CN110590883B - 采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：发酵液预处理、选用大孔吸附树脂对上清液进行初步提取、采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理、用阳离子交换树脂进行进一步精致、减压脱溶，萃取，调节pH值，旋转蒸馏，结晶；上清液中还加入0.5‑5%盐类和5‑50%水，本发明的有益效果是：采用大孔吸附树脂、阴离子交换树脂和阳离子交换树脂相结合的处理方法，对多杀菌素发酵液进行粗提，脱色和精提；多杀菌素发酵液预处理时，加入了0.5%‑5%盐和5‑50%水以至于使浸提液能够被树脂直接吸附，传统工艺需要加入三倍以上体积的水，减少了水污染。

Description

采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法

技术领域：

本发明属于生物活性成分提取技术领域，更具体地涉及一种采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法。

背景技术：

多杀菌素又名多杀霉素，是在刺糖多胞菌发酵液中提取的一种大环内酯类无公害高效生物杀虫剂。产生多杀菌素的亲本菌株土壤放线菌多刺糖多孢菌最初分离自加勒比的一个废弃的酿酒场。是由土壤放线菌多刺甘蔗多孢菌在培养介质下经有氧发酵后产生的次级代谢产物。主要有效成分为多杀菌素A和D，分别占所有组分的85-90％和10-15％。多杀菌素作为一种新型的微生物源杀虫剂，具有毒力高、杀虫谱广、作用方式独特、残留低、环境友好、对人畜无害等特性，所以其被认为应用前景十分广阔的绿色生物农药。

虽然，他是一种环保的生物农药，但是，目前，制约多杀菌素实现产业化和广泛应用的主要问题在于生产成本高，发酵工艺复杂，发酵效能低，提取工艺不完善，产品纯度低等问题。

近几年，关于多杀菌素分离纯化工艺也有不少报道，主要集中在吸附法和溶媒萃取法。首先，国际上有些报道，美国陶氏益农的Baker P J等[US5227295， 1993-07-13]以HP-20ss吸附树脂为吸附剂，以0％～95％甲醇：乙腈＝1：1(含 0.1％乙酸钠)溶液梯度洗脱多杀菌素A和D组分，利用HPLC进行跟踪检测，并分段收集洗脱液，将多杀菌素洗脱液浓缩后将其用石油醚稀释，稀释液上硅胶层析柱，用石油醚和甲醇梯度洗脱，利用HPLC跟踪检测，分段收集洗脱液，分别得到多杀菌素A和D的洗脱液；其次，国内这几年也有不少的报道，王琨等用DM11树脂在pH为9.5时吸附多杀菌素，并用丙酮解吸，回收率高达85.8％。夏立秋等利用萃取与反萃取相结合的技术路线进行多杀菌素的提取，总收率达到80％以上。中国专利CN101560231中公开了一种大孔树脂梯度洗脱的提取工艺，收率达到68.2％，纯度达到95.3％。

但是，目前树脂吸附法的工艺研究尚不完善，已有的树脂吸附法的报道中，普遍存在泄漏率较高、产品收率及纯度较低的问题。溶媒萃取法的原理是利用多杀菌素与杂质在溶媒中的溶解度不同，将多杀菌素有选择性地从一种溶剂转移到另一种溶剂中，从而达到浓缩去杂的目的，溶媒萃取法也存在溶剂使用量过大，对环境保护造成污染的问题。本领域迫切需要深入研究并优化多杀菌素的发酵工艺和分离纯化工艺，有效提高多杀菌素产量并降低生产成本

发明内容：

为解决上述问题，克服现有技术的不足，本发明提供了一种采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法；

解决的第一个技术问题是：现有的刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，脱色率低，收率低，产品纯度低；

解决的第二个技术问题是：为了能够使树脂达到较好的吸附效果，传统工艺中树脂吸附时需要加入三倍以上体积的水，导致大量含有溶剂的水产生，且溶剂含量较低，排放污染环境，回收成本高难度大；

解决的第三个技术问题是：传统的多杀菌素制备方法，浸提液主要是丙酮，但是液相检测时，丙酮的干扰峰值太大，很难直接看出多杀菌素在溶液中的纯度。

本发明解决上述技术问题的具体技术方案为：采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)发酵液预处理：首先发酵液调节pH，然后高速离心，得到菌丝体，加入有机溶剂，浸提一段时间，再次高速离心，得到上清液，

(2)选用大孔吸附树脂对上清液进行初步提取；

(3)采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致；

(5)减压脱溶，萃取，调节pH值，旋转蒸馏，结晶。

进一步地，所述的上清液中还加入0.5-5％盐类和5-50％水，放置备用。

进一步地，所述的第(1)步：发酵液预处理pH调节为碱性10-12，首次离心转速5000-8000，第二次离心转速8000-12000，浸提时间为8-16小时，上清液加入0.5％-5％盐和5-50％水。

进一步地，所述有机溶剂为甲醇或乙酸乙酯，盐类物质为氯化钠或碳酸钠或碳酸氢钠或硫酸铵。

进一步地，所述第(2)步：大孔吸附树脂型号为LK20，吸附量为25mg/mL，吸附流速0.5-1.5BV/h，预解30％，50％，70％甲醇梯度洗脱，预解量各2-6BV，流速1-3BV/h，解析剂为80-100％甲醇或者丙酮和0-20％浓度1mol/L的硫酸，解析量为4-8BV，解析流速0.2-3BV/h。

进一步地，所述第(3)步：阴离子交换树脂的型号为LK30、D941，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，吸附流速1-3BV/h，脱色率85％，多杀菌素吸附率低于5％。

进一步地，所述第(4)步，阳离子交换树的型号为LK150、001*16、AMA36, 上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速1-3BV/h，预解0.1-1％盐溶液洗脱，预解量1-3BV，流速0.3-1BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速 0.2-3BV/h。

进一步地，所述第(5)步，萃取溶剂可用乙酸乙酯，石油醚，正己烷等，结晶过滤，可用碱性水溶液淋洗。

本发明的有益效果是：

①本发明采用大孔吸附树脂、阴离子交换树脂和阳离子交换树脂相结合的处理方法，对多杀菌素发酵液进行粗提，脱色和精提，树脂可以多次使用，环保，工艺操作简单；

②本发明在多杀菌素发酵液预处理时，通过先离心除去大部分水分，再加入少量有机溶剂浸提，减少了有机溶剂的使用，而且加入了0.5％-5％盐和5-50％水以至于使浸提液能够被树脂直接吸附，传统工艺需要加入三倍以上体积的水，减少了水污染；

③传统的浸提液主要是丙酮，但是液相检测时，丙酮的干扰峰值太大，很难直接看出多杀菌素在溶液中的纯度，本发明使用甲醇，意外的发现没有干扰峰值；

④产品纯化后多杀菌素含量较高，质量含量为97-99％。

附图说明：

附图1：传统的丙酮作为浸提液液相检测图谱；

附图2：本发明的甲醇作为浸提液液相检测图谱。

具体实施方式：

在本发明的描述中具体细节仅仅是为了能够充分理解本发明的实施例，但是作为本领域的技术人员应该知道本发明的实施并不限于这些细节。另外，公知的结构和功能没有被详细的描述或者展示，以避免模糊了本发明实施例的要点。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

本发明的具体实施方式：下列案例中，树脂柱的树脂体积为20mL。

检测方法为高效液相色谱，色谱柱为C18硅胶柱，流动相，乙腈：甲醇： 2％乙酸铵＝46：46：8，流速：1.0mL/min，检测波长：250nm；

实施例一：

(1)发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液 pH＝10.5，首次离心转速6000，去除离心液，得固体205g(含多杀菌素2.15g)，固体中加入100mL甲醇，浸提时间为8小时，离心转速12000，保留上清液，上清液加入1％硫酸铵50％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

(2)选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的LK20大孔吸附树脂，上柱液为预处理液，上柱量1BV (384mg)，吸附流速1.0BV/h，预解30％，50％,70％甲醇梯度洗脱，预解量各2BV，流速1BV/h，解析剂为100％甲醇，解析量为4BV，解析流速0.5BV/h，解析收率为96％，产品纯度88.5％；

(3)采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的D941阴离子交换树脂，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，调节pH＝9，吸附流速3BV/h，脱色率85％，多杀菌素收率98.5％；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的001*16阳离子交换树脂，上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速2BV/h，预解0.3％盐溶液洗脱，预解量3BV，流速0.5BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速1BV/h。产品纯度为95.3％，收率97.6％；

(5)减压脱溶，乙酸乙酯萃取，旋转蒸馏，调节pH＝11.0，结晶过滤，用碱性水溶液淋洗，烘干，产品纯度为98.8％，收率85％。

实施例二

(1)发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH＝11.0，首次离心转速8000，去除离心液，得固体198g(含多杀菌素2.03g)，固体中加入100mL甲醇，浸提时间为12小时，离心转速10000，保留上清液，上清液加入3.5％氯化钠和20％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

(2)选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的LK20大孔吸附树脂，上柱液为预处理液，上柱量1.2BV (432mg)，吸附流速0.5BV/h，预解30％，50％，70％甲醇梯度洗脱，预解量各4BV，流速1BV/h，解析剂为80％甲醇或者丙酮和20％浓度1mol/L的硫酸，解析量为 6BV，解析流速0.8BV/h，解析收率为97.5％，产品纯度89.3％；

(3)采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的LK30阴离子交换树脂，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，调节pH＝11，吸附流速1BV/h，脱色率90％，多杀菌素收率99.5％；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的LK150阳离子交换树脂，上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速2BV/h，预解0.3％盐溶液洗脱，预解量3BV，流速0.5BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速1BV/h。产品纯度为94.8％，收率97.9％；

(5)减压脱溶，石油醚萃取，旋转蒸馏，调节pH＝10.0，结晶过滤，用碱性水溶液淋洗，烘干，产品纯度为98.5％，收率87.2％。

实施例三

(1)发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH＝9.0，首次离心转速6000，去除离心液，得固体201g(含多杀菌素1.98g)，固体中加入100mL甲醇，浸提时间为12小时，离心转速10000，保留上清液，上清液加入5％碳酸氢钠10％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

(2)选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的LK20大孔吸附树脂，上柱液为预处理液，上柱量1.5BV (480mg)，吸附流速0.6BV/h，预解30％，50％，70％甲醇梯度洗脱，预解量各6BV，流速1.5BV/h，解析剂为95％甲醇或者丙酮和5％浓度1mol/L的硫酸，解析量为 6BV，解析流速0.8BV/h，解析收率为99.1％，产品纯度86.8％；

(3)采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的LK30阴离子交换树脂，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，调节pH＝10，吸附流速1BV/h，脱色率90％，多杀菌素收率99.5％；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的LK150阳离子交换树脂，上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速2BV/h，预解0.3％盐溶液洗脱，预解量3BV，流速0.5BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速1BV/h。产品纯度为94.8％，收率97.9％；

(5)减压脱溶，石油醚萃取，旋转蒸馏，调节pH＝11.0，结晶过滤，用碱性水溶液淋洗，烘干，产品纯度为98.3％，收率86.9％。

实施例四

(1)发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液 pH＝11.0，首次离心转速5000，去除离心液，得固体201g(含多杀菌素1.98g)，固体中加入100mL甲醇，浸提时间为16小时，离心转速130000，保留上清液，上清液加入2.5％氯化钠和30％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

(2)选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的LK20大孔吸附树脂，上柱液为预处理液，上柱量1.3BV (432mg)，吸附流速1BV/h，预解40％，60％，80％甲醇梯度洗脱，预解量前两个梯度为4BV，后一个梯度为2BV，流速1.0BV/h，解析剂为90％甲醇和10％浓度1mol/L的硫酸，解析量为8BV，解析流速1.0BV/h，解析收率为98.7％，产品纯度85.1％；

(3)采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的D941阴离子交换树脂，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，调节pH＝10.5，吸附流速1.5BV/h，脱色率93％，多杀菌素收率97.6％；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的AMA36阳离子交换树脂，上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速1.0BV/h，预解0.2％盐溶液洗脱，预解量1BV，流速0.5BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速0.5BV/h。产品纯度为94.8％，收率97.9％；

(5)减压脱溶，正己烷萃取，旋转蒸馏，调节pH＝11.0，结晶过滤，用碱性水溶液淋洗，烘干，产品纯度为98.9％，收率86.7％。

实施例五

(1)发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液 pH＝11.0，首次离心转速7000，去除离心液，得固体209g(含多杀菌素2.11g)，固体中加入100mL甲醇，浸提时间为14小时，离心转速130000，保留上清液，上清液加入4.0％硫酸铵和30％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

(2)选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的LK20大孔吸附树脂，上柱液为预处理液，上柱量1.5BV (480mg)，吸附流速1BV/h，预解30％，50％，70％甲醇梯度洗脱，预解量前两个梯度为4BV，后一个梯度为3BV，流速1.0BV/h，解析剂为95％甲醇和5％浓度1mol/L 的硫酸，解析量为5BV，解析流速0.8BV/h，解析收率为99.3％，产品纯度86.6％；

(3)采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的D941阴离子交换树脂，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，调节pH＝9.5，吸附流速2.0BV/h，脱色率92％，多杀菌素收率98.5％；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的001*16阳离子交换树脂，上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速1.0BV/h，预解0.1％盐溶液洗脱，预解量1BV，流速1.0BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速0.5BV/h。产品纯度为96.8％，收率97.6％；

(5)减压脱溶，正己烷萃取，旋转蒸馏，调节pH＝11.0，结晶过滤，用碱性水溶液淋洗，烘干，产品纯度为99.3％，收率85.3％。

Ⅰ：为了更加直观的展现本发明的联合树脂的工艺优势，特以本发明采用联合树脂提取、脱色和精制方法和相同工艺采用单一变量的方法进行对比：

对比例一(1)发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH＝10.5，首次离心转速6000，去除离心液，得固体205g(含多杀菌素 2.15g)，固体中加入100mL甲醇，浸提时间为8小时，离心转速12000，保留上清液，上清液加入1％硫酸铵50％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

(2)采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的D941阴离子交换树脂，上柱液为发酵液，调节pH＝9，吸附流速3BV/h，脱色率11％，多杀菌素收率97.2％。

(3)选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的LK20大孔吸附树脂，上柱液为预处理液，上柱量1BV (384mg),吸附流速1.0BV/h，预解30％，50％，70％甲醇梯度洗脱，预解量各2BV，流速1BV/h，解析剂为100％甲醇，解析量为4BV，解析流速0.5BV/h，解析收率为96％，产品纯度87.3％；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的001*16阳离子交换树脂,上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速2BV/h，预解0.3％盐溶液洗脱，预解量3BV，流速0.5BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速1BV/h。产品纯度为95.3％，收率97.6％；

(5)减压脱溶，乙酸乙酯萃取，旋转蒸馏，调节pH＝11.0，结晶过滤，用碱性水溶液淋洗，烘干，产品纯度为91.2％，收率85％。

对比例二：(1)发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH＝10.5，首次离心转速6000，去除离心液，得固体205g(含多杀菌素 2.15g)，固体中加入100mL甲醇，浸提时间为8小时，离心转速12000，保留上清液，上清液加入1％硫酸铵50％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

(2)选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的LK20大孔吸附树脂，上柱液为预处理液，上柱量1BV (384mg),吸附流速1.0BV/h，预解30％，50％，70％甲醇梯度洗脱，预解量各2BV，流速1BV/h，解析剂为100％甲醇，解析量为4BV，解析流速0.5BV/h，解析收率为96％，产品纯度88.5％；

(3)采用大孔吸附树脂对解析液进行脱色处理：树脂采用艾美科健(中国) 生物医药有限公司生产的DM700树脂，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，调节 pH＝9，吸附流速3BV/h，脱色率50％，多杀菌素收率85％；

(4)用阳离子交换树脂进行进一步精致：树脂采用艾美科健(中国)生物医药有限公司生产的001*16阳离子交换树脂,上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速2BV/h，预解0.3％盐溶液洗脱，预解量3BV，流速0.5BV/h，解析剂为50％甲醇的盐溶液，解析流速1BV/h。产品纯度为92.3％，收率82.87％；

(5)减压脱溶，乙酸乙酯萃取，旋转蒸馏，调节pH＝11.0，结晶过滤，用碱性水溶液淋洗，烘干，产品纯度为94.6％，收率72.3％；

表1：联合树脂工艺对于产品指标的影响

备注：总收率为每一步收率相乘。

由上述数据分析可知：通过实施案例一二对比，三种树脂顺序的改变，会导致脱色效果明显下降脱色率由85％下降到11％；

通过实施案例一三对比可知，三种联合树脂种类的改变，即用其中一种树脂或者两种树脂，会导致脱色率下降，收率下降，产品纯度也会下降。

Ⅱ：为了更加直观的展现本发明的盐工艺的工艺优势，特以本发明采用盐工艺的方法和相同工艺采用单一变量的方法进行对比，

对比例三：选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取的前处理，替换成：发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH＝10.5，首次离心转速6000，去除离心液，得固体205g(含多杀菌素2.15g)，固体中加入 100mL甲醇，浸提时间为8小时，离心转速12000，保留上清液，调节浸提液 pH＝11.0，放置备用；

对比例四：选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取的前处理，替换成：发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH＝10.5，首次离心转速6000，去除离心液，得固体205g(含多杀菌素2.15g)，固体中加入 100mL甲醇，浸提时间为8小时，离心转速12000，保留上清液，上清液加入50％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

对比例五：选用大孔吸附树脂对处理液进行初步提取的前处理，替换成：发酵结束后放罐前，加入4mol/L的氢氧化钠溶液，调节发酵液pH＝10.5，首次离心转速6000，去除离心液，得固体205g(含多杀菌素2.15g)，固体中加入 100mL甲醇，浸提时间为8小时，离心转速12000，保留上清液，上清液加入300％水，调节浸提液pH＝11.0，放置备用；

表2：盐工艺对树脂吸附量的影响

组别	前处理	树脂吸附量mg/mL
			实施例一	加入4％盐类加入40％水	23.6
对比例三	不加水不加盐	0.63
			对比例四	不加盐加入50％水	0.85
对比例五	加入300％水	24.1

由上述数据分析可知:本发明在多杀菌素发酵液预处理时，通过先离心除去大部分水分，再加入少量有机溶剂浸提，减少了有机溶剂的使用，而且加入了 0.5％-5％盐和5-50％水以至于使浸提液能够被树脂直接吸附，相对于传统工艺需要加入三倍以上体积的水，在保证高吸附量的同时减少了水污染。

Ⅲ：为了更加直观的展现本发明的盐工艺的工艺优势，特以本发明采用盐工艺的方法和相同工艺采用树脂来源作为单一变量的方法进行对比，

表3：盐工艺及树脂来源对树脂吸附量的影响

由上述数据分析可知：本发明的盐工艺适用于市面上的常用的大孔吸附树脂，效果显著，适用性强具有通用性。

Ⅲ：为了更加直观的展现本发明的工艺优势，特以本发明采用甲醇作为反应溶剂的方法和相同工艺采用常用丙酮溶剂作为单一变量的方法进行对比，

根据附图1和附图2可知：传统的浸提液主要是丙酮，但是液相检测时，前两个是干扰峰，后两个是多杀菌素峰，丙酮的干扰峰值太大，很难直接看出多杀菌素在溶液中的纯度，本发明使用甲醇，意外的发现没有干扰峰值。

综上所述：

①本发明采用大孔吸附树脂、阴离子交换树脂和阳离子交换树脂相结合的处理方法，对多杀菌素发酵液进行粗提，脱色和精提，树脂可以多次使用，环保，工艺操作简单；

②本发明在多杀菌素发酵液预处理时，通过先离心除去大部分水分，再加入少量有机溶剂浸提，减少了有机溶剂的使用，而且加入了0.5％-5％盐和5-50％水以至于使浸提液能够被树脂直接吸附，传统工艺需要加入三倍以上体积的水，减少了水污染；

③传统的浸提液主要是丙酮，但是液相检测时，丙酮的干扰峰值太大，很难直接看出多杀菌素在溶液中的纯度，本发明使用甲醇，意外的发现没有干扰峰值；

④产品纯化后多杀菌素含量较高，质量含量为97-99％。

Claims (5)

1.采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）发酵液预处理：首先发酵液调节pH为碱性10-12，然后第一次高速离心，得到菌丝体，加入有机溶剂甲醇或乙酸乙酯，浸提一段时间，再次高速离心，得到上清液，所述的上清液中还加入0.5-5%盐类和5-50%水，放置备用；所述盐类物质为氯化钠或碳酸氢钠或硫酸铵，第一次离心转速5000-8000，第二次离心转速8000-12000，浸提时间为8-16小时，

（2）选用大孔吸附树脂对上清液进行初步提取；

（3）采用阴离子交换树脂对解析液进行脱色处理；

（4）用阳离子交换树脂进行进一步精制；

（5）减压脱溶，萃取，调节pH值，旋转蒸馏，结晶，所述萃取的溶剂为乙酸乙酯或石油醚或正己烷。

2.根据权利要求1所述的采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，其特征在于所述第（2）步：大孔吸附树脂型号为LK20，吸附量为25mg/mL，吸附流速0.5-1.5BV/h，预解30%，50%，70%甲醇梯度洗脱，预解量各2-6BV，流速1-3BV/h，解析剂为80-100%甲醇或者丙酮和0-20%浓度1mol/L的硫酸，解析量为4-8BV，解析流速0.2-3BV/h。

3.根据权利要求1所述的采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，其特征在于所述第（3）步：阴离子交换树脂的型号为LK30、D941，上柱液为大孔吸附树脂的解析液，吸附流速1-3BV/h，脱色率85%，多杀菌素吸附率低于5%。

4.根据权利要求1所述的采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，其特征在于所述第（4）步，阳离子交换树的型号为LK150、001*16、AMA36,上柱液为阴离子交换树脂吸附混合液，吸附流速1-3BV/h，预解0.1-1%盐溶液洗脱，预解量1-3BV，流速0.3-1BV/h，解析剂为50%甲醇的盐溶液，解析流速0.2-3BV/h。

5.根据权利要求1所述的采用树脂从刺糖多孢菌发酵液中提取分离多杀菌素的方法，其特征在于所述第（5）步，结晶过滤后还可用碱性水溶液淋洗。

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