CN103122331A

CN103122331A - 一种植物内生菌的分离方法

Info

Publication number: CN103122331A
Application number: CN2013100450901A
Authority: CN
Inventors: 夏振远; 陈泽斌; 吴玉萍; 雷丽萍; 汪安云; 晋艳
Original assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Current assignee: Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences
Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2013-02-05
Publication date: 2013-05-29

Abstract

本发明公开了一种植物内生菌的分离方法，包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯培养步骤，具体是选择健康植株进行采样、分类保藏，在乙醇溶液中浸泡，再在次氯酸钠溶液中浸泡，用无菌水冲洗，称取0.3~0.5g，加入无菌水，研磨。研磨后的浆液梯度稀释，涂布后平板培养，每处理重复3~5次，根据菌落的形状、大小、干湿、颜色、质地、表面、边缘及透明度8个表型特征挑取单菌落，进行纯化培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存。本发明有效避免了人为扩大或丢失植物内生菌的多样性分离结果，为研究植物内生菌的菌落组成特征，丰富内生菌基因资源具有十分重要的作用。

Description

一种植物内生菌的分离方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，进一步属于微生物技术领域，具体涉及一种植物内生菌的分离方法。

背景技术

植物内生菌是指生活在健康植物的各种组织和器官内部的真菌或细菌，在其生活过程中宿主植物不表现出外在的病症，植物与其内生菌属于互惠共生的关系。植物为内生菌提供光合产物和矿物质，而内生菌的代谢产物则能刺激植物的生长发育，提高宿主植物对生物胁迫和非生物胁迫的抵抗能力。由于将植物内生菌作为生防因子具有独特的优势：它们分布于植物的不同组织中，受到植物组织的保护，具有稳定的生态环境，与附生菌相比更易于发挥生防作用，因此，有关植物内生菌的研究正成为国内外环境、生物、化学等领域的焦点。

植物内生菌普遍存在于植物体的各个部位且种类繁多，而人们对这些内生菌的栖息部位和种类多样性仍然知之甚少。因而，为了充分开发利用植物内生菌及其代谢产物资源，首先必须实现植物内生菌的完全、准确的分离。目前常用的分离方法均采用化学消毒剂对植物表面进行消毒处理，分离获取植物细胞内或细胞间的内生菌。但在实际操作中，每个处理步骤的时间界定往往采取的是经验值，并未充分考虑到不同植物或植物的不同组织，在不同的生育期因其结构或生理特性的不同而造成的处理效果特异性。因而，常常导致所分离获取的植物内生菌种类和数量降低。

此外，植物材料表面消毒后，从植物体内分离获取内生菌的方法或者是剖开植物材料从中切取组织薄片，或者是用移液管刺入有汁液的果实内部吸取汁液。这些方法尽管简便易行，减少了污染，却也使得分离获取的内生菌的数量和种类非常有限。这是由于内生菌在植物体内分布的不均匀性，导致分离的结果不能充分地代表整个植物体内生菌的数量和种类。因此，为了充分开发植物内生菌的基因资源及其代谢产物的利用潜能，首先，必须找到一种能够完全且准确的分离植物内生菌的方法；然后，在分离的基础上进一步对植物内生菌做深入的多样性分析，为后续的产业化利用及推广打下坚实的基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种植物内生菌的分离方法。

本发明的目的是这样实现的，包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯培养步骤，具体包括：

A、采样：选择生长性状良好、无病害症状的健康植株进行采样，将得到的植物材料按不同植物及组织类别分类保藏；

B、表面灭菌：将采集的植物材料在65~75%的乙醇溶液中浸泡30~90s后，再在有效氯含量0.5~1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡40~320s，用无菌水冲洗3~5次；

C、组织研磨：称取0.3~0.5g经预处理后的植物材料，与灭菌研磨珠一并置于离心管中，加入500~700μl无菌水，研磨120~240s，频率为20~40r/s；

D、分离及纯培养：研磨后的浆液梯度稀释10~10⁴倍，各取200μl稀释液涂布后在25~32℃下平板培养24~48h，每样品重复3~5次，根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落，进行平板划线培养，将经纯培养的单菌落移入试管斜面保存。

本发明所述的植物材料表面消毒法综合考虑了植物不同组织的吸附特性和消毒剂的渗透特点，准确的界定了不同植物组织的灭菌时间，能够彻底杀灭植物材料表面的各种微生物，最大限度的保证了植物内生菌调查的准确性；采用高通量组织研磨机进行植物材料的破碎，提高了工作效率，更能使植物内生菌充分释放。此内生菌分离方法有效避免了人为扩大或丢失植物内生菌的分离获得，为研究植物内生菌的种群组成特征，丰富内生菌资源具有十分重要的作用。

附图说明

图1为本发明工艺流程图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的植物内生菌的分离方法，包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯培养步骤，具体包括：

A步骤所述的保藏为密封0~4℃低温保藏。

A步骤所述的保藏时间为8~24h。

所述的植物材料为植物的根、茎、叶。

所述的植物材料为植物的根、茎、叶在1%的次氯酸钠溶液中的浸泡时间分别为290~310s、170~190s、50~70s。。

所述的预处理后还需检验灭菌效果。

所述的检验灭菌效果是将最后一次的冲洗水涂布NA平板，28℃培养48h后记录菌落数，计算表面除菌率以检验灭菌效果，每处理重复3次。

所述的研磨珠由直径不同的钢珠配合构成，优选为一大一小的钢珠，且直径大小比为3~5:1~2，优选3:1。

所述的研磨由高通量组织研磨器完成，优选QIAGEN高通量组织研磨器。

D步骤所述的菌落表型特征为菌落的形状、大小、干湿、颜色、质地、表面、边缘及透明度。

所述的平板培养为在暗处培养，所用培养基为NA培养基，配方为：酵母浸出汁3.0g，牛肉浸膏1.0g，大豆蛋白胨5.0g，NaCl 5.0g，琼脂17.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0。

本发明所用原料不受地区和品种限制，均可以实现本发明，下面以来源于云南省玉溪市烟草（品种为K326）为实验材料对本发明做进一步说明：

实施例1

——各植物组织的表面消毒实验

实验材料与方法：以K326烟草的根、茎、叶为实验材料，采样时选择生长性状良好、无病害症状的健康植株。将K326烟草的根、茎、叶样本从植株分离后冲洗干净，分别编号为1、2、3、4、5装于密封袋中，于4℃保鲜备用。

将洗净的各烟草的根、茎、叶样本随机称取0.4g，先在70%的乙醇溶液中振荡浸泡60s，接着用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液振荡浸泡40~320s，然后用无菌水冲洗4次。将最后一次的冲洗水涂布NA平板，在28℃培养48h后记录菌落数，计算表面除菌率以检验灭菌效果，每处理3次重复。

表面除菌率的计算通过下式进行：

表面除菌率=（未经消毒处理的植物材料表面细菌数－消毒处理后的植物材料表面细菌数）／未经消毒处理的植物材料表面细菌数×100%

实验结果：

表1 各植物组织不同表面消毒时间的除菌率

Figure 2013100450901100002DEST_PATH_IMAGE001

由实验结果可知，不同植物组织器官所需的灭菌时间存在着明显的差异，其中，根部样本所需的灭菌时间最长，所有样本所需灭菌时间至少为290s，大多数在300s能实现完全灭菌。其次为茎部样本，所有样本所需灭菌时间至少为160s，大多数在180s能实现彻底灭菌。最后为叶部样本，所有样本所需灭菌时间至少为40s，大多数在60s即能实现完全灭菌。这与植物各组织器官的致密性及所处的生长环境有关，采用能使除菌率达到100%的最短灭菌时间能有效保护植物内生菌的完整性，使内生菌的分离结果更为全面、可靠。

实施例2

——烟草内生菌的分离

实验材料与方法：以K326烟草的根、茎、叶为实验材料，采样时选择生长性状良好、无病害症状的健康植株。将K326烟草的根、茎、叶样本从植株分离后冲洗干净，分别装于密封袋中，于4℃保鲜备用。

将洗净的烟草的根、茎、叶样本随机称取0.4g，先在70%的乙醇溶液中振荡浸泡60s，接着将根、茎、叶样本用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液分别振荡浸泡60s、180s、300s，然后用无菌水冲洗4次。将最后一次的冲洗水涂布NA平板，在28℃下培养48h作为表面消毒的对照，若对照平板无菌落形成则证明表面消毒充分，后续步骤分离获得的均为烟草内生菌。

将表面消毒的烟草的根、茎、叶样本随机称取0.4g，与直径为5mm和2mm的灭菌钢珠一并置于2ml灭菌离心管中，加入600μl无菌水，用QIAGEN高通量组织研磨器研磨180s，频率为30r/s；研磨后的浆液梯度稀释10~10⁴倍，各取200μl稀释液涂布NA平板，每处理重复4次。在28℃培养48h后根据菌落表型特征的不同挑取具有代表性的单菌落重新于NA平板上划线纯化，挑取长势旺盛者保存于试管斜面备用。

实施例3

——烟草内生菌的分离

与实施例2基本相同，不同之处在于：以云烟85烟草的根、茎、叶为实验材料；烟草的根、茎、叶样本用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液分别振荡浸泡40s、170s、310s；研磨时间为240s，频率为20r/s；灭菌钢珠尺寸分别为3mm和1mm。

实施例4

——烟草内生菌的分离

与实施例2基本相同，不同之处在于：以红大烟草的根、茎、叶为实验材料；烟草的根、茎、叶样本用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液分别振荡浸泡50s、180s、300s；研磨时间为120s，频率为40r/s；灭菌钢珠尺寸分别为4mm和2mm。

实施例5

——烟草内生菌的分离

与实施例2基本相同，不同之处在于：以红大烟草的根、茎、叶为实验材料；烟草的根、茎、叶样本用有效氯含量1%的次氯酸钠溶液分别振荡浸泡60s、180s、290s；灭菌钢珠尺寸分别为5mm和1mm。

Claims

1.一种植物内生菌的分离方法，其特征在于包括采样、表面灭菌、组织研磨、分离及纯培养步骤，具体包括：

2.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于A步骤所述的保藏为密封0~4℃低温保藏。

3.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于A步骤所述的保藏时间为8~24h。

4.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的植物材料为植物的根、茎、叶。

5.根据权利要求4所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的植物材料为植物的根、茎、叶在1%的次氯酸钠溶液中的浸泡时间分别为290~310s、170~190s、50~70s。

6.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的预处理后还需检验灭菌效果。

7.根据权利要求6所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的检验灭菌效果是将最后一次的冲洗水涂布NA平板，28℃培养48h后记录菌落数，计算表面除菌率以检验灭菌效果，每处理重复3次。

8.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的研磨珠由直径不同的钢珠配合构成。

9.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于所述的研磨采用高通量组织研磨器完成。

10.根据权利要求1所述的植物内生菌的分离方法，其特征在于D步骤所述的菌落表型特征为菌落的形状、大小、干湿、颜色、质地、表面、边缘及透明度。