CN113773967B - 一种致密链格孢菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种致密链格孢菌及其应用，属于微生物技术领域。该致密链格孢菌(Alternaria compacta)，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23046。本发明致密链格孢菌的液体培养物对于玉米大斑病菌、苍术枯萎病病原菌、丹参枯萎病病原菌和丹参根腐病病原菌这4株真菌具有显著的抑制作用，应用前景广泛。

Description

一种致密链格孢菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种致密链格孢菌及其在抑菌方面的应用。
背景技术
链格孢属(Altemaria spp.)隶属于真菌界、子囊菌门、子囊菌亚门、座囊菌纲、格孢腔目、孢腔菌科。属内有50多个种，致密链格孢菌(Alternaria compacta)是最常见的一种。链格孢菌作为自然生态系统和农业生态系统中的重要成员．既可引起植物害。又可以作为有用的生物资源为人类所利用。其在生物防治、生物除草剂、环境废弃物处理、品种选育等方面已经显现出可利用的广阔前景。
玉米大斑病又被叫做死叶病和叶斑病，是由真菌玉米大斑病菌引起的。玉米大斑病菌的无性态(Exserohilum turcicum)为玉米大斑凸脐蠕孢菌，属无性菌类凸脐蠕孢属；有性态(Setosphaeria turcica)为大斑刚毛座腔茵，属子囊菌门毛球腔菌属。玉米大斑病是一种主要危害玉米子叶的玉米病害，通常情况下不会危害其他部位，但病情发展严重时其他部位也会被侵染，玉米植株侵染时，病原菌一般从玉米底部的叶片开始侵染出现患病症状，但也有从玉米中部的叶片开始侵染的特殊情况。在玉米大斑病横行的年份，大面积玉米叶片枯萎，使玉米的生长发育受到严重影响。玉米果实秃尖，灌浆差籽粒干瘪，千粒重下降，其使品质和产量下降。严重时玉米的产量会减少50%以上。
苍术枯萎病主要由真菌腐皮镰刀菌 (Fusarium solani)引起，苍术受害后，最初是下部叶片失绿，然后逐渐向上蔓延，使整株叶片发黄枯死、叶不脱陪。有时植株的个别枝条半边出现黄叶症状，以后发展到全株。剖视病株基部，维管束褐色。在土填和病株根茎上越冬。该病一般次年病菌从近地面的伤口或根部侵入，6月下开始发病，一直为害到9月下旬。近年来随着茅苍术野生转家种，以及规模化种植面积的增加，其病害问题日渐突出，发病后一般田块产量损失10％～30％，严重时田块造成大面积绝收。
丹参枯萎病病原菌主要有尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum)和链格孢属(Alternaria sp.)；丹参根腐病病原菌主要为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)和腐皮镰刀菌(Fusarium solani)。随着连作和种植年限的延长，丹参根部病害严重发生，主要有枯萎病和根腐病，2种病害通常混合发生。病菌侵袭丹参植株后会导致植株根系腐烂，叶片枯黄，严重时植株大面积枯死，丹参严重减产，有效成分降低。
种植业的高速发展，有效地缓解了相关产业链需求紧张的问题，但大面积集中生产的方式导致田间病害发生和传播蔓延的加剧。通过研究表明，在植物病害中，70%～80%的病害是病原真菌侵染所引起的。近年来，大量研究表明生物防治不仅对病原菌具有抑制作用，并且对环境友好没有污染，因此生物防治植物病害的研究受到科研工作者们越来越多的关注。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种致密链格孢菌及其应用，该菌株具有易于培养、产量高、培养性状稳定等的特点，其培养物对上述4株植物病原真菌具有较高的抑菌活性。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23046。
本发明同时提供所述的致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013在制备抑菌剂中的应用。
进一步，优选的是，所述的抑菌剂抑制的真菌为玉米大斑病菌、苍术枯萎病病原菌、丹参枯萎病病原菌或丹参根腐病病原菌。
进一步，优选的是，所述的抑菌剂中的活性成分包括所述的致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013培养物。
进一步，优选的是，所述的抑菌剂中的活性成分包括致密链格孢菌(Alternariacompacta)XL-0013培养物的提取物；所述的提取物以致密链格孢菌(Alternariacompacta)XL-0013培养物为原料经有机溶剂萃取获得。
进一步，优选的是，所述有机溶剂为乙酸乙酯。
本发明还提供所述的致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013培养物的提取物。
本发明另外提供致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013培养物，所述的致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013培养物为所述的致密链格孢菌(Alternariacompacta)XL-0013液体培养物；
培养方法为：将致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；
配制PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入PDB液体培养基，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物；
所述PDA斜面培养基含有：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2；
所述PDB液体培养基含有：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
本发明所述的致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013培养物还可以以致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013为原料，以本领域常规的PDA培养基、PDB培养基等进行培养获得。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明提供一种致密链格孢菌及其应用，本发明致密链格孢菌XL-0013的液体培养物对于玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica，NB-06)、苍术枯萎病病原菌(Fusariumsolani，YB-02)、丹参枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum，YB-03)、丹参根腐病病原菌(Fusarium solani，YB-04)这4株真菌具有显著的抑制作用，其抑菌率能最高可达到50％，应用前景广泛。
附图说明
图1为致密链格孢菌XL-0013的单菌落形态图(PDA平板)；其中，图1-A为平板正面图；图1-B为平板背面图。
图2为致密链格孢菌XL-0013对4株植物病原真菌的抑制作用(PDA平板)；其中，图2-A为平板正面图；图2-B为平板背面图
致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23046，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
实施例1致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013的来源及鉴定
①致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013的来源
2017年9月4日从辽宁省沈阳药科大学植物园采摘的罗勒中分离到一株真菌，命名为XL-0013。
②XL-0013的鉴定
XL-0013的ITS测序序列见序列表（SEQ ID NO.1），与Sequence ID: MW008978.1的序列相似性最高，相似性为100.00％。
根据以上鉴定结果，XL-0013属于致密链格孢菌(Alternaria compacta)。
实施例2致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013的主要形态特征
将致密链格孢菌XL-0013接于马铃薯葡萄糖培养基上，28℃恒温培养，菌落初期为白色，呈放射状扩展，菌丝体茂密，菌落圆形，边缘整齐，气生菌丝发达，3d后菌落颜色逐渐变深，慢慢变为灰褐色至黑色。分生孢子梗暗色，单支，长短不一，顶生分生孢子。分生孢子暗色，有1到7个横膈膜，0到4个纵隔膜，倒棍棒形，椭圆形或卵形，平均大小为6.3-15.2um×22.4-50.6um。
所述PDA培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。
该菌株在PDA平板单菌落形态图见图1，图1-A为图1-A为平板正面图；图1-B为平板背面图
实施例3致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013对病原真菌抑菌率测定
采用平板对峙法测定待筛真菌(致密链格孢菌XL-0013)对供试真菌(十数株病原真菌)的抑菌能力，具体方法如下：
配制PDA平板，分别培养待筛真菌和供试真菌，待菌落直径达到70-80mm后，然后用灭菌的5mm的打孔器，分别在两种培养基生长一致的部位打孔(距皿边缘等距离)。在PDA空平板上，分别用灭菌的小镊子挑取打孔的培养基块，在距离平板中心同一直线上约为3cm处，分别反转接种两种真菌，然后每24小时度量一次抑菌圈大小(十字交叉法)。依据以下公式计算抑菌率：
抑菌率＝[(对照菌落直径-5)-(处理菌落直径-5)]÷(对照菌落直径-5)×100％
注：“5”为打孔器所取菌落的直径。
致密链格孢菌XL-0013对不同病原真菌抑制率见表1(表中只记载了待筛真菌对供试真菌抑制率高于20％的供试真菌)。
表1致密链格孢菌XL-0013对不同病原真菌的抑制作用
其中，NB-06为玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)，YB-02为苍术枯萎病病原菌(Fusarium solani)，YB-03为丹参枯萎病病原菌(Fusarium oxysporum)，YB-04为丹参根腐病病原菌(Fusarium solani)。
由表1可见，XL-0013对4株植物病原真菌抑菌活性较强，其中对的苍术枯萎病病原菌(Fusarium solani，YB-02)抑菌率最高，为50.75％。
该菌株对4株植物病原真菌在PDA平板的抑制作用见图2，平板上半部分为4株植物病原真菌，下半部分为致密链格孢菌XL-0013，其中，图2-A为平板正面图；图2-B为平板背面图。由图2可见，致密链格孢菌XL-0013对4株植物病原真菌表现出明显的抑制作用。
实施例4致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013的液体培养
菌株的活化：将保藏的致密链格孢菌XL-0013划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；
菌株的液体培养：配制200ml/瓶的PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入液体摇瓶，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物(即发酵液)。
所述PDA斜面培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。
所述PDB液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH值自然。
实施例5致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013乙酸乙酯粗提物的制备
取实施例4的发酵液用等体积乙酸乙酯进行萃取，方法为：振荡30min，使发酵液与乙酸乙酯充分混合后，静置24h分液后，取出乙酸乙酯相即上层相，42℃减压旋蒸（真空度一般为﹣0.08Mpa～﹣0.01MPa），利用旋转蒸发仪将溶剂完全蒸干，得到菌液乙酸乙酯粗提物，置4℃冰箱保藏备用。
实施例6致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013乙酸乙酯粗提物的MIC和MBC值的测定
取实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物采用96孔板法进一步测定其最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC），具体方法如下：
①供试菌液的培养：将保藏的供试真菌(4株病原真菌)划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天后，将生长好的斜面直接接入备用PDB液体培养基中，置于28℃，180rpm摇床中培养48h，取出备用，即得供试菌液。
②样品溶液的配置：取1mg实施例5的菌液乙酸乙酯粗提物，加入100uLDMSO使其充分溶解，再用DMSO定容，得到100ug/mL的样品溶液。
③96孔板法测定MIC和MBC：取无菌96孔板，1-7孔中分别加入100μL的PDB液体培养基，取样品溶液100μL加到1号孔中，混匀（浓度为50ug/mL），从1号中取出100μL加到2号孔中，混匀，依次稀释到7号孔，7号孔中取出100μL弃去。1-7号孔中样品浓度依次为50、25、12.5、6.25、3.125、1.563和0.7815ug/mL，再分别加入100μL的供试菌液。同一块96孔板上，以加100μLDMSO的小孔作为空白对照，以不加样品溶液只加100μL供试菌液的小孔作为阳性对照，以不加供试菌液只加100μL PDB液体培养基的小孔作为阴性对照。观察孔中培养液澄清的最低浓度为MIC，取小孔液体澄清的50μL液体涂布到PDA培养基上，28℃倒置培养48小时，重复三次，PDA培养基上完全没有细菌生长的最低浓度为MBC。
所述PDA培养基配方：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2。
所述PDB液体培养基配方：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L，pH值自然。
致密链格孢菌XL-0013对不同病原真菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）见表2。
表2致密链格孢菌XL-0013对不同病原真菌的最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）
由表2可见，本发明致密链格孢菌XL-0013液体培养物的乙酸乙酯粗提物对于玉米大斑病菌、苍术枯萎病病原菌、丹参枯萎病病原菌和丹参根腐病病原菌这4株真菌具有显著的抑制作用。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
<110> 杨凌未来中科环保科技有限公司
<120> 一种致密链格孢菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 546
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
ggttctcatt gaggcgggct ggacctctcg gggttacagc cttgctgaat tattcaccct 60
tgtcttttgc gtacttcttg tttccttggt gggttcgccc accactagga caaacataaa 120
ccttttgtaa ttgcaatcag cgtcagtaac aaattaataa ttacaacttt caacaacgga 180
tctcttggtt ctggcatcga tgaagaacgc agcgaaatgc gataagtagt gtgaattgca 240
gaattcagtg aatcatcgaa tctttgaacg cacattgcgc cctttggtat tccaaagggc 300
atgcctgttc gagcgtcatt tgtaccctca agctttgctt ggtgttgggc gtcttgtctc 360
tagctttgct ggagactcgc cttaaagtaa ttggcagccg gcctactggt ttcggagcgc 420
agcacaagtc gcactctcta tcagcaaagg tctagcatcc attaagcctt tttttcaact 480
tttgacctcg gatcaggtag ggatacccgc tgaacttaag catatctaaa ggggggaaga 540
aaatga 546

Claims (2)

1.一种致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013，已于2021年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号CGMCC No.23046。
2.致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013的培养物，其特征在于，所述的致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013培养物为权利要求1所述的致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013液体培养物；
培养方法为：将致密链格孢菌(Alternaria compacta)XL-0013划线接种于PDA斜面培养基上，置于28℃培养箱中培养3-5天；
配制PDB液体培养基，将生长好的斜面直接接入PDB液体培养基，置于28℃、180rpm摇床中培养15-20天，取出，即得液体培养物；
所述PDA斜面培养基含有：马铃薯浸粉3g/L，葡萄糖20g/L，琼脂14g/L，pH值5.6±0.2；
所述PDB液体培养基含有：马铃薯浸粉5g/L，葡萄糖15g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。
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