CN106119178A - 一种川楝内生放线菌的分离方法 - Google Patents

一种川楝内生放线菌的分离方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种川楝内生放线菌的分离方法，具体提供了一种表面消毒方法和组织培养方法，同时还提供了一种用于组织培养过程的酶解液；本发明分离方法可有效提高川楝内生放线菌的分离数量。此外，本发明还提供了一种培养基，该培养基适用于川楝内生放线菌的培养。

Description

一种川楝内生放线菌的分离方法
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及川楝内生放线菌的分离和培养方法。
背景技术
放线菌是一类数量大、种类多、具有重要实用价值和开发潜力的微生物资源，是抗生素、酶和酶抑制剂等生理活性物质的主要产生者，迄今从微生物发现的大约12000多种生理活性物质中，有近2/3是放线菌产生的。植物内生放线菌是指以共生或寄生方式存在于植物组织内部，不引发植物明显病症的微生物，在长期协同进化的过程中，植物内生放线菌与宿主间不断进行物质、能量以及遗传信息的交换，许多功能特异的放线菌与植物间形成了复杂的共生关系。宿主植物可以通过自身的新成代谢为内生放线菌提供生长所需，内生放线菌则通过产生各类具有生物活性的代谢产物及基因重组的方式参与植物的新陈代谢，促进寄主植物生长，借助于信号传导诱导植物产生系统抗性(ISR)来增强植物的抗性，使宿主植物获得生理上的优势，提高宿主抵抗病害及对环境的适应能力。此外，内生放线菌与植物尤其是与植物间的″协同进化″关系决定了某些内生放线菌具有了产生与宿主植物相同或相似的生物活性物质的能力，近年来人们从植物中获得了能产生具有拮抗动、植物病害、促进植物生长、抗肿瘤等功能的内生放线菌，为寻找新的环境友好的天然活性物质提供了宝贵的微生物资源库。
从环境样品中获得微生物的纯培养是当前筛选微生物新化合物的第一步，也是开发新化合物的关键所在。目前对植物中获得内生放线菌纯培养物的方式，主要采用以下程序来对内生放线菌进行分离：表面消毒-组织研磨-分离纯培养。现有的表面消毒方法存在″一刀切″的现象，即不考虑植株的各部位组织结构、生育期等差异而采用同一种消毒方法进行处理，但由于某些植物组织不能耐受高浓度消毒剂的处理，而直接导致植物内生的放线菌在表面消毒时就已死亡，最终影响内生放线菌的分离效果。
此外，植物组织破碎的程度与最终所分离获得的内生放线菌数量和种类也密切相关。已报道的方法主要有两种：1、磨碎植物组织或剖开植物组织，直接洒在培养基上；2、在已研磨的植物组织中，加入无菌水或0.1％的无菌生理盐水振荡离心后，取上清进行涂布分离。但这两种方法分离获取的内生放线菌的数量和种类都非常有限，特别是木本植物，此类植物根茎粗大并形成大量的木质部，其细胞壁也多数木质化，质地非常坚固，采用现有方法破碎木本植物，很难有效的分离出组织内部的放线菌，分离结果往往不能达到预期目的。
川楝(Melia Toosendan Sieb.et Zucc)为楝科楝属落叶乔木，主要分布于我国西南地区，是重要的工业用材树木，也是水土保持的重要植物。作为传统中药，川楝在我国的药用历史悠久，树皮、根皮、树干、树叶和果实均可入药，以产自四川的川楝果实为上乘，故名川楝子，是重要的川产地道中药材。从川楝中提取的川楝素(Toosendanin)对昆虫、线虫和螨虫以及微生物都有抑制作用，且尚未发现昆虫产生抗药性的情况，是制作高效无残毒无污染新型植物类农药的重要原料。近年来，随着现代分析测定手段的飞速发展，人们从川楝的果实、树皮、叶中进一步分离到具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、抗生育、抗氧化等功能的黄酮类、萜类、芳香族类等新活性化合物。在长期协同进化过程中，栖于川楝内部的放线菌，在宿主植物及外部环境长期影响作用下，可能具备产生结构新颖、活性独特的生物活性物质的潜力，为研究与开发放线菌资源提供了宝贵的源头。目前，以川楝作为材料分离内生放线菌的研究几乎没有，有关于川楝各组织内生放线菌分离的方法与技术现在还是空白。
本发明针对川楝等木本植物内生放线菌分离效果不理想的、杂菌污染率高等现有技术的不足，提出了一种尽可能多的分离出川楝内生放线菌的分离方法。
发明内容
本发明目的包括：
充分挖掘川楝内生放线菌资源；
有效的从果实、树皮、叶等川楝不同组织中分离得到放线菌菌株，尤其是分离植物组织内部的内生放线菌；
根据川楝不同组织及其结构，提供一种有针对性的表面消毒方法，并进一步提供一种分离培养方法，获得尽可能多的放线菌，如内生放线菌等；
提供一种放线菌培养基或分离培养基。
一方面，本发明提供了一种川楝内生放线菌的分离培养方法，包含以下步骤：
(1)取川楝组织，体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗60秒-90秒，无菌水冲洗；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟-10分钟，无菌水冲洗；有效氯浓度为1％-2％的次氯酸钠水溶液浸泡5分钟-10分钟，无菌水冲洗，体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；其中，有效氯浓度为1％-2％的次氯酸钠可以是将有效氯为6％的次氯酸钠溶液稀释4-6倍得到；
所述″有效氯浓度″的″有效″是指次氯酸溶解于水后，水中氯离子的浓度。该浓度单位是指质量浓度；
(2)取步骤(1)处理后的川楝组织，放入无菌的搅拌器中打碎后，置于无菌研钵，加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)取步骤(2)得到的研磨液，装入无菌离心管，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，混匀，避光处置，离心；所述避光处置任选自：避光放置、避光搅拌和/或避光振荡；
(4)取步骤(3)离心获得的上清液，稀释，涂布于培养基上培养；所述培养基，合终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升的重铬酸钾。
优选的，步骤(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸、1重量份的氯化钙、0.5重量份的磷酸二氢钾、0.25重量份的甘露醇、5重量份的果胶酶和10重量份的纤维素酶；
优选的，步骤(4)所述的培养基为：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸钾、0.5重量份的三水合磷酸氢二钾、0.5重量份的七水合硫酸镁、0.5重量份的氯化钠、0.01重量份的氯化钙、0.01重量份的七水合硫酸亚铁和1000重量份的水。
具体的，本发明提供了一种川楝果实的内生放线菌的分离培养方法包括以下步骤：
(1)取川楝果实0.5克，先用体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗90秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为2％的次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；
(2)取步骤(1)处理后得到的川楝果实，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)将步骤(2)制备的川楝果实研磨物装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分钟160转的速度分钟于摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟；取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于培养基上，于28℃培养15-30天；
其中，步骤(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸，1重量份的氯化钙，0.5重量份的磷酸二氢钾，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果胶酶，10重量份的纤维素酶；
步骤(4)所述的培养基为：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸钾，0.5重量份的三水合磷酸氢二钾、0.5重量份的七水合硫酸镁、0.5重量份的氯化钠、0.01重量份的氯化钙、0.01重量份的七水合硫酸亚铁、1000重量份的水。
具体的，本发明还提供了一种川楝叶的内生菌的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)取川楝叶0.5克，先用体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗60秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1.5％的次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；
(2)取步骤(1)处理后得到的川楝叶，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)将步骤(2)制备的川楝叶研磨物装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分钟160转的速度，于摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟；取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于培养基上，于28℃培养15-30天；
其中，步骤(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸，1重量份的氯化钙，0.5重量份的磷酸二氢钾，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果胶酶，10重量份的纤维素酶；
步骤(4)所述的培养基为：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸钾，0.5重量份的三水合磷酸氢二钾、0.5重量份的七水合硫酸镁、0.5重量份的氯化钠、0.01重量份的氯化钙、0.01重量份的七水合硫酸亚铁、1000重量份的水。
此外，本发明还提供了一种川楝树皮内生菌的分离培养方法，包括以下步骤：
(1)取川楝树皮0.5克，先用体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗90秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1％的次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％的碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分；
(2)取步骤(1)处理后得到的川楝树皮，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)将步骤(2)制备的川楝树皮研磨物装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分钟160转的速度，于摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟。取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于培养基上，于28℃培养15-30天；
其中，步骤(3)所述的酶解液合：0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸，1重量份的氯化钙，0.5重量份的磷酸二氢钾，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果胶酶，10重量份的纤维素酶；
步骤(4)所述的培养基为：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸钾，0.5重量份的三水合磷酸氢二钾、0.5重量份的七水合硫酸镁、0.5重量份的氯化钠、0.01重量份的氯化钙、0.01重量份的七水合硫酸亚铁、1000重量份的水。
另一方面，本发明提供了一种酶解液，由0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸，1重量份的氯化钙，0.5重量份的磷酸二氢钾，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果胶酶，10重量份的纤维素酶组成；以及该酶解液用于酶解川楝组织的用途；所述川楝组织，优选为果实、叶、树皮。
此外，本发明还提供了一种培养基，由20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸钾，0.5重量份的三水合磷酸氢二钾、0.5重量份的七水合硫酸镁、0.5重量份的氯化钠、0.01重量份的氯化钙、0.01重量份的七水合硫酸亚铁、1000重量份的水组成；以及该培养基用于培养川楝内生菌，如内生放线菌的用途。
本发明提供的分离得到川楝放线菌或川楝内生放线菌的方法之一为：针对川楝不同组织结构差异进行有区别的表面消毒，然后对已表面消毒的各组织研磨后，酶解处理各组织，将上清涂布于适合放线菌生长、并能有效抑制非放线菌生长的分离培养基，以获得尽可能多的川楝内生放线菌。
例如，本发明分离川楝内生放线菌的可采用以下方法实现：
一种川楝内生放线菌的分离方法，其特征包含以下步骤：
(1)采样：采集健康川楝的果、树皮、叶等组织，为了防止污染，样品采集后用乙醇擦拭植物，有切口的部位乙醇消毒，再用蜡封好，放入无菌塑料袋中，并保存于4℃冰盒中带回实验室，立即进行分离。
(2)样品预处理：用自来水洗掉植物表面的泥土，难以清洗的地方用软刷轻轻刷洗，最后用超声波清洗(15千赫)5-10分钟，用滤纸吸干表面水分。
(3)表面消毒：将采集的川楝各组织先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗60秒-90秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟-10分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1％-2％次氯酸钠水溶液浸泡5分钟-10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。
(4)组织研磨：将表面灭菌处理的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨。
(5)植物组织酶解处理：将研磨后的植物材料装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液(0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸，1重量份的氯化钙，0.5重量份的磷酸二氢钾，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果胶酶，10重量份的纤维素酶)，，以每分钟160转的速度，于28℃摇床中避光振荡处理8小时小时，4℃下用600g的离心力离心25分钟。
(6)内生放线菌分离培养基制备：在分离培养基中加入终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升重铬酸钾作为抑菌剂，抑制非放放线菌的生长。
(7)内生放线菌的分离培养：离心后获得的酶解液，适当稀释后，取0.1毫升涂布于分离培养基上，于28℃培养15-30天，每个稀释度重复3次。
本发明选择果胶酶和纤维素酶处理植物样品，最主要目的是将分布于细胞中，维管束等组织中的内生菌能释放出来，尽可能多的分离出分布于植物组织中的放线菌。
有益效果
本发明表面消毒方法综合植物不同组织的结构特点和对消毒试剂的耐受性，适当调整了消毒剂处理植物材料的时间，在保证植物材料表面各微生物被充分彻底杀灭外，还保证了植物内生菌不受消毒剂的影响；此外，为了从各组织中尽可能多的分离出放线菌，本发明采用粉碎研磨再加酶解的方法处理表面消毒后的样植物样品，充分的释放出分布于植物各组织内的放线菌；采用在分离培养基加入抑菌剂能有效的抑制非放线菌对放线菌生长的影响，减少非放线菌对后期挑菌干扰，防止污染。本发明有助于我们更全面了解川楝内生放线菌的分布及种群组成，同时也为后继功能菌株的筛选提供丰富的菌种资源。
附图说明
图1A、1B、1C川楝果实内生放线菌分离结果图
1A(实施例5方法1)：酶解液培养；1B：研磨后上清培养(实施例6)；1C：
样品研磨后直接洒于培养基(实施例7)
图2A、2B、2C川楝叶内生放线菌分离结果图
2A(实施例5方法1)：酶解液培养；2B：研磨后上清培养(实施例6)；2C：
样品研磨后直接洒于培养基(实施例7)
图3A、3B、3C川川楝树皮内生放线菌分离结果图
3A：酶解液培养(实施例5方法1)；3B：研磨后上清培养(实施例6)；3C：
样品研磨后直接洒于培养基(实施例7)
具体实施方式
实施例1川楝果实、树皮和叶同时表面消毒
采集川楝果实、树皮，叶，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗10分钟，去除植物组织表面杂质，作适当的修剪后，川楝果实、树皮，叶各取0.5克，先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗60秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。取最后一遍清洗样品的无菌水200微升，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养3周以上，观察是否有菌落长出；如无菌落长出，则表面消毒有效；若有菌落长出，表明表面消毒无效。经本方法表面消毒后，LB固体培养基上无菌落长出，表明本实施例表面消毒方法有效；表面消毒检验实验结果见表1。
将经过有效表面消毒的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨后，取适量研磨好的样品组织均匀撒布于含有抑菌剂的高氏一号培养基(可溶性淀粉20克、氯化钠0.5克、硝酸钾1克、三水合磷酸氢二钾0.5克、七水合硫酸镁0.5克、七水合硫酸亚铁0.01克、自来水1000毫升)上，进行内生菌的培养(经有效表面消毒后，植物样品表面无菌，因此培养得到的均为内生菌)，待内生菌长出后，根据干燥、不透明、难以挑取、表面为粉末状或颗粒状、菌落的正反面呈现出不同色泽等菌落形态特征进行放线菌的甄别和统计放线菌的菌落数量，得到放线菌菌落计数，内生放线菌菌落数见表1。
待放线菌长出后，可用无菌竹签挑取出放线菌在ISP4培养基(可溶性淀粉10.0克，硫酸氨4.0克，碳酸钙2.0克，七水合硫酸镁4.1克，三水合磷酸氢二钾2.62克，自来水1000毫升)上培养纯化，纯化后的菌株保存在ISP4斜面培养基上，于4℃保存备用。
实施例2川楝果实的表面消毒
方法1：采集的川楝果实，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗10分钟，去除植物组织表面杂质，取川楝果实0.5克，先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗90秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为2％次氯酸钠水溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。取最后一遍清洗样品的无菌水200微升，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养3周以上，观察是否有菌落长出。如无菌落长出，则表面消毒有效；若有菌落长出，表明表面消毒无效。经本方法表面消毒后，LB固体培养基上无菌落长出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒检验实验结果见表1。
参照实施例1方法，将经过有效表面消毒的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，研磨，培养内生菌并鉴别、统计放线菌数量，得到内生放线菌的菌落计数；内生放线菌菌落数见表1。
方法2：采集的川楝果实，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗10分钟，去除植物组织表面杂质，取川楝果实0.5克，先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗60秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗5分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。取最后一遍清洗样品的无菌水200微升，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养3周以上，观察是否有菌落长出。经本方法表面消毒后，LB固体培养基上有菌落长出，表明本表面消毒方法无效；表面消毒检验实验结果见表1。
实施例3川楝叶的表面消毒
方法1：采集的川楝叶，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗5分钟，去除植物组织表面杂质，作适当的修剪后，川楝叶取0.5克，先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗60s，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1.5％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。取最后一遍清洗样品的无菌水200微升，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养3周以上，观察是否有菌落长出。将消毒好的样品按实施例1的方法进行内生放线菌的培养。经本方法表面消毒后，LB固体培养基上无菌落长出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒检验实验结果见表1。
参照实施例1方法，将经过有效表面消毒的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，研磨，培养内生菌并鉴别、统计放线菌数量，得到内生放线菌的菌落计数；内生放线菌菌落数见表1。方法2：采集的川楝叶，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗5分钟，去除植物组织表面杂质，作适当的修剪后，川楝叶取0.5克，先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗30秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1.0％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗5分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。取最后一遍清洗样品的无菌水200微升，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养3周以上，观察是否有菌落长出。经本方法表面消毒后，LB固体培养基上有菌落长出，表明本表面消毒方法无效；表面消毒检验实验结果见表1。
实施例4川楝树皮的表面消毒
方法1：采集的川楝树皮，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗5分钟，去除植物组织表面杂质，作适当的修剪后，川楝树皮0.5克先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗90秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1％次氯酸钠水溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠漂洗10分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。取最后一遍清洗样品的无菌水200微升，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养3周以上，观察是否有菌落长出。经本实施例方法表面消毒后，LB固体培养基上无菌落长出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒检验实验结果见表1。
参照实施例1方法，将经过有效表面消毒的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，研磨，培养内生菌并鉴别、统计放线菌数量，得到内生放线菌的菌落计数；内生放线菌菌落数见表1。
方法2：采集的川楝树皮，先用自来水将植物样品冲洗干净，再用超声(15千赫)清洗10分钟，去除植物组织表面杂质，作适当的修剪后，川楝树皮0.5克先用体积浓度0.1％吐温20水溶液清洗60秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为2％次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠漂洗10分钟。将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分。取最后一遍清洗样品的无菌水200微升，涂布于LB固体培养基后，置于28℃培养3周以上，观察是否有菌落长出。经本实施例方法表面消毒后，LB固体培养基上无菌落长出，表明本表面消毒方法有效；表面消毒检验实验结果见表1。
参照实施例1方法，将经过有效表面消毒的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，研磨，培养内生菌并鉴别、统计放线菌数量，得到内生放线菌的菌落计数；内生放线菌菌落数见表1。
表1不同表面消毒方法对分离结果的影响
表1中，各组实验均使用相同的组织培养方法培养内生菌，但表1实验结果表明，表面消毒各试剂的浓度和处理时间对川楝各组织内生放线菌的分离结果影响很大。如对不同组织采用同一种表面消毒方式，则会使某些组织会被过度处理，导致分离获得的内生放线菌数量减少。
对于川楝果实、叶、树皮分别使用实施例2方法1、实施例3方法1，实施例4方法1的表面效果效果最佳，使消毒后的植物样品表面无菌，在组织培养中能得到最多的内生放线菌菌落数。
经实施例1表面消毒后，尽管植物样品表面无菌，但组织培养得到的内生放线菌数量较少；这表明各植物组织被过度处理，致使内部细菌被杀灭或去除。
实施例2方法2、实施例3方法2均无法有效杀灭或去除表面细菌；实施例4方法2尽管可有效表面消毒，但植物组织被过度处理，致使内部细菌被杀灭或去除。
因此，在实际操作过程中，不同的植物材料应考虑使用不同的表面消毒方式来进行处理，才能达到最佳的分离结果。
实施例5添加酶解液的组织处理及培养方法
方法1：取实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后的植物样品，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨。将研磨后的植物材料装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液(0.5克的2-N-吗啉乙烷磺酸，1克的氯化钙，0.5克的磷酸二氢钾，0.25克的甘露醇，5克的果胶酶，10克的纤维素酶，蒸馏水1000毫升)，以每分钟160转的速度，于28℃的摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟。取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于合有抑菌剂(抑菌剂指，培养基合终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升的重铬酸钾)的改良高氏一号分离培养基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸钾，0.5克的三水合磷酸氢二钾、0.5克的七水合硫酸镁、0.5克的氯化钠、0.01克的氯化钙、0.01克的七水合硫酸亚铁、1000毫升的蒸馏水)上，于28℃培养15-30天，每个稀释度重复3次；实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后植物样品的组织培养菌株分离实验结果见表2和说明书附图1A、2A、3A。
待放线菌长出后，可用无菌竹签挑取在ISP4培养基上纯化，保种，室温保藏，记录菌株的分离情况。
方法2：
取实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后的植物样品，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨。将研磨后的植物材料装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液(0.25克的2-N-吗啉乙烷磺酸，1克的氯化钙，0.5克的磷酸二氢钾，0.25克的甘露醇，2.5克的果胶酶，5克的纤维素酶，蒸馏水1000毫升)，以每分钟180转的速度，于28℃的摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟。取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于含有抑菌剂(抑菌剂指，培养基含终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升的重铬酸钾)的改良高氏一号分离培养基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸钾，0.5克的三水合磷酸氢二钾、0.5克的七水合硫酸镁、0.5克的氯化钠、0.01克的氯化钙、0.01克的七水合硫酸亚铁、1000毫升的蒸馏水)上，于28℃培养15-30天，每个稀释度重复3次；；实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后植物样品的组织培养菌株分离实验结果见表2。
待放线菌长出后，用无菌竹签挑取在ISP4培养基上纯化，保种，室温保藏，记录菌株的分离情况。
方法3：
取实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后的植物样品，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨。将研磨后的植物材料装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液(1克的2-N-吗啉乙烷磺酸，1克的氯化钙，0.5克的磷酸二氢钾，0.25克的甘露醇，10克的果胶酶，20克的纤维素酶，蒸馏水1000毫升)，以每分钟160转的速度，于28℃的摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟。取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于合有抑菌剂(抑菌剂指，培养基含终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升的重铬酸钾)的改良高氏一号分离培养基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸钾，0.5克的三水合磷酸氢二钾、0.5克的七水合硫酸镁、0.5克的氯化钠、0.01克的氯化钙、0.01克的七水合硫酸亚铁、1000毫升的蒸馏水)上，于28℃培养15-30天，每个稀释度重复3次；实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后植物样品的组织培养菌株分离实验结果见表2。
待放线菌长出后，用无菌竹签挑取在ISP4培养基上纯化，保种，室温保藏，记录菌株的分离情况。菌株分离试验的结果见表2。
实施例6经离心的组织处理及培养方法
将实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨。将研磨后的植物材料装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入无菌水，以每分钟160转的速度，于28℃的摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟。取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于合有抑菌剂(抑菌剂指，培养基合终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升的重铬酸钾)的改良高氏一号分离培养基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸钾，0.5克的三水合磷酸氢二钾、0.5克的七水合硫酸镁、0.5克的氯化钠、0.01克的氯化钙、0.01克的七水合硫酸亚铁、1000毫升的蒸馏水)上，于28℃培养15-30天，每个稀释度重复3次。；实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后植物样品的组织培养菌株分离实验结果见表2和说明书附图1B、2B、3B。
待放线菌长出后，用无菌竹签挑取在ISP4培养基上纯化，保种，室温保藏，记录菌株的分离情况。
实施例7组织处理及培养方法
将实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理的植物样品放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨。取适量研磨好的样品组织均匀撒布于含有抑菌剂(抑菌剂指，培养基含终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升的重铬酸钾)的改良高氏一号分离培养基(20克的可溶性淀粉、0.1克的酵母膏、1克的硝酸钾，0.5克的三水合磷酸氢二钾、0.5克的七水合硫酸镁、0.5克的氯化钠、0.01克的氯化钙、0.01克的七水合硫酸亚铁、1000毫升的蒸馏水)上，正置平板，28℃培养15-30天。实施例2方法1、实施例3方法1、实施例4方法1表面灭菌处理后植物样品的组织培养菌株分离实验结果见表2和说明书附图1C、2C、3C。
待放线菌长出后，用无菌竹签挑取在ISP4培养基上纯化，保种，室温保藏，记录菌株的分离情况。
表2不同组织处理方法对分离结果的影响。
结果表明，经特定配方的酶液处理后的植物样品，有助于分布于植物材料中的放线菌尽可能多的释放出来，虽然植物材料酶解处理后分离获得的内生放线菌的数量均高于非酶解处理，但酶解液浓度过低可能会导致植物组织分解不完全，而酶液浓度过高又可能影响释放出的内生放线菌活性，而最终导致内生放线菌分离效果不佳，本发表明涉及的酶解液浓度能明显提高川楝内生放线菌的分离数量(表2)。此外，直接洒植物组织的方法分离出的放线菌数量也较多，但放线菌种类非常单一。本发明分离出来的放线菌不仅在数量上还是在种类上都明显高于传统的两种处理方法(表2，图1-3)。

Claims (10)

1.一种川楝内生放线菌的分离培养方法，包含以下步骤：
(1)取川楝组织，体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗60秒-90秒，无菌水冲洗；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟-10分钟，无菌水冲洗；有效氯浓度为1％-2％的次氯酸钠水溶液浸泡5分钟-10分钟，无菌水冲洗，体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；
(2)取步骤(1)处理后的川楝组织，放入无菌的搅拌器中打碎后，置于无菌研钵，加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)取步骤(2)得到的研磨液，装入无菌离心管，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，混匀，避光处置，离心；所述避光处置任选自：避光放置、避光搅拌和/或避光振荡；
(4)取步骤(3)离心获得的上清液，稀释，涂布于培养基上培养；所述培养基，合终浓度为50微克每毫升的制霉菌素和终浓度为50微克每毫升的重铬酸钾。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的酶解液含：0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸、1重量份的氯化钙、0.5重量份的磷酸二氢钾、0.25重量份的甘露醇、5重量份的果胶酶和10重量份的纤维素酶。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述的培养基为：20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸钾、0.5重量份的三水合磷酸氢二钾、0.5重量份的七水合硫酸镁、0.5重量份的氯化钠、0.01重量份的氯化钙、0.01重量份的七水合硫酸亚铁和1000重量份的水。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述川楝组织为川楝果实，包括以下步骤：
(1)取川楝果实0.5克，先用体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗90秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为2％的次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；
(2)取步骤(1)处理后得到的川楝果实，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)将步骤(2)制备的川楝果实研磨物装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分钟160转的速度分钟于摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟；取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于培养基上，于28℃培养15-30天。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述川楝组织为川楝叶，包括以下步骤：
(1)取川楝叶0.5克，先用体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗60秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1.5％的次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；
(2)取步骤(1)处理后得到的川楝叶，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)将步骤(2)制备的川楝叶研磨物装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分钟160转的速度，于摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟；取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于培养基上，于28℃培养15-30天。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述川楝组织为川楝树皮，包括以下步骤：
(1)取川楝树皮0.5克，先用体积浓度0.1％的吐温20水溶液清洗90秒，无菌水冲洗三次；体积浓度75％的乙醇水溶液浸泡5分钟，无菌水冲洗三次；有效氯浓度为1％的次氯酸钠水溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗三次；体积浓度10％的碳酸氢钠水溶液漂洗10分钟；将处理好的样品置于铺有无菌滤纸的无菌培养皿中，吸干植物组织表面的水分；
(2)取步骤(1)处理后得到的川楝树皮，放入无菌的搅拌器中打碎，然后再置于无菌的研钵加灭菌细砂与液氮进行研磨；
(3)将步骤(2)制备的川楝树皮研磨物装入50毫升无菌离心管中，按体积比1∶2的比例，加入酶解液，28℃，以每分钟160转的速度，于摇床中避光振荡处理8小时，4℃下用600g的离心力离心15分钟；取上清适当稀释后，取0.1毫升涂布于培养基上，于28℃培养15-30天。
7.一种酶解液，由0.5重量份的2-N-吗啉乙烷磺酸，1重量份的氯化钙，0.5重量份的磷酸二氢钾，0.25重量份的甘露醇，5重量份的果胶酶，10重量份的纤维素酶组成。
8.权利要求7所述的酶解液用于酶解川楝组织的用途；所述川楝组织，优选为果实、叶、树皮。
9.一种培养基，由20重量份的可溶性淀粉、0.1重量份的酵母膏、1重量份的硝酸钾，0.5重量份的三水合磷酸氢二钾、0.5重量份的七水合硫酸镁、0.5重量份的氯化钠、0.01重量份的氯化钙、0.01重量份的七水合硫酸亚铁、1000重量份的水组成。
10.权利要求9所述的培养基用于培养川楝内生放线菌的用途。
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