CN103232942A - 绣线菊内生真菌的抗植物病原菌发酵液的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及绣线菊内生真菌的抗植物病原菌发酵液的制备方法，所述绣线菊内生真菌命名为链格孢XXB07，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年3月08日，保藏编号为CGMCCNo.7292。该方法包括以下操作步骤：1.菌株活化，2.种子培养，3.发酵培养，得到绣线菊内生真菌发酵液，该发酵液在无菌条件下过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到绣线菊内生真菌的抗菌发酵液。本发明明确了具有抗菌活性的链格孢XXB07菌株的抗菌发酵液的制备方法，通过对链格孢XXB07抗菌发酵液的抗菌试验，发现该菌发酵液洗脱物和菌丝体提取物对辣椒疫霉植物病原真菌具有抑制菌丝生长作用。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，涉及一种发酵培养方法，具体涉及绣线菊内生真菌的抗菌发酵液的制备方法。
背景技术
随着社会的发展及人类对环境和生态认识的提高，人们对农药的认识程度也越来越深，认识到人类不但需要农药，而且意识到合成农药的广泛使用会带来很大的弊病。在保护生态环境的大背景下，生物防治异军突起，而作为生物防治重要内容的农用抗生素，由于其合成农药无法比拟的优越性，已越来越受到人们的重视。由于微生物农药具有对环境安全、无公害、无残留、不易产生抗性、生产成本低、发酵工艺简单、对非靶标生物安全等特点，在开展生物防治中将大显身手。作为微生物农药来源之一的植物内生真菌(Endophytic fungi)与宿主植物具有协同进化作用，它们已经形成互惠共生关系。一方面宿主植物本身产生的光合产物可为内生真菌提供足够的营养供其生长，另一方面内生真菌产生的代谢产物常包含一些促生及抗菌的活性物质，促进植物生长发育，提高植物抗逆境，抗胁迫和抗病害能力。因此，植物内生真菌的次生代谢产物可以作为新化合物、新药物筛选的潜在或替代资源，从而可以有效降低新药物或其它用途活性物质的研发成本。
绣线菊属蔷薇科绣线菊亚科绣线菊属(Spiraea) 落叶直立灌木，主要分布于北温带地区。我国拥有丰富的绣线菊属植物资源,是该属的现代分布和分化中心，且物种的多样性和丰富度都很高。其根、叶、果实可作兽药，配以它药可治痈肿疮疡、咽喉肿痛、风热痒症，在民间具有悠久的应用历史。苗医在治疗消化系统疾病时也把绣线菊作为常用药。根据植物内生真菌内共生理论，绣线菊很有可能存在着特殊的内生真菌，能够产生特殊的具有抗菌活性的天然成分，为新型“绿色”农药提供理论依据和物质基础。目前，国内外对绣线菊内生真菌对植物病原菌抑菌活性的研究报道较少。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有较强的抑制植物病原真菌活性的绣线菊内生真菌抗菌发酵液的制备方法。
本发明所述的绣线菊内生真菌命名为链格孢菌XXB07（Alternaria sp. XXB07），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2013年3月08日，保藏编号为CGMCC No.7292；
本发明所描述的绣线菊内生真菌系从中国安徽省合肥市绣线菊 (Solidgo canadensis)植物活体中分离得到的。
绣线菊内生真菌序列与Genbank数据库已知序列比对后，通过MEGA5.0软件构建系统发育树该菌为链格孢属，故命名为链格孢菌XXB07（Alternaria sp. XXB07），菌株ITS基因序列如下：
1 AAACCATGCT GCTGGACTCT CGGGGTTACA GCCTTGCTGA ATTATTCACC
51 CTTGTCTTTT GCGTACTTCT TGTTTCCTTG GTGGGTTCGC CCACCACTAG
101 GACAAACATA AACCTTTTGT AATTGCAATC AGCGTCAGTA ACAAATTAAT
151 AATTACAACT TTCAACAACG GATCTCTTGG TTCTGGCATC GATGAAGAAC
201 GCAGCGAAAT GCGATAAGTA GTGTGAATTG CAGAATTCAG TGAATCATCG
251 AATCTTTGAA CGCACATTGC GCCCTTTGGT ATTCCAAAGG GCATGCCTGT
301 TCGAGCGTCA TTTGTACCCT CAAGCTTTGC TTGGTGTTGG GCGTCTTGTC
351 TCTAGCTTTG CTGGAGACTC GCCTTAAAGT AATTGGCAGC CGGCCTACTG
401 GTTTCGGAGC GCAGCACAAG TCGCACTCTC TATCAGCAAA GGTCTAGCAT
451 CCACTAAGCC TTTTTTTCAA CTTTTGACCT CGGATCAGGT AGGGATACCC
501 GCTGAACTTA AGCATATCAA TAAGCGGAGG AA
本发明绣线菊内生真菌抗植物病原菌发酵液的具体发酵制备操作步骤如下：
（1）菌种活化
在无菌条件下，将绣线菊内生真菌的菌种，转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温培养5天，培养温度28℃±1℃，得到活化菌种；
（2）种子培养
用无菌打孔器将活化菌种打成直径为6mm菌碟，接种5块菌碟于含有50ml液体培养基内，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，得摇床种子；
（3）发酵培养
将摇床种子接种到装有50ml液体培养基中，接种量5%，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，培养7天，得到绣线菊内生真菌发酵液；过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到绣线菊内生真菌的抗菌发酵液；
发酵培养特征：培养第1天，菌体为少量灰色的细丝；培养第3天，灰色的细丝减少，出现黑色的小菌丝球；培养第5天，黑色菌丝球继续增多，并且体积变大，发酵液为灰黑色；培养第7天，出现大量黑色的菌丝球，体积也变大，发酵液为黑色；
所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水1升；
所述液体培养基：蛋白胨15克、葡萄糖 20克、氯化钙 0.5克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸亚铁 0.01克、硝酸钠1克和蒸馏水1升，pH=6.0。
本发明通过对链格孢菌XXB07的发酵产物的抗菌试验发现，该菌对辣椒疫霉植物病原真菌（Phytophthora capsici）具有较为明显的抑制菌丝生长作用。本发明利用植物内生真菌资源，以求获得抗植物病原真菌病害新型农用抗生素类天然成分。
本发明所述绣线菊内生真菌抗植物病原菌发酵产物的抗菌试验如下：
1.植物病原真菌：
辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）
2.病原微生物的培养
用接种环挑取少量病原菌的斜面培养物分别接入马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板活化，在（28±1）℃恒温箱中培养5天。
3.抑制菌丝生长速率法测定抗菌活性
在100毫升的无菌三角瓶中配制含有发酵液经树脂吸附后甲醇洗脱物的无菌混合培养基（最终浓度为200mg/l和500mg/l），及含菌丝体甲醇提取物的无菌混合培养基（最终浓度为200mg/l和500mg/l），分别各取15毫升置于直径为9厘米无菌培养皿内制成平板，冷却后在每个培养基平面放入1个供试病原菌菌饼（直径为6毫米），菌饼的菌丝面贴在培养基表面，将平板置于28±1℃培养96小时。采用十字交叉法测定菌落生长直径，用下述公式计算抑制率：
表1：本发明所述的链格孢菌XXB07发酵产物对辣椒疫霉植物病原微生物的抗菌结果
| 样品 | 抑制率（%） |
| 菌丝甲醇提取物(200mg/l) | 22.18±1.55 |
| 菌丝甲醇提取物(500mg/l) | 36.47±0.42 |
| 发酵液树脂吸附后甲醇洗脱物(200mg/l） | 37.39±0.42 |
| 发酵液树脂吸附后甲醇洗脱物(500mg/l) | 62.86±1.08 |
由上表1可见，本发明制备所得到的绣线菊内生真菌链格孢菌XXB07发酵物对供试植物病原真菌具有较好的抗菌活性。链格孢菌XXB07发酵原液经树脂吸附后甲醇洗脱物在浓度为200mg/l时对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）的菌丝生长抑制率为37.39%，在浓度为500mg/l时对辣椒疫霉病菌（Phytophthora capsici）的菌丝生长抑制率超过60%。链格孢菌XXB07菌丝甲醇提取物对供试植物病原真菌也有较强的抑菌活性。本发明利用植物内生真菌资源，通过发酵制备以求获得抗植物病原真菌病害新型农用活性的天然成分。
具体实施方式
实施例：
本实施例所用绣线菊内生真菌命名为链格孢XXB07（Alternaria sp. XXB07），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期2013年3月08日，保藏编号为CGMCC No.7292；
链格孢XXB07（Alternaria sp. XXB07）菌株，是发酵获得抗植物病害新型农用抗生素类活性成分的天然微生物药源。
绣线菊内生真菌的抗菌发酵液的具体制备操作步骤如下：
（1）菌种活化
在无菌条件下，将绣线菊内生真菌的菌种，转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温培养5天，培养温度28℃±1℃，得到活化菌种；
（2）种子培养
用无菌打孔器将活化菌种打成直径为6mm菌碟，接种5块菌碟于含有50ml液体培养基内，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，得摇床种子；
（3）发酵培养
将摇床种子接种到装有50ml液体培养基中，接种量5%，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，培养7天，得到绣线菊内生真菌发酵液；过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到绣线菊内生真菌的抗菌发酵液；
发酵培养特征：培养第1天，菌体为少量灰色的细丝；培养第3天，灰色的细丝减少，出现黑色的小菌丝球；培养第5天，黑色菌丝球继续增多，并且体积变大，发酵液为灰黑色；培养第7天，出现大量黑色的菌丝球，体积也变大，发酵液为黑色；
所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水1升；
所述液体培养基：蛋白胨15克、葡萄糖 20克、氯化钙 0.5克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸亚铁 0.01克、硝酸钠1克和蒸馏水1升，pH=6.0。
Claims (1)
1.绣线菊内生真菌的抗植物病原菌发酵液的制备方法，其特征在于：所述绣线菊内生真菌命名为链格孢菌XXB07（Alternaria sp. XXB07），保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2013年3月08日，保藏编号为CGMCC No.7292；
具体发酵制备操作步骤如下：
（1）菌种活化
在无菌条件下，将绣线菊内生真菌的菌种，转接于马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基平板中，恒温培养5天，培养温度28℃±1℃，得到活化菌种；
（2）种子培养
用无菌打孔器将活化菌种打成直径为6mm菌碟，接种5块菌碟于含有50ml液体培养基内，恒温摇床培养2天，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，得摇床种子；
（3）发酵培养
将摇床种子接种到装有50ml液体培养基中，接种量5%，摇床转速160转/分，温度28℃±2℃，培养7天，得到绣线菊内生真菌发酵液；过滤除去菌丝体，过0.22微米过滤器，即得到绣线菊内生真菌的抗菌发酵液；
发酵培养特征：培养第1天，菌体为少量灰色的细丝；培养第3天，灰色的细丝减少，出现黑色的小菌丝球；培养第5天，黑色菌丝球继续增多，并且体积变大，发酵液为灰黑色；培养第7天，出现大量黑色的菌丝球，体积也变大，发酵液为黑色；
所述马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基：马铃薯 200克、葡萄糖20克、琼脂20克、蒸馏水1升；
所述液体培养基：蛋白胨15克、葡萄糖 20克、氯化钙 0.5克、磷酸二氢钾0.1克、硫酸亚铁 0.01克、硝酸钠1克和蒸馏水1升，pH=6.0。
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