相进行洗脱，用HPLC测定柱层析洗脱液，合并目标物脱落酸二醇部分；

(5)将步骤(4)中合并的硅胶柱层析洗脱液，经过减压浓缩后，以乙醇或甲醇为结晶溶剂，对洗脱液进行结晶、重结晶，最后干燥得到纯度为98％以上的脱落酸二醇结晶产物。

实施例1大孔吸附树脂的筛选

发酵液的预处理：在含有脱落酸二醇的发酵液中，加入3N硫酸溶液调节发酵液的pH值至2～6，进行酸化处理60min。在室温下离心，去除培养基固形物和菌体，收集上清液。

树脂的预处理：将型号为X-5、D-101、DM-130、DM301、DA-201和S-8的树脂分别放入提取器内，加入95％乙醇浸泡3～4h，然后放净浸泡液，为一次提取过程；用同样的方法反复浸泡，至取出口浸泡液加3倍量水不显浑浊为止，然后用清水充分淋洗至无明显乙醇气味。

称取上述经预处理过的6种湿树脂各2g，分别置于50mL磨口三角锥形瓶中，加入发酵液经预处理后的上清液20mL，于室温25℃下振荡(120r/min)24h至吸附平衡(吸附平衡是指高压液相色谱仪测定溶液中脱落酸二醇的含量，随着时间的延长，基本没有变化)，利用高压液相色谱仪测定溶液中脱落酸二醇的含量，计算静态条件下树脂的吸附率，结果见下表1所示。

静态吸附率X₁按下式计算：

式中：

A₁—标样溶液中脱落酸二醇峰面积的平均值；

A₂—试样溶液中脱落酸二醇峰面积的平均值；

C₁—脱落酸二醇标样的百分浓度(％)；

C₂—试样的百分浓度(％)；

表1不同型号大孔吸附树脂对脱落酸二醇的吸附率

大孔吸附树脂型号	极性	吸附率(％)
			X-5	非极性	93.2
D-101	非极性	96.8
			DM-130	弱极性	92.1
DM301	中极性	88.7
			DA-201	极性	85.2
S-8	强极性	82.1

由表1可知，吸附树脂的极性对吸附富集脱落酸二醇的影响比较大，树脂的极性越小，吸附效果越好。结果表明，D-101树脂很适合从发酵液中富集提取脱落酸二醇，因此，优选D-101树脂为吸附富集用树脂。

实施例2解析剂的筛选

发酵液的预处理：在含有脱落酸二醇的发酵液中，加入3N硫酸溶液调节发酵液的pH值至2～6，进行酸化处理60min。在室温下，用微滤膜过滤去除培养基固形物和菌体，收集过滤液。

大孔吸附树脂采用D-101树脂，按实施例1方法对D-101树脂进行预处理后，平均分装6根层析柱。

经过预处理后的发酵液上大孔吸附树脂柱，发酵液以2BV/h的流速分别上柱，5～10个柱体积后停止加发酵液。

用水以2BV/h的流速淋洗2～3个柱体积后，分别用20％、40％、60％、80％、95％乙醇和无水乙醇作为解吸剂，以2BV/h的流速解吸，利用高压液相色谱仪测定解吸液中脱落酸二醇的含量，计算解析率，结果见下表2所示。

表2不同乙醇浓度对脱落酸二醇的洗脱率

乙醇浓度(％)	解析剂体积	解析率(％)
			20	2BV	33.5
40	2BV	57.8
			60	2BV	79.9
80	2BV	90.8
			95	2BV	95.4
100	2BV	96.2

注：BV为柱体积。

表2结果说明，在所用解吸剂体积相同的条件下，不同乙醇浓度对解析树脂上吸附的脱落酸二醇影响较大，随着乙醇浓度的增大，脱落酸二醇的解析率越高。综合考虑解析率和成本，采用95％的乙醇作为解析剂较佳。

实施例3硅胶柱层析流动相比例的筛选

发酵液的预处理：含有脱落酸二醇的发酵液，加入3N硫酸溶液调节发酵液的pH值至2～6，进行酸化处理60min。在室温下离心，去除培养基固形物和菌体，收集上清液。

大孔吸附树脂采用D-101树脂，按实施例1方法对D-101树脂进行预处理后，平均分装5根层析柱。

经过离心后的发酵清液分别上5根大孔吸附树脂柱，发酵清液以2BV/h的流速上样，5～10个柱体积后停止加发酵液。

用水以2BV/h的流速淋洗2～3个柱体积后，用95％乙醇作为解吸剂以2BV/h的流速洗脱，用HPLC测定解吸液，合并目标物脱落酸二醇部分，减压浓缩得到浸膏。

以硅胶为固定相，利用硅胶柱层析对5份浸膏进行分离，分别以10％石油醚/乙酸乙酯、20％石油醚/乙酸乙酯、30％石油醚/乙酸乙酯、40％石油醚/乙酸乙酯、50％石油醚/乙酸乙酯为流动相进行洗脱，用HPLC测定洗脱液中脱落酸二醇的含量，合并目标物脱落酸二醇部分，计算洗脱率，结果见下表3所示。

表3不同洗脱剂洗脱脱落酸二醇的效果

石油醚/乙酸乙酯(％)	洗脱剂体积	洗脱率(％)
			50	2BV	15.6
40	2BV	60.8
			30	2BV	81.3
20	2BV	82.5
			10	2BV	83.2

注：BV为柱体积。

表3结果表明，随着洗脱剂的极性增加，脱落酸二醇的洗脱效果越好，考虑到洗脱剂中乙酸乙酯的比例越大，其极性越大，带入的杂质会更多，因此，采用30％石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂较好。

实施例4

发酵液的预处理：取含有脱落酸二醇的发酵液，加入3N硫酸溶液调节发酵液的pH值至2～6，进行酸化处理60min。在室温下离心，去除培养基固形物和菌体，收集上清液。

大孔吸附树脂采用D-101树脂，按实施例1方法对D-101树脂进行预处理后，装柱。上预处理后的发酵清液吸附，发酵清液以2BV/h的流速上样，5～10个柱体积后停止加发酵清液。

用水以2BV/h的流速淋洗2～3个柱体积后，再用95％乙醇作为解吸剂以2BV/h的流速吸剂，用HPLC测定吸剂液，合并目标物脱落酸二醇部分，减压浓缩得到浸膏。

以硅胶为固定相，利用硅胶柱层析对浸膏进行分离，以30％石油醚/乙酸乙酯为流动相进行洗脱，用HPLC测定柱层析洗脱液中的脱落酸二醇含量，合并目标物脱落酸二醇部分。

洗脱液经过减压浓缩后，分别以乙醇或甲醇作为结晶溶剂，进行结晶、重结晶、干燥，两种结晶方法都得到纯度为98％以上的脱落酸二醇结晶产物。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：将含有脱落酸二醇的发酵液除去固形物后，将发酵清液进行吸附、解析，收集解析液，减压浓缩得脱落酸二醇粗品；再经吸附柱层析分离，以及结晶、重结晶纯化，得到脱落酸二醇结晶产物。

2.根据权利要求1所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：包括以下步骤：

(2)将得到的发酵清液用大孔吸附树脂吸附，然后用解析剂进行解析，得到解析液，并经减压浓缩得到浸膏；

3.根据权利要求2所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：步骤(1)中，将发酵液用氢氧化钠调节pH值至2～6。

4.根据权利要求2所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述大孔吸附树脂为S-8、DA-201、D-101、X-5、DM-130、DM301中的任意一种。

5.根据权利要求2所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：步骤(2)中，所述解析剂为低级醇，所述低级醇为甲醇或乙醇，所述低级醇的体积浓度为20～100％。

6.根据权利要求5所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：所述低级醇的体积浓度为80～100％。

7.根据权利要求1所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，利用吸附柱层析对浸膏进行多次分离，以硅胶为固定相，以20～50％石油醚/乙酸乙酯为流动相进行洗脱，将得到的洗脱液进行合并。

8.根据权利要求7所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：步骤(3)中，在减压浓缩后的洗脱液中加入结晶溶剂，进行结晶、重结晶。

9.根据权利要求8所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：所述结晶溶剂为乙醇或甲醇。

10.根据权利要求1所述的一种脱落酸二醇的分离纯化方法，其特征在于：所述微生物为葡萄孢霉属或尾孢霉属。