CN104250616A - 一种植物内生菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，公开了一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：(1)植物组织预处理；(2)植物组织培养；(3)内生菌的分离。本发明公开的植物内生菌的分离方法，可以有效除去表面细菌、真菌、放线菌以及其他微生物，避免混入杂菌影响内生菌分离效果。经过组织培养后，植物组织内的内生菌恢复生长，且在分离内生菌的操作中，无需再进行消毒处理，从而大大减少了消毒剂对植物组织和内生菌的伤害作用，增加了内生菌的生存概率，能够显著提高分离得到的内生菌的数目。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，特别是指一种植物内生菌的分离方法。
背景技术
目前，植物内生菌分离的方法大多是将植物组织直接消毒后通过物理、化学等途径破碎，然后提取其渗出液，并将液体作为菌源进行内生菌的培养和分离。内生菌分离的关键是消除植物体表面微生物的污染，为了确保所分离到的微生物为植物内生菌，常采用非常严格的消毒措施。目前，在植物内生菌分离中使用的消毒方法大多数采用植物体表面消毒法去除非内生菌的污染。如中国发明专利CN103122331A，公开了一种植物内生菌的分离方法，包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯化等步骤。由于消毒剂(如次氯酸钠、过氧化氢、乙醇、升汞等)不仅对植物体有伤害，而且也会对内生菌造成不良影响。原因在于：消毒剂对植物的伤害会导致植物体内产生活性氧，活性氧对植物本身及其内生菌的生存都不利，严重时产生超敏反应，导致植物和内生菌一起死亡。在植物内生菌分离过程中，如果能减少使用消毒剂或者不使用消毒剂，无疑将增加内生菌的生存概率，有利于分离到更多、更全面的内生菌。而现有的内生菌分离方法，如果减少或不使用消毒剂，将导致对植物表面消毒不彻底，在内生菌分离中容易引人杂菌，影响内生菌的分离效果。
发明内容
本发明提出了一种植物内生菌的分离方法，减少了消毒剂对植物组织和内生菌的伤害作用，增加了内生菌的生存概率，有助于分离到更多的内生菌。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
(1)植物组织预处理
植物组织用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分，将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度为70-75％乙醇消毒3-5min，无菌水清洗，再用体积浓度为0.1-0.3％升汞浸泡1-3min或者质量浓度为4-6％次氯酸钠浸泡5-10min，接着用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；
(2)植物组织培养
将消毒后的植物组织置于培养基上，进行无菌培养，直至植物组织恢复生长；
(3)内生菌的分离
组织培养后的植物组织，在无菌条件下粉碎，而后在消毒过的研钵中研磨，将渗出液用无菌水稀释1-5倍，分别取100-200uL稀释液涂布于内生细菌培养基、内生真菌培养基、内生放线菌培养基上进行培养、纯化，即得内生菌单菌落。
进一步，步骤(2)所用培养基为MS培养基。
进一步，步骤(2)培养条件为温度15-30℃，湿度20-70％。
进一步，培养植物茎、叶、花、果实时，控制光照强度1000-6000Lux，光照时间8-14h/d；培养植物根时，光照强度0-800Lux。
进一步，步骤(3)内生细菌培养基为牛肉蛋白胨培养基，内生真菌培养基为PDA培养基，内生放线菌培养基为高氏一号培养基。
进一步，步骤(3)所述纯化内生菌的方法为划线培养法。
本发明的有益效果：
本发明所述的内生菌分离方法先通过对消毒后的植物组织进行培养，待植物体恢复生长后，直接对植物组织进行物理、化学等途径破碎，然后利用从组织中渗出的汁液进行内生菌的培养和分离。对植物组织的预处理，可以有效除去表面细菌、真菌、放线菌以及其他微生物，从而避免混入杂菌影响内生菌分离效果。经过培养后，植物组织可以在较短时间内恢复正常生长，植物组织内的内生菌也可恢复生长，减少了消毒剂对内生菌的损伤。经过组织培养的植物组织，其表面的微生物已经除去了，因此在下一步分离内生菌的操作中，无需再进行消毒处理，从而大大减少了消毒剂对植物组织和内生菌的伤害作用，增加了内生菌的生存概率，能够显著提高分离得到的内生菌的数目。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
(1)植物组织预处理
植物组织用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤2-3次，晾干表面水分，将其切割成0.5cm的小段，然后把切好的材料置于体积浓度为70％乙醇消毒3-5min，无菌水清洗2-3次，再用体积浓度为0.1％升汞浸泡1-3min或者质量浓度为4％次氯酸钠浸泡5-10min，接着用无菌水冲洗3-5次，晾干表面水分后备用；
(2)植物组织培养
将消毒后的植物组织置于MS培养基上，进行无菌培养1-2周，直至植物组织恢复生长；培养条件为温度15℃，湿度20％，光照强度1000Lux，光照时间8-10h/d；(3)内生菌的分离
组织培养后的植物组织，在无菌条件下粉碎，而后在消毒过的研钵中研磨，将渗出液用无菌水稀释1倍，分别取100uL稀释液涂布于牛肉蛋白胨培养基、PDA培养基、高氏一号培养基上进行培养分离出内生细菌、内生真菌、内生放线菌，通过划线培养进行纯化，即得内生菌单菌落。
实施例2
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
(1)植物组织预处理
植物组织用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤2-3次，晾干表面水分，将其切割成1.3cm的小段，然后把切好的材料置于体积浓度为73％乙醇消毒3-5min，无菌水清洗2-3次，再用体积浓度为0.2％升汞浸泡1-3min或者质量浓度为5％次氯酸钠浸泡5-10min，接着用无菌水冲洗3-5次，晾干表面水分后备用；
(2)植物组织培养
将消毒后的植物组织置于MS培养基上，进行无菌培养1-2周，直至植物组织恢复生长；培养条件为温度25℃，湿度50％，光照强度3000Lux，光照时间10-12h/d；
(3)内生菌的分离
组织培养后的植物组织，在无菌条件下粉碎，而后在消毒过的研钵中研磨，将渗出液用无菌水稀释3倍，各取150uL稀释液分别涂布于牛肉蛋白胨培养基、PDA培养基、高氏一号培养基上进行培养分离出内生细菌、内生真菌、内生放线菌，通过划线培养进行纯化，即得内生菌单菌落。
实施例3
一种植物内生菌的分离方法，包括以下步骤：
(1)植物组织预处理
植物组织用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤2-3次，晾干表面水分，将其切割成2.0cm的小段，然后把切好的材料置于体积浓度为75％乙醇消毒3-5min，无菌水清洗2-3次，再用体积浓度为0.3％升汞浸泡1-3min或者质量浓度为6％次氯酸钠浸泡5-10min，接着用无菌水冲洗3-5次，晾干表面水分后备用；
(2)植物组织培养
将消毒后的植物组织置于MS培养基上，进行无菌培养1-2周，直至植物组织恢复生长；培养条件为温度30℃，湿度70％，光照强度6000Lux，光照时间12-14h/d；
(3)内生菌的分离
组织培养后的植物组织，在无菌条件下粉碎，而后在消毒过的研钵中研磨，将渗出液用无菌水稀释5倍，分别取200uL稀释液涂布于牛肉蛋白胨培养基、PDA培养基、高氏一号培养基上进行培养分离出内生细菌、内生真菌、内生放线菌，通过划线培养进行纯化，即得内生菌单菌落。
实施例4
一种植物内生菌的分离方法，步骤(2)组织培养过程中不进行光照，其他操作同实施例1。
实施例5
一种植物内生菌的分离方法，步骤(2)组织培养过程中光照强度为400Lux，其他操作同实施例2。
实施例6
一种植物内生菌的分离方法，步骤(2)组织培养过程中光照强度为800Lux，其他操作同实施例3。
本发明所述的内生菌分离方法对不同植物内生菌的分离效果
对橡胶树幼嫩枝条内生菌的分离效果
实验组取橡胶树幼嫩枝条，采用实施例2的方法，在MS培养基上培养1-2周后，采用划线培养的方法纯化，分离其内生菌。根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿度等特征判断分离出的菌落种类并计数。对照组以常规方法分离橡胶树幼嫩枝条内生菌。实验组和对照组均设置3个重复。从橡胶树幼嫩枝条中分离的各种内生菌的统计结果如表1所示。
表1橡胶幼嫩枝条中分离内生菌的统计结果
表1中的结果表明，采用本发明分离橡胶树幼嫩枝条内生菌，分得的内生真菌种类、内生细菌种类及内生放线菌种类均明显多于常规的分离方法，而分离的内生菌总数比常规分离方法多47.1％，能够最大限度地分离橡胶树幼嫩枝条的内生菌。
对甘蔗根内生菌的分离效果
实验组取甘蔗根幼嫩部位，采用实施例6的方法，在MS培养基上培养1-2周后，采用划线培养的方法纯化、分离其内生菌。根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿度等特征判断分离出的菌落种类并计数。对照组以常规方法分离甘蔗根内生菌。实验组和对照组均设置3个重复。从甘蔗根中分离的内生菌的统计结果如表2所示。
表2甘蔗根中分离内生菌的统计结果
表2结果表明，采用本发明分离甘蔗根内生菌，分得的内生真菌种类、内生细菌种类及内生放线菌种类均多于常规的分离方法，而分离的内生菌总数比常规分离方法多36.8％，能够最大限度地分离甘蔗根的内生菌。
对菊花茎内生菌分离效果
实验组取菊花茎幼嫩部位，采用实施例1的方法，在MS培养基上培养1-2周后，采用划线培养的方法纯化、分离其内生菌。根据菌落形态、颜色、边缘状态、透明度、表面干湿度等特征判断分离出的菌落种类并计数。对照组以常规方法分离菊花茎内生菌。实验组和对照组均设置3个重复。从菊花幼茎中分离的各种内生菌的统计结果如表3所示。
表3菊花茎中分离内生菌的统计结果
表3结果表明，采用本发明分离菊花茎内生菌，分得的内生真菌种类、内生细菌种类及内生放线菌种类均多于常规的分离方法，而分离的内生菌总数比常规分离方法多32.1％，能够最大限度地分离菊花茎的内生菌。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种植物内生菌的分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)植物组织预处理
植物组织用自来水冲洗干净后再用无菌水洗涤，晾干表面水分后将其切段，长度0.5-2.0cm，然后把切好的材料置于体积浓度70-75％乙醇消毒3-5min，无菌水清洗，再用体积浓度0.1-0.3％升汞浸泡1-3min或者质量浓度4-6％次氯酸钠浸泡5-10min，接着用无菌水冲洗，晾干表面水分后备用；
(2)植物组织培养
将消毒后的植物组织置于培养基上，进行无菌培养，直至植物组织恢复生长；
(3)内生菌的分离
组织培养后的植物组织，在无菌条件下切碎或剪碎，而后在消毒过的研钵中研磨，将渗出液用无菌水稀释1-5倍，分别取100-200uL稀释液涂布于不同微生物培养基上进行培养、纯化，即得内生菌单菌落。
2.根据权利要求1所述的一种植物内生菌的分离方法，其特征在于：步骤(2)所用培养基为MS培养基。
3.根据权利要求1所述的一种植物内生菌的分离方法，其特征在于：步骤(2)培养条件为温度15-30℃，湿度20-70％。
4.根据权利要求3所述的一种植物内生菌的分离方法，其特征在于：培养植物茎、叶、花、果实时，控制光照强度1000-6000Lux，光照时间8-14h/d；培养植物根时，控制光照强度0-800Lux。
5.根据权利要求1所述的一种植物内生菌的分离方法，其特征在于：步骤(3)内生菌培养基为内生细菌培养基、内生真菌培养基、内生放线菌培养基。
6.根据权利要求5所述的一种植物内生菌的分离方法，其特征在于：步骤(3)内生细菌培养基为牛肉蛋白胨培养基，内生真菌培养基为PDA培养基，内生放线菌培养基为高氏一号培养基。
7.根据权利要求1所述的一种植物内生菌的分离方法，其特征在于：步骤(3)所述纯化内生菌的方法为划线培养法。
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