CN107502560A - 一种植物内生菌的富集分离技术及其应用 - Google Patents

一种植物内生菌的富集分离技术及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域。目的是提供一种高效筛选抗病原真菌的植物内生菌的富集分离技术及其应用。采用的技术方案是：该富集分离技术包括以下步骤：植物组织预处理、植物内生菌的富集、植物内生菌的分离纯化和检测植物内生菌的拮抗作用，通过预处理对植物组织表面进行灭菌，然后通过选择性的富集培养获得能够降解几丁质的植物内生菌群落，然后可通过分离纯化获得植物内生菌的纯培养。通过检测拮抗作用筛选出抗病原真菌的植物内生菌群落和纯菌株。本发明简单高效，节省了大量的人力物力，能够通过富集分离技术，快速筛选出植物内生菌中抗植物病原真菌的菌株。

Description

一种植物内生菌的富集分离技术及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种植物内生菌的富集分离技术及其应用。
背景技术
植物病害是植物栽培当前面临的一个主要问题，并且造成了全球作物总产量的10％损失。由于植物病害80％是由真菌引起的，目前采用的主要防治方法是化学防治，通过化学合成杀真菌剂消除和控制真菌病害。但化学杀真菌剂依赖于有限的几种作用模式，长期使用增加了对病原菌的选择压力，而最终导致其抗性产生。因此，在过去的40年中，化学真菌剂使用量增加了3倍，严重加剧了环境污染和退化问题。此外，化学杀真菌剂也会杀死土壤中有益的昆虫和微生物，由此进入食物链。而生物防治(使用微生物来控制植物病害)提供了一种可替代化学杀菌剂、环境友好的植物病原菌的防治策略。
内生菌，是指在其生活史的一定阶段或全部阶段，生活于植物的各种组织和器官的细胞间隙或细胞内的细菌。植物与内生菌在长期的共同进化中，形成了一种微妙的关系，内生菌已经成为植物微生态系统的天然组成成份，内生菌的存在可以促进植物对恶劣环境的适应，加强系统的生态平衡，保证寄生植物的健康生长。故内生菌的生物防治潜力受到人们越来越多的关注。
采用内生细菌作为生防因子相对于其它细菌而言有更大的优势：第一，内生细菌占有有利于生防的生态位：植物内生细菌分布于植物的不同组织中，有充足的营养物质，同时受到植物组织的保护作用，不易受外部恶劣环境如强烈日光、紫外线、风雨等的影响，具有稳定的生态环境，相对于其它外源细菌更易于发挥生防作用。第二，内生细菌可以经受住植物防卫反应的作用：病原物在侵染植物时，无论感病植株还是抗病植株，寄主植物或多或少地产生一些抗菌物质如植保素、病程相关蛋白、酚类化合物等，而内生细菌与植物长期地生活在一起，对植物产生的抗菌毒性物质有了耐性，相对于其它细菌作为生防菌更具有竞争性。第三，内生细菌与病菌可以直接相互作用：内生细菌系统地分布于植物体根茎叶花果实种子等的细胞或细胞间隙中，它可以直接面对病菌的侵染，对病菌的致病因子或病菌本身发起攻击，降解病菌菌丝或致病因子，产生拮抗物质，或诱导植物产生ISR抑制病菌生长。第四，内生细菌可以作为外源基因的载体：植物内生细菌不仅能主动进入植物体内定殖和传导，还能作为外源基因导入植物的良好载体。
在现有技术中，对于植物内生菌的分离工作，通常是对植物表面消毒后，采用分别对细菌、真菌和放线菌等进行选择培养的方式分离不同种类内生菌。如果要进一步获得某病原真菌的拮抗菌，就需要对分离得到的菌株再通过真菌抑制实验进行筛选。这种初始无定向的分离方法，在前期会分离得到数百甚至上千的菌株，此时对这些菌株进行真菌抑制实验，从中筛选出几株有抑制真菌活性的菌株，要耗费大量的时间、人力和物力，产出效率低下。如何快速地从内生菌中筛选分离出有效的生防菌，是生物防治推广和发展过程中需要解决的问题。
发明内容
本发明的目的是提供一种高效筛选抗病原真菌的植物内生菌的富集分离技术及其应用。
为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种植物内生菌的富集分离技术及其应用，包括以下步骤：
1)、植物组织预处理：将植物组织用自来水冲洗干净，然后采用无菌水洗涤，晾干表面水分；将晾干后的植物组织剪成2～3㎜的小段，用体积分数为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡5min，取出后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分备用；
2)、植物内生菌的富集：将表面消毒后的植物组织与以几丁质或其衍生物为唯一碳源的富集培养基相混合，在25℃条件下静止培养30d，获得可降解几丁质的微生物群落；
3)、检测植物内生菌的拮抗作用：采用平板对峙法，检测降解几丁质的微生物对植物病原真菌的拮抗作用，得到能够拮抗植物病原真菌的植物内生菌。
优选的：所述的植物内生菌的富集分离还包括植物内生菌的分离纯化：利用稀释平板法，将步骤2)得到的微生物群落涂布接种于以胶体几丁质为唯一碳源的固体富集培养基上，分离几丁质降解菌，将分离出的几丁质降解菌在该培养基上反复划线纯化。
优选的：将步骤2)富集得到的微生物群落以1:10的比例稀释进行多次传代培养，得到高效降解几丁质的植物内生菌菌群。
优选的：所述的植物组织采用小麦的根、茎或叶。
优选的：所述几丁质包括片状几丁质、几丁质粉末和胶体几丁质。
优选的：所述的几丁质衍生物为乙二醇几丁质、壳聚糖、乙二醇壳聚糖、几丁质寡糖或壳聚糖寡糖中的一种或几种。
优选的：所述的富集培养基的制备方法如下：
a、配置溶液Ⅰ：按以下质量体积分数配置：0.1％Na3C6H5O7·2H2O、1.4％K2HPO4、0.6％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4和水；
b、配置溶液Ⅱ：按以下质量体积分数配置：0.02％MgSO4·7H2O和水；
c、配置溶液Ⅲ：按以下质量体积分数配置：1.1％几丁质粉末或其衍生物粉末和水；
d、混合：分别对溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ进行灭菌处理，然后按照10:1:89的比例混合均匀。
优选的：所述的固体富集培养基中采用的几丁质或其衍生物为胶体几丁质，固体富集培养基还包括质量体积分数为1～2％的琼脂，其他成分及制备方法与富集培养基相同；
所述胶体几丁质的制备方法如下：
取5g片状几丁质加入到100ml浓盐酸中，电磁搅拌过夜，使几丁质充分溶解后用去离子冰水反复洗涤白色胶状物，直至其pH值接近中性，加入去离子水高压灭菌后保存。
优选的：所述的植物病原真菌包括赤霉病、稻瘟病、草莓灰霉病、西瓜枯萎病、番茄早疫病、黄瓜晚疫病和黄瓜枯萎病的病菌。
优选的：所述的平板对峙法的检测方法如下：在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上接入病原真菌，于28℃条件下培养6d，然后从其菌落上打下直径为0.8㎝的菌饼，置于新鲜的PDA平板中央，并在平板上接入待测微生物的培养液或已灭菌的培养液，于28℃条件下培养7d后观察结果。或者在距离平板边缘4㎝处放置一个或数个牛津杯，向牛津杯中加入待测微生物培养液或已灭菌的培养液，同样于28℃条件下培养7d后观察结果。这里的牛津杯数量是根据检测菌株的数目以及是否需要设置对照等情况决定的。
本发明具有以下有益效果：简单高效，节省了大量的人力物力，能够通过富集分离技术，快速筛选出植物内生菌中抗植物病原真菌的菌株。具体来说，本发明利用几丁质及其衍生物作为培养植物内生菌的唯一碳源，在富集的同时就筛选出能够降解几丁质的植物内生菌。由于几丁质是真菌细胞壁的主要成分，能够降解几丁质的微生物是对病原真菌的生物防治的重要研究对象，具有较高的安全性和较低的环境影响。因此，富集得到能够降解几丁质的几种菌株只需进一步检测其对植物病原真菌的拮抗作用，即可得到抗病原真菌的植物内生菌，无需将不定向富集得到的大量菌株一一进行抗病原真菌的检测，大大提高了分离筛选的效率。相较于分离自土壤或植物根际细菌作为生防因子，本发明分离得到的植物内生菌对植物分泌的抗菌物质有耐受性，不会因抗菌物质的拮抗作用而使其生防效果大打折扣，生防效果好。
附图说明
图1为实施例4的观察结果照片；
图2为实施例5的观察结果照片；
图3为实施例6的观察结果照片。
具体实施方式
下面具体提供优选的实施例，以使本领域技术人员更加清楚本发明的技术方案和效果。
实施例1
制备富集培养基：
a、配置溶液Ⅰ：称取0.1g的Na3C6H5O7·2H2O、1.4g K2HPO4、0.6g KH2PO4和0.2g(NH4)2SO4，加水制成100ml的溶液Ⅰ；
b、配置溶液Ⅱ：称取0.002g的MgSO4·7H2O，加水制成10ml的溶液Ⅱ；
c、配置溶液Ⅲ：称取9.79g的几丁质粉末，加水制成890ml的溶液Ⅲ；
d、混合：分别对制备好的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ进行灭菌处理，然后混合均匀，即得。
实施例2
制备富集培养基：
a、配置溶液Ⅰ：称取0.1g的Na3C6H5O7·2H2O、1.4g K2HPO4、0.6g KH2PO4和0.2g(NH4)2SO4，加水制成100ml的溶液Ⅰ；
b、配置溶液Ⅱ：称取0.002g的MgSO4·7H2O，加水制成10ml的溶液Ⅱ；
c、配置溶液Ⅲ：称取9.79g的壳聚糖粉末，加水制成890ml的溶液Ⅲ；
d、混合：分别对制备好的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ进行灭菌处理，然后混合均匀，即得。
实施例3
制备胶体几丁质：
取5g片状几丁质加入到100ml浓度为12mol/L的浓盐酸中，电磁搅拌过夜，使几丁质充分溶解后用去离子冰水反复洗涤白色胶状物，检测洗涤水的pH值，待其接近中性，加入去离子水高压灭菌后保存。
实施例4
对抑制病原真菌的植物内生菌菌群的富集分离：
1)、植物组织预处理：取1g小麦根部组织，用自来水冲洗干净，然后用无菌水洗涤，待表面水分晾干，将该根部组织剪成2～3㎜的小段，用体积分数为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡5min，取出后用无菌水冲洗5次进行彻底消毒，用无菌滤纸吸干水分备用。彻底消毒的标志是：将最后一次冲洗后无菌水接到胰酪胨大豆琼脂(TSA)培养基平板上，无微生物长出。
2)、植物内生菌的富集：将表面消毒后的植物组织与实施例一制备的富集培养基相混合，在25℃条件下进行静止培养，然后每30d以1:10的比例稀释进行传代培养，传代2次后，收集培养液。
3)、检测植物内生菌的拮抗作用：分别在PDA培养基上接入赤霉病、稻瘟病、草莓灰霉病、西瓜枯萎病、番茄早疫病、黄瓜晚疫病和黄瓜枯萎病的病菌，于28℃条件下培养6d，然后分别从其菌落上打下直径为0.8㎝的菌饼，置于新鲜的PDA平板中央，并在距离平板边缘4㎝处放置两个牛津杯，分别向牛津杯中加入步骤2)中得到的培养液和已灭菌的培养液，于28℃条件下培养7d后观察结果，如图1所示，得到的菌株对赤霉菌有抑制作用(图中A为加入培养液；B为加入已灭菌的培养液)。
实施例5
对抑制病原真菌根植物内生菌菌株的分离：
1)、植物组织预处理：取1g小麦根部组织，用自来水冲洗干净，然后用无菌水洗涤，待表面水分晾干，将该根部组织剪成2～3㎜的小段，用体积分数为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡5min，取出后用无菌水冲洗5次进行彻底消毒，用无菌滤纸吸干水分备用。彻底消毒的标志是：将最后一次冲洗后无菌水接到TSA平板上，无微生物长出。
2)、植物内生菌的富集：将表面消毒后的植物组织与实施例二制备的富集培养基相混合，在25℃条件下进行静止培养，然后每30d以1:10的比例稀释进行传代培养，传代2次后，收集培养液。
3)、植物内生菌的分离纯化：取步骤2)得到的培养液1ml，分别用磷酸盐缓冲液将其稀释至103倍、104倍和105倍，各取100μl涂布到以质量体积分数为1％的壳聚糖粉末为唯一碳源的富集培养基上，分离壳聚糖降解菌，将分离出的几丁质降解菌在该培养基上反复划线纯化，得到9株菌株，标为1-9号菌株。
4)、检测植物内生菌的拮抗作用：采用平板对峙法，分别在PDA培养基上接入赤霉病、稻瘟病、草莓灰霉病、西瓜枯萎病、番茄早疫病、黄瓜晚疫病和黄瓜枯萎病的病菌，于28℃条件下培养6d，然后分别从其菌落上打下直径为0.8㎝的菌饼，置于新鲜的PDA平板中央，并在距离平板边缘4㎝处接种菌株，于28℃条件下培养7d后观察结果。如图2所示，该图为接种步骤3)得到的6号菌株和8号菌株培养后的照片，其中，8号菌株对番茄早疫病菌有较好的抑制作用。
实施例6
对抑制病原真菌的植物叶生菌的富集分离：
1)、植物组织预处理：取1g小麦叶组织，用自来水冲洗干净，然后用无菌水洗涤，待表面水分晾干，将该根部组织剪成2～3㎜的小段，用体积分数为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡5min，取出后用无菌水冲洗5次进行彻底消毒，用无菌滤纸吸干水分备用。彻底消毒的标志是：将最后一次冲洗后无菌水接到TSA平板上，无微生物长出。
2)、植物内生菌的富集：将表面消毒后的植物组织与实施例1制备的富集培养基相混合，在25℃条件下进行静止培养，然后每30d以1:10的比例稀释进行传代培养，传代2次后，收集培养液。
3)、植物内生菌的分离纯化：取步骤2)得到的培养液1ml，分别用磷酸盐缓冲液将其稀释至103倍、104倍和105倍，各取100μl涂布到以质量体积分数为1％的胶体几丁质为唯一碳源的富集培养基上，这里采用的富集培养基是用实施例3制备的胶体几丁质取代实施例1中溶液Ⅲ的几丁质粉末，分离几丁质降解菌，将分离出的几丁质降解菌在该培养基上反复划线纯化，得到1株菌株。
4)、检测植物内生菌的拮抗作用：采用平板对峙法，分别在PDA培养基上接入赤霉病、稻瘟病、草莓灰霉病、西瓜枯萎病、番茄早疫病、黄瓜晚疫病和黄瓜枯萎病的病菌，于28℃条件下培养6d，然后分别从其菌落上打下直径为0.8㎝的菌饼，置于新鲜的PDA平板中央，在平板上接种步骤3)纯化得到的菌株，于28℃条件下培养7d后观察结果。如图3所示，该菌株对西瓜枯萎病菌和赤霉病菌有抑制作用，对黄瓜晚疫病菌无抑制活性(图中A为接入西瓜枯萎病菌的培养基；B为接入赤霉病菌的培养基；C为接入黄瓜晚疫病菌的培养基)。

Claims (10)

1.一种植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)、植物组织预处理：将植物组织用自来水冲洗干净，然后采用无菌水洗涤，晾干表面水分；将晾干后的植物组织剪成2～3㎜的小段，用体积分数为2～3％的次氯酸钠溶液浸泡5min，取出后用无菌水冲洗5次，用无菌滤纸吸干水分备用；
2)、植物内生菌的富集：将表面消毒后的植物组织与以几丁质或其衍生物为唯一碳源的富集培养基相混合，在25℃条件下静止培养30d，获得可降解几丁质的微生物群落；
3)、检测植物内生菌的拮抗作用：采用平板对峙法，检测降解几丁质的微生物对植物病原真菌的拮抗作用，得到能够拮抗植物病原真菌的植物内生菌。
2.根据权利要求1所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述的植物内生菌的富集分离还包括植物内生菌的分离纯化：利用稀释平板法，将步骤2)得到的微生物群落涂布接种于以胶体几丁质为唯一碳源的固体富集培养基上，分离几丁质降解菌，将分离出的几丁质降解菌在该培养基上反复划线纯化。
3.根据权利要求1所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：将步骤2)富集得到的微生物群落以1:10的比例稀释进行多次传代培养，得到高效降解几丁质的植物内生菌菌群。
4.根据权利要求1所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述的植物组织采用小麦的根、茎或叶。
5.根据权利要求1所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述几丁质包括片状几丁质、几丁质粉末和胶体几丁质。
6.根据权利要求1所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述的几丁质衍生物为乙二醇几丁质、壳聚糖、乙二醇壳聚糖、几丁质寡糖或壳聚糖寡糖中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述的富集培养基的制备方法如下：
a、配置溶液Ⅰ：按以下质量体积分数配置：0.1％Na3C6H5O7·2H2O、1.4％K2HPO4、0.6％KH2PO4、0.2％(NH4)2SO4和水；
b、配置溶液Ⅱ：按以下质量体积分数配置：0.02％(w/v)MgSO4·7H2O和水；
c、配置溶液Ⅲ：按以下质量体积分数配置：1.1％几丁质或其衍生物和水；
d、混合：分别对溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ进行灭菌处理，然后按照10:1:89的比例混合均匀。
8.根据权利要求7所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述的固体富集培养基中采用的几丁质或其衍生物为胶体几丁质，固体富集培养基还包括质量体积分数为1～2％的琼脂，其他成分及制备方法与富集培养基相同；
所述胶体几丁质的制备方法如下：
取5g片状几丁质加入到100ml浓盐酸中，电磁搅拌过夜，使几丁质充分溶解后用去离子冰水反复洗涤白色胶状物，直至其pH值接近中性，加入去离子水高压灭菌后保存。
9.根据权利要求1或2所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述的植物病原真菌包括赤霉病、稻瘟病、草莓灰霉病、西瓜枯萎病、番茄早疫病、黄瓜晚疫病和黄瓜枯萎病的病菌。
10.根据权利要求1或2所述的植物内生菌的富集分离方法，其特征在于：所述的平板对峙法的检测方法如下：在PDA培养基上接入病原真菌，于28℃条件下培养6d，然后从其菌落上打下直径为0.8㎝的菌饼，置于新鲜的PDA平板中央，并在上平板接入待测微生物的培养液或已灭菌的培养液，于28℃条件下培养7d后观察结果。
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