CN1749401A - 一种天然脱落酸的提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物工程领域。针对目前天然脱落酸提取率和纯度不高的问题，本发明公开了一种天然脱落酸的提取方法，通过发酵液酸化后过滤，大孔吸附树脂吸附后洗脱，洗脱液经浓缩后进行萃取，萃取液浓缩得到结晶粗品；结晶粗品溶解后，用硅胶吸附杂质，加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳结晶助剂，减压浓缩，冷却结晶，洗涤、真空干燥，制得95％以上天然脱落酸结晶体，本方法具有提取率高、提取得到脱落酸纯度高等优点。

Description

一种天然脱落酸的提取方法

                        一、所属领域

本发明属于生物化工领域，具体涉及天然物质的提取分离领域。

                        二、背景技术

脱落酸是五大植物激素之一，是植物重要生长调节剂，能促进果实类、谷类、豆类等的成熟发育，能大幅度提高其产量和质量，又能大大增强其耐寒、抗旱和抗盐碱能力，因而其有广阔的应用前景。

存在于植物体内的天然脱落酸光学构型为(s)-(+)-脱落酸，其结构式为：

      2-顺式-(+)-脱落酸

现已经建立了将植物细胞磨碎，用有机溶剂抽提，碳酸氢钠水溶液萃取，提取液浓缩，再进行柱层析，直接从植物中分离和精制天然脱落酸的方法。由于每1kg干植物仅含1-0.5mg天然脱落酸，其植物中的天然脱落酸含量很低，该方法难以得到大量的天然脱落酸。

而据报道人工合成脱落酸得到的是外消旋体，生物活性较低。

为了解决和满足脱落酸应用于农业生产的需要。近二十年来，微生物学专家一直在研究利用微生物发酵法生产天然脱落酸，现已有通过用微生物进行液体发酵和固体发酵生产天然脱落酸的报道，主要采用了固体发酵、液体批次发酵和连续流加补料出料工艺等多种发酵方法，但这些方法中天然脱落酸的发酵产量一直比较低，成本高，如微生物发酵15天然脱落酸的浓度为63mg/升发酵液(JP-A-3-6139)；最高的产量达300mg/升发酵液(如J P-A-6-247927、J P-A-6-197775)；J P-A-63-296697公开的固体培养法的含量为82mg/100g培养基。由于迄今为止所报道天然脱落酸的发酵水平离工业化都还有一定的距离，因此，有关从微生物发酵产物中分离提取天然脱落酸的工作开展较少，尤其从微生物发酵液中提取天然脱落酸的方法报道更少，而且收得率都比较低。例如，JP-A-60-6629公开的用大量溶剂萃取天然脱落酸，其产品收率约54％。JP-A-3-6139公开的产品收率为73％，都不适宜于工业化生产。

针对现有微生物发酵生产天然脱落酸方法中存在的发酵产率低，收率低，生产成本高等不足，本发明人通过研究，首先突破了发酵技术这一关(见CN1182798)，天然脱落酸的最高产量达到1.2克/升发酵液，该发酵水平已接近或达到了工业化开发的要求，并实现了20吨规模的工业化发酵生产，产品收率为80％。

虽然通过发明人的努力，微生物发酵生产天然脱落酸的产量和规模在原有基础上都取得了显著的进步，但是，如何尽可能多的将发酵液中的天然脱落酸提取出来是急待解决的问题。

                        三、发明内容

针对以上问题，发明人对微生物发酵生产天然脱落酸的发酵产物的提取进行了深入的研究，得到了一种工艺简单，成本低，产品收率高的从微生物发酵液中提取天然脱落酸新方法，使天然脱落酸通过微生物发酵生产成为了可能，从而完成了本发明。

本发明公开了一种从微生物发酵液中分离提取天然脱落酸的方法。

本发明所述的天然脱落酸提取方法指的就是从液体发酵液中将天然脱落酸分离、浓缩、纯化的过程。

本发明可以通过以下方式得以实现：

取能发酵产生天然脱落酸的微生物定向培养得到的发酵液酸化后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附后用有机溶剂洗脱，洗脱液经浓缩后进行萃取，萃取液浓缩得到结晶粗品；结晶粗品在乙酸乙酯中溶解后，用硅胶吸附杂质，加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳结晶助剂，减压浓缩，冷却结晶，洗涤、真空干燥，制得95％以上天然脱落酸结晶体。

本发明中的发酵液是用能生产天然脱落酸的微生物(如，葡萄饱霉属、尾饱霉属等)通过液体发酵得到的。

发酵液的酸化是加入硫酸或盐酸处理0-10小时，最优处理时间范围为0.5-5小时，控制发酵液的Ph值范围在1.5-5.0。

发酵液酸化后过滤除去杂质，利用101大孔阳离子交换吸附树脂吸附发酵液中的天然脱落酸组分，再用有机溶媒如40-85％的甲醇或50-95％的乙醇水溶液为洗脱剂进行洗脱。

洗脱液在真空度小于0.08Mpa下，经减压浓缩得到含天然脱落酸的浓缩液，以乙酸乙酯为溶剂多次萃取，减压浓缩，冷却结晶，制得结晶粗品。

在结晶粗品中加入乙酸丁酯或乙酸乙酯类低级乙酸酯溶剂，以适量的硅胶吸附杂质，加入己烷、苯、石油醚或四氯化碳结晶助剂，减压浓缩，冷却结晶，洗涤、真空干燥，制得95％以上天然脱落酸结晶体。

由于天然脱落酸是光敏化合物，整个操作过程都在避光条件下进行，减少或避免天然脱落酸的异构及分解，提高天然脱落酸的回收率。

新方法与现有报道的提取方法相比，本发明具有如下优点：

1、工艺方法简单合理、可行、投资省；

2、新方法采用的101大孔阳离子吸附树脂是对以前提取方法的一个重要改进，新选择的101大孔阳离子吸附树脂对天然脱落酸具有非常强的富集能力，该步方法能富集发酵液中99％以上的天然脱落酸。而报道(JP-A-7-165702)的溶媒法多次萃取，该步工艺萃取率只有90％左右；

3、新方法第一步是提取结晶粗品，改变了现有直接提取脱落酸精品的方法，使产品收得率达到90％以上，比现有的提取方法提高10个百分点以上；

4、本发明方法的三废排放量比溶媒法低得多。

                        四、附图说明

下面结合附图详细说明本发明方法：

发酵液经酸化后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附后用有机溶剂如甲醇洗脱，洗脱液经浓缩后以乙酸乙酯为溶剂进行萃取，萃取液经减压浓缩后结晶得到结晶粗品；

结晶粗品用低级乙酸酯类溶剂溶解后，用硅胶吸附杂质，过滤，再加入己烷、苯、石油醚或四氯化碳结晶助剂，减压浓缩，冷却结晶，过滤、洗涤、真空干燥，制得95％以上天然脱落酸结晶体。

                       五、具体实施方式

实施例1

6000mL发酵培养基成分：糊精5.0％，麦麸0.3％，乙二醇0.02％，葡萄糖2.0％，蔗糖3.0％，豆饼粉1.0％，，磷酸氢二钾0.01％，硫酸镁0.05％，

将以上培养基分装20个1000mL三角瓶，每瓶装300mL，于120℃灭菌30分钟，冷却后接种活化后的脱落酸高产菌株灰葡萄孢TBI-9孢子悬液，于23-29℃下进行发酵培养。振荡速度150rpm，振幅20cm。发酵时间8-9天，天然脱落酸浓度达到0.12％。

取5000克发酵液(天然脱落酸含量为6.025克)，加入3N硫酸溶液调节Ph至1.5-5.0，进行酸化处理30分钟。在室温下滤纸过滤，滤除发酵液中的菌体和杂质后，利用1000克101大孔阳离子交换树脂接触富集酸化液体中的天然脱落酸1小时后，再用2500mL 40-85％甲醇洗树脂30分钟，收集含天然脱落酸的甲醇液，甲醇液的天然脱落酸含量是5.905克。

洗脱甲醇液在Buchi R-3000型旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在小于0.08Mpa，水浴温度40-60℃，蒸馏速度控制在12mL/min，浓缩成原体积五分之一左右的水溶液，用与浓缩液等体积的乙酸乙酯分三次进行萃取，当水相中的天然脱落酸浓度低于0.05克/升时停止操作。合并酯相，在旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴温度40-50℃，冷却结晶得结晶粗品。本步操作收率达95％。

在结晶粗品中加入100mL乙酸丁酯或乙酸乙酯溶剂，以及20克硅胶吸附杂质，过滤。在滤液中加入10-100mL四氯化碳或石油醚结晶助剂，减压浓缩，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴温度40-50℃，冷却结晶，过滤、洗涤、真空干燥，即制得5.590克纯度为98.3％的天然脱落酸产品，产品收率为91.2％。

以上操作过程都在避光条件下进行。

实施例2

发酵液的制备方法同实施例1，取5000克发酵液(天然脱落酸含量为6.010克)，加入4.5升水，使液体中天然脱落酸的浓度为0.012％，用此溶液代替原始发酵液进行提取分离。加入3N盐酸溶液调节Ph至1.5-5.0，在室温下9000rpm离心10分钟，收集上清液。离心后的上清液与1000克101大孔阳离子交换树脂接触1小时后，再用2500mL 40-85％甲醇洗树脂30分钟，收集含天然脱落酸的甲醇液，甲醇液的天然脱落酸含量是5.920克。

洗脱甲醇液在Buchi R-3000型旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在小于0.08Mpa，水浴温度40-60℃，蒸馏速度控制在12mL/min，浓缩成原体积五分之一左右的水溶液，用与浓缩液等体积的乙酸乙酯分三次进行萃取，当水相中的天然脱落酸浓度低于0.05克/升时停止操作。合并酯相，在旋转蒸馏装置上减压蒸馏，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴温度40-50℃，冷却结晶得结晶粗品。本步操作收率达95％。

在结晶粗品中加入100ml醋酸丁酯或醋酸乙酯溶剂，以及20克硅胶吸附杂质，过滤。在滤液中加入10-100mL四氯化碳或石油醚结晶助剂，减压浓缩，真空度保持在小于0.075Mpa，水浴温度40-50℃，冷却结晶，过滤、洗涤、真空干燥，制得5.621克纯度为98.5％的天然脱落酸产品，产品收率为92.1％。

以上操作过程都在避光条件下进行。

实施例3

发酵液的制备方法同实施例1，取5000克发酵液(天然脱落酸含量为6.110克)。提取分离操作中除了101大孔阳离子交换树脂接触富集酸化液体中的天然脱落酸后，用乙醇代替甲醇作为洗脱剂对树脂吸附的天然脱落酸进行洗脱外，其它操作基本同实施例1。最后制得5.589克纯度为98.5％的天然脱落酸产品，产品收率为90.1％。

Claims (6)

1、一种天然脱落酸的提取方法，包括以下步骤：取能发酵产生天然脱落酸的微生物定向培养得到的发酵液酸化后过滤，滤液用大孔吸附树脂吸附后用有机溶剂洗脱，洗脱液经浓缩后进行萃取，萃取液浓缩得到结晶粗品；结晶粗品溶解后，用硅胶吸附杂质，加入己烷或苯或石油醚或四氯化碳结晶助剂，减压浓缩，冷却结晶，洗涤、真空干燥，制得95％以上天然脱落酸结晶体。

2、根据权利要求1所述的天然脱落酸的提取方法，其特征是：发酵液的酸化是加入硫酸或盐酸处理0-10小时，最优处理时间范围为0.5-5小时，控制发酵液的Ph值范围在1.5-5.0。

3、根据权利要求1所述的天然脱落酸的提取方法，其特征是：吸附用大孔树脂优选为101大孔阳离子交换吸附树脂。

4、根据权利要求1所述的天然脱落酸的提取方法，其特征是：洗脱用的有机溶媒优选为40-85％的甲醇或50-95％的乙醇水溶液。

5、根据权利要求1所述的天然脱落酸的提取方法，其特征是：整个操作过程都在避光条件下进行。

6、根据权利要求1所述的天然脱落酸的提取方法，其特征是：粗品溶解采用乙酸乙酯作为溶剂，加入的结晶助剂与乙酸乙酯的体积比例为0.1-1.0比1.0。

Images