CN101078020A - 八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法 - Google Patents

八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法 Download PDF

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Abstract

八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其首先利用超临界CO2萃取八角茴香油后，提取渣加入产莽草酸的八角内生细菌进行生物转化提高莽草酸含量，水作为萃取溶剂，进行微波或加热提取以及独特的去杂、结晶工艺。本发明简化了工艺和操作程序，缩短了生产周期，降低了生产成本，提高了产品得率和含量。

Description

八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法
技术领域
本发明涉及植物有效成份提取纯化领域，特别是提供一种八角属植物莽草酸生物转化技术及提取纯化工艺。
背景技术
莽草酸的价值，主要体现在(1)作为抗禽流感特效药“达菲”的原料；(2)作为抗癌药物的中间体，对血小板的凝聚和凝血的抑制作用；(3)其它药理作用。
查新发现，除了八角果实中含有莽草酸外，其它八角属植物、马尾松等也有莽草酸的存在，但目前研究表明八角中含量最高。有关莽草酸研究多集中在其药理、致死等方面，目前没有提取纯化，以及生物转化方面的有关报道。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种优化工艺、成本低、产品优质的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其比传统工艺效率提高一倍以上，成本降低三分之一以上。
为达到上述目的，本发明的实施方案为：一种八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤包括：
(1)、超临界CO2萃取：
a、先将八角属植物粉碎，过80目筛，装入超临界CO2萃取釜，萃取条件为：萃取釜压力35～25Mpa、温度60℃～40℃，分离釜压力8～5Mpa、温度60～40℃；
b、萃取1.5h后，调节分离釜压力为5.7Mpa，分离温度45℃，收集萃取物八角茴香油；
(2)、莽草酸微生物转化：将超临界CO2萃取后的八角渣中加入莽草酸诱导剂，该诱导剂为产莽草酸的八角内生细菌，在28-32℃范围内培养10～48h，提高八角渣中莽草酸含量；
(3)、莽草酸提取分离纯化：将微生物转化转化后的八角渣以1∶20的比例加入蒸馏水或去离子水，微波频率为3000～2000MHz，萃取时间30min，萃取温度40℃～50℃；或八角渣以1∶10的比例加入蒸馏水或去离子水，加热萃取，时间90min，萃取温度40℃～50℃，然后进行浓缩，结晶，重结晶，最后得纯度大于98％的莽草酸。
步骤(1)中，超临界CO2萃取最佳条件为：萃取釜压力25Mpa、萃取温度50℃，分离釜压力：6.0Mpa、分离温度46℃；
步骤(2)中，所述产莽草酸的八角内生菌由下述方法分离培养所得：
A、产莾草酸的八角内生菌的分离：
a、对八角进行表面升汞杀菌，接种八角组织块于固体培养剂(MS)上，培养10-15天，并接种数次；
b、对八角产生的愈伤组织进行观察，发现其中愈伤组织仍有微生物生长，对其中微生物进行分离；
c、对分离出的微生物进行逐个分离，纯化；
d、经过分离，筛选和检测，找到产生莾草酸微生物，为革兰氏阴性细菌。
B、产莾草酸的八角内生细菌的培养：
a、取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，混合，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培养液；
b、产莽草酸的八角内生细菌在牛肉膏蛋白胨培养液中进行培养，最佳培养条件为：21g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培养液、1.9g硝酸铵/L牛肉膏蛋白胨培养液、培养温度为30℃，pH值6.5和培养基装量100mL/250mL，接种量为培养基装量的1/10，0.5g氯化钙/L牛肉膏蛋白胨培养液和0.5g氯化镁/L牛肉膏蛋白胨培养液，80r/min-100r/min振荡速度。
步骤(2)中，最佳生物转化温度为30℃。
步骤(3)中，浓缩最佳温度为55℃～65℃。
本发明采用超临界CO2萃取八角茴香油，萃油后的八角渣进行高效生物转化，提高八角渣中莽草酸含量；同时，采用微波萃取法，或常规溶剂提取法，提取效率高；同时采用柱层析、结晶等分离、精制技术，获得98％以上的莽草酸和一定纯度副产物八角茴香油二种产品。
具体实施方式
八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，具体步骤为：
(1)、莽草酸含量检测：
HPLC检测不同来源八角茴香莽草酸含量。HPLC检测条件，检测波长220um，进样2ul，流速为0.5ml/min，流动相：乙腈∶2％磷酸＝95∶5。
(2)、超临界CO2萃取(八角茴香油的提取)：
a、选取莽草酸高含量八角属植物原料，粉碎，装入超临界CO2萃取釜，中，进行超临界CO2萃取，萃取的条件：萃取釜压力25Mpa、萃取温度50℃，分离釜压力：6.0Mpa、分离温度46℃，收集萃取物八角茴香油，一次性萃取后，原料中含油量很低：
b、、萃取1.5h后，调节分离釜压力为5.7Mpa，分离温度45℃。收集萃取物八角茴香油，一次性萃取后，原料中含油量很低；
(3)、产莽草酸的八角内生菌的分离和培养：
A、产莾草酸的八角内生菌的分离：
a、对八角进行表面升汞杀菌，接种八角组织块于固体培养剂(MS)上，培养10-15天，并接种数次；
b、对八角产生的愈伤组织进行观察，发现其中愈伤组织仍有微生物生长，对其中微生物进行分离；
c、对分离出的微生物进行逐个分离，纯化；
d、经过分离，筛选和检测，找到产生莽草酸微生物，为革兰氏阴性细菌。
B、产莾草酸的八角内生细菌的培养：
a、取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，混合，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培养液；
b、产莽草酸的八角内生细菌在牛肉膏蛋白胨培养液中进行培养，最佳培养条件为：21g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培养液、1.9g硝酸铵/L牛肉膏蛋白胨培养液、培养温度为30℃，pH值6.5和培养基装量100mL/250mL，接种量为培养基装量的1/10，0.5g氯化钙/L牛肉膏蛋白胨培养液和0.5g氯化镁/L牛肉膏蛋白胨培养液，80r/min-100r/min振荡速度。
(4)、莽草酸微生物转化：
将步骤2超临界CO2萃取后的八角渣中加入步骤3分离培养所得产莽草酸的八角内生细菌，在30℃范围内培养10～48h，使莽草酸类似物转化为莽草酸；
(5)、莽草酸提取分离纯化：
a、将莽草酸微生物转化后的八角渣以1∶20的比例加入蒸馏水或去离子水，进行微波萃取，微波频率为3000～2000MHz，萃取时间30min，萃取温度40℃～50℃；或八角渣以1∶10的比例加入蒸馏水或去离子水，加热萃取，时间90min，萃取温度40℃～50℃。
b、然后离心过滤，然后在真空下进行浓缩，浓缩温度为55℃～60℃，再经吸附脱色、结晶、重结晶，得到≥98％莽草酸产品。

Claims (5)

1、一种八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤包括：
(1)、超临界CO2萃取：
a、先将八角属植物粉碎，过80目筛，装入超临界CO2萃取釜，萃取条件为：萃取釜压力35～25Mpa、温度60℃～40℃，分离釜压力8～5Mpa、温度60～40℃；
b、萃取1.5h后，调节分离釜压力为5.7Mpa，分离温度45℃，收集萃取物八角茴香油；
(2)、莽草酸微生物转化：将超临界CO2萃取后的八角渣中加入莽草酸诱导剂，该诱导剂为产莽草酸的八角内生细菌，在28-32℃范围内培养10～48h，使莽草酸类似物转化为莽草酸；
(3)、莽草酸提取分离纯化：将微生物转化转化后的八角渣以1∶20的比例加入蒸馏水或去离子水，微波频率为3000～2000MHz，萃取时间30min，萃取温度40℃～50℃；或八角渣以1∶10的比例加入蒸馏水或去离子水，加热萃取，时间90min，萃取温度40℃～50℃，然后进行浓缩，结晶，重结晶，最后得纯度大于98％的莽草酸。
2、根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(1)中，超临界CO2萃取最佳条件为：萃取釜压力25Mpa、萃取温度50℃，分离釜压力：6.0Mpa、分离温度46℃。
3、根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，所述产莾草酸的八角内生菌由下述方法分离培养所得：
A、产莽草酸的八角内生菌的分离：
a、对八角进行表面升汞杀菌，接种八角组织块于固体培养剂(MS)上，培养10-15天，并接种数次；
b、对八角产生的愈伤组织进行观察，发现其中愈伤组织仍有微生物生长，对其中微生物进行分离；
c、对分离出的微生物进行逐个分离，纯化；
d、经过分离，筛选和检测，找到产生莽草酸微生物，为革兰氏阴性细菌。
B、产莾草酸的八角内生细菌的培养：
a、取牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g，混合，用蒸馏水定容至1000mL，121℃灭菌20min，制得牛肉膏蛋白胨培养液；
b、产莾草酸的八角内生细菌在牛肉膏蛋白胨培养液中进行培养，最佳培养条件为：21g葡萄糖/L牛肉膏蛋白胨培养液、1.9g硝酸铵/L牛肉膏蛋白胨培养液、培养温度为30℃，pH值6.5和培养基装量100mL/250mL，接种量为培养基装量的1/10，0.5g氯化钙/L牛肉膏蛋白胨培养液和0.5g氯化镁/L牛肉膏蛋白胨培养液，80r/min-100r/min振荡速度，时间8-24h。
4、根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(2)中，莽草酸微生物转化最佳温度为30℃。
5、根据权利要求1所述的八角属植物莽草酸生物转化及提纯方法，其特征在于，步骤(3)中，浓缩最佳温度为55℃～65℃。
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