CN112877263A - 一种汉麻内生菌的分离方法 - Google Patents
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Abstract
一种汉麻内生菌的分离方法，它涉及一种汉麻内生菌的分离方法。本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一汉麻内生菌的分离方法。为植物病害的生物防治提供了理论基础，为开发潜在有利的新型药用化合物提供科学依据。方法：一、样品的采集；二、样品预处理；三、表面消毒；四、汉麻内生菌分离纯化。本发明用于汉麻内生菌的分离。
Description
技术领域
本发明涉及一种汉麻内生菌的分离方法。
背景技术
植物内生菌的种类和数量受宿主植物种类和外在环境影响很大。不同植物菌种不同，同种植物不同地点、不同温度、不同环境菌种不同，即使同一植物不同时间菌种也会不同。内生菌的这个特点使得菌种更加多种多样。内生菌一词最早来源于19世纪，100多年前Vogl从黑麦草种子中分离内生菌，但其生长环境独特，其存在一直被人们所忽视。直到1993年美国学者从短叶紫衫树皮的内生菌次级代谢物中分离出紫杉醇和紫杉烷类化合物后，药用植物内生菌的研究才开始受到普遍的关注。作为一种微生物新资源，其生长周期短、代谢易于控制、菌种易于选育及可通过大规模发酵实现工业化生产等的优点使人们对其日益关注，从中寻找活性成分逐渐成为研宄的热点。
汉麻是桑科属一年生草本植物，英文名Hemp，世界各地均有栽培。麻仁润滑肠道，通便，雌花和叶止咳定喘，解痉止痛。大麻纤维具有抗菌、除臭的作用，根据国内外有关研究报告，大麻纤维制品对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌，白色念珠菌等有明显的杀灭、抑制作用。大麻作物生长无需任何化学物质，自身既可抵御各种病虫害，是典型的绿色环保作物，更是一种天然的抑菌剂。
1998年根据加拿大受管制药物和物质法，工业大麻作为大田作物开始商业种植。2009年汉麻的种子和纤维，用于多工业用途如油、外用软膏、服装的纤维、家庭的建筑材料、制造电动汽车零部件。自加拿大合法化以来，工业用地总面积达到3200公顷～44000公顷，大麻产量稳步增长。2011年在加拿大，45种工业大麻被加拿大卫生部授权THC低于0.3％，这些品种一般都是谷物或多用途，种子和茎都找到了终端市场。McPartland等人在2000年发现在大麻的成长阶段不易受病虫的侵害。2012年Muhammad研究发现大麻叶提取物具有杀根结线虫且促进植物生长的作用。2013年Gautam等发现药用野生大麻中含有内生真菌和细菌有益于其相关的寄主植物生长。
汉麻次生代谢产物的生产途径有三种：直接从汉麻中提取次生代谢产物代谢产物，但是次生代谢产物在植物中含量一般较低，栽培过程中各种影响因素不易控制，有效成分含量低，品种品质不稳定，大量使用人力、物力及财力等；化学合成模拟，在完全了解次生代谢产物在植物体外的反应步骤后，利用化学工业，完全合成或半化学合成次生代谢产物，但是采用化学合成的方法，会遇到收率低、成本高、毒性大、工艺流程复杂、产生同分异构体及环境污染等问题；微生物(细菌或真菌)发酵，微生物具有惊人的繁殖速度和非常旺盛的生命力，可以在几十分钟内完成一个繁殖周期，且分布广。自从1993年，Strobel等从短叶红豆杉的韧皮部中分离出一株能产生紫杉醇的内生真菌Taxomyces andreanae以来，利用植物内生真菌发酵法获得与宿主相同或相似次生代谢产物已成为研究热点。汉麻中内生菌的发现为我们筛选具有抑菌活性的内生菌奠定了理论基础。因此，本研究旨在从汉麻中分离内生菌，为植物病害的生物防治提供了理论基础，为开发潜在有利的新型药用化合物提供科学依据。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺点与不足，提供一汉麻内生菌的分离方法。为植物病害的生物防治提供了理论基础，为开发潜在有利的新型药用化合物提供科学依据。
本发明一种汉麻内生菌的分离方法具体按以下步骤进行：
一、样品的采集：从植株茂盛、无病虫害的汉麻上采集新鲜的叶，每株采集4～5片；
二、样品预处理：将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其叶切成0.25cm×0.25cm的组织块，对组织块的表面进行处理后，表面干燥，得到预处理后的叶片；
三、表面消毒：先用自来水将预处理后的叶片冲洗干净，然后采用下述方法进行表面消毒：先采用0.1％升汞溶液漂洗10～30s，再采用无菌水冲洗3～5次，然后采用75％酒精漂洗30～60s，最后再采用无菌水冲洗3～5次，该次无菌水冲洗后的无菌水保留；在无菌操作条件下将清洗后的叶片切成0.2cm×0.2cm长段，种植于PDA培养基中，在温度为27～29℃的条件下置于温箱静止培养5～7d；然后将保留的冲洗后的无菌水涂于PDA培养基中，继续在温度为27～29℃条件下置于温箱培养，直至表面消毒完全，得到消毒好的叶；
四、汉麻内生菌分离纯化：将消毒好的叶切成小块后分成两份，一份接种于真菌分离培养基中进行组织培养，一份接种于细菌分离培养基中进行组织培养；组织培养方式：每个平板接种4～5个组织块，接种5个平板，将其分成两组分别置于28℃和37℃恒温培养箱中培养3～7d；待组织块周围长出菌落后，采用接种环挑取不同的菌落，划线法接种于同种平板培养基中进行分离培养，反复接种2～3次后，挑取单菌落的菌丝体或细胞在显微镜下观察无杂菌即可确定为纯种菌株；最后将分离纯化的菌株分类合并接种试管斜面培养基中编号保藏。
本发明的有益效果：
本发明为筛选的汉麻内生菌提供了基础，为后续筛选具有拮抗作用的汉麻内生菌奠定了理论依据。对减少和代替农药的使用具有重要的意义。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式一种汉麻内生菌的分离方法具体按以下步骤进行：
一、样品的采集：从植株茂盛、无病虫害的汉麻上采集新鲜的叶，每株采集4～5片；
二、样品预处理：将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其叶切成0.25cm×0.25cm的组织块，对组织块的表面进行处理后，表面干燥，得到预处理后的叶片；
三、表面消毒：先用自来水将预处理后的叶片冲洗干净，然后采用下述方法进行表面消毒：先采用0.1％升汞溶液漂洗10～30s，再采用无菌水冲洗3～5次，然后采用75％酒精漂洗30～60s，最后再采用无菌水冲洗3～5次，该次无菌水冲洗后的无菌水保留；在无菌操作条件下将清洗后的叶片切成0.2cm×0.2cm长段，种植于PDA培养基中，在温度为27～29℃的条件下置于温箱静止培养5～7d；然后将保留的冲洗后的无菌水涂于PDA培养基中，继续在温度为27～29℃条件下置于温箱培养，直至表面消毒完全，得到消毒好的叶；
四、汉麻内生菌分离纯化：将消毒好的叶切成小块后分成两份，一份接种于真菌分离培养基中进行组织培养，一份接种于细菌分离培养基中进行组织培养；组织培养方式：每个平板接种4～5个组织块，接种5个平板，将其分成两组分别置于28℃和37℃恒温培养箱中培养3～7d；待组织块周围长出菌落后，采用接种环挑取不同的菌落，划线法接种于同种平板培养基中进行分离培养，反复接种2～3次后，挑取单菌落的菌丝体或细胞在显微镜下观察无杂菌即可确定为纯种菌株；最后将分离纯化的菌株分类合并接种试管斜面培养基中编号保藏。
本实施方式步骤三所述的表面消毒有效性检测：为了检验材料组织表面消毒是否全面，分别设置两组对照实验，第一组取表面消毒完毕后最后一次清洗组织材料的无菌水涂布于平板培养基上，设置3个平行；第二组将消毒后的组织材料置于平板培养基上与培养基接触几分钟后取出，设置3个平行。将两组平板倒置于相同条件的恒温培养箱中培养三天，观察平板中是否有菌生长，无菌则消毒彻底，有菌则消毒不彻底，需重新分离纯化。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：7步骤一中采集的样品先采用75％乙醇擦拭样品表面，或短时间浸泡、灼烧，使表面干燥后，用石蜡封住切口，放入无菌塑料袋，并保存于低温盒中。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一或二不同的是：步骤一中采集的样品当需要保存时，其保存温度为4℃。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是：步骤三中先用自来水将预处理后的叶片冲洗的冲洗时间为20min。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是：步骤三中所述PDA培养基中土豆的量为200g/L，葡萄糖量为20g/L，琼脂的量为18g/L。其他与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是：步骤四中所述真菌分离培养基中土豆的量为200g/L，葡萄糖的量为20g/L，琼脂的量为18g/L。其他与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是：步骤四中所述细菌分离培养基中胰蛋白胨的量为15g/L，大豆胨的量为5g/L，氯化钠的量为3g/L，琼脂的量为15g/L。其他与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是：步骤四中所述细菌分离培养基的pH为7.2～7.4。其他与具体实施方式一至七之一相同。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
实施例一：一种汉麻内生菌的分离方法具体按以下步骤进行：
一、样品的采集：从植株茂盛、无病虫害的汉麻上采集新鲜的叶，每株采集4～5片；
二、样品预处理：将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其叶切成0.25cm×0.25cm的组织块，对组织块的表面进行处理后，表面干燥，得到预处理后的叶片；
三、表面消毒：先用自来水将预处理后的叶片冲洗干净，然后采用下述方法进行表面消毒：先采用0.1％升汞溶液漂洗10～30s，再采用无菌水冲洗3～5次，然后采用75％酒精漂洗30～60s，最后再采用无菌水冲洗3～5次，该次无菌水冲洗后的无菌水保留；在无菌操作条件下将清洗后的叶片切成0.2cm×0.2cm长段，种植于PDA培养基中，在温度为27～29℃的条件下置于温箱静止培养5～7d；然后将保留的冲洗后的无菌水涂于PDA培养基中，继续在温度为27～29℃条件下置于温箱培养，直至表面消毒完全，得到消毒好的叶；
四、汉麻内生菌分离纯化：将消毒好的叶切成小块后分成两份，一份接种于真菌分离培养基中进行组织培养，一份接种于细菌分离培养基中进行组织培养；组织培养方式：每个平板接种4～5个组织块，接种5个平板，将其分成两组分别置于28℃和37℃恒温培养箱中培养3～7d；待组织块周围长出菌落后，采用接种环挑取不同的菌落，划线法接种于同种平板培养基中进行分离培养，反复接种2～3次后，挑取单菌落的菌丝体或细胞在显微镜下观察无杂菌即可确定为纯种菌株；最后将分离纯化的菌株分类合并接种试管斜面培养基中编号保藏。
本实施例为筛选的汉麻内生菌提供了基础，为后续筛选具有拮抗作用的汉麻内生菌奠定了理论依据。对减少和代替农药的使用具有重要的意义。
Claims (8)
1.一种汉麻内生菌的分离方法，其特征在于汉麻内生菌的分离方法具体按以下步骤进行：
一、样品的采集：从植株茂盛、无病虫害的汉麻上采集新鲜的叶，每株采集4～5片；
二、样品预处理：将采集好的新鲜植物用清水洗净并将其叶切成0.25cm×0.25cm的组织块，对组织块的表面进行处理后，表面干燥，得到预处理后的叶片；
三、表面消毒：先用自来水将预处理后的叶片冲洗干净，然后采用下述方法进行表面消毒：先采用0.1％升汞溶液漂洗10～30s，再采用无菌水冲洗3～5次，然后采用75％酒精漂洗30～60s，最后再采用无菌水冲洗3～5次，该次无菌水冲洗后的无菌水保留；在无菌操作条件下将清洗后的叶片切成0.2cm×0.2cm长段，种植于PDA培养基中，在温度为27～29℃的条件下置于温箱静止培养5～7d；然后将保留的冲洗后的无菌水涂于PDA培养基中，继续在温度为27～29℃条件下置于温箱培养，直至表面消毒完全，得到消毒好的叶；
四、汉麻内生菌分离纯化：将消毒好的叶切成小块后分成两份，一份接种于真菌分离培养基中进行组织培养，一份接种于细菌分离培养基中进行组织培养；组织培养方式：每个平板接种4～5个组织块，接种5个平板，将其分成两组分别置于28℃和37℃恒温培养箱中培养3～7d；待组织块周围长出菌落后，采用接种环挑取不同的菌落，划线法接种于同种平板培养基中进行分离培养，反复接种2～3次后，挑取单菌落的菌丝体或细胞在显微镜下观察无杂菌即可确定为纯种菌株；最后将分离纯化的菌株分类合并接种试管斜面培养基中编号保藏。
2.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤一中采集的样品先采用75％乙醇擦拭样品表面，或短时间浸泡、灼烧，使表面干燥后，用石蜡封住切口，放入无菌塑料袋，并保存于低温盒中。
3.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤一中采集的样品当需要保存时，其保存温度为4℃。
4.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤三中先用自来水将预处理后的叶片冲洗的冲洗时间为20min。
5.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤三中所述PDA培养基中土豆的量为200g/L，葡萄糖量为20g/L，琼脂的量为18g/L。
6.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤四中所述真菌分离培养基中土豆的量为200g/L，葡萄糖的量为20g/L，琼脂的量为18g/L。
7.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤四中所述细菌分离培养基中胰蛋白胨的量为15g/L，大豆胨的量为5g/L，氯化钠的量为3g/L，琼脂的量为15g/L。
8.根据权利要求1所述的汉麻内生菌的分离方法，其特征在于步骤四中所述细菌分离培养基的pH为7.2～7.4。
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