CN104120095A - 一种白色链霉菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种产ε-聚L-赖氨酸的白色链霉菌Ls2，其保藏号为CGMCC NO.8472，在高氏一号固体培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为白色丝状，边缘干燥中央塌陷；镜检细胞为杆状，无隔断，长度1.0-3.0mm；革兰氏阴性；在20-40℃的温度下均能生长，最适生长温度为28-30℃；生长pH范围为3.0-9.5，最适生长pH为6.8-7.2；需氧生长；碘化铋钾实验生成橙红色沉淀，甲基橙实验生成橙色沉淀。本发明还涉及白色链霉菌Ls2在制备ε-聚L-赖氨酸的应用。

Description

一种白色链霉菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种产聚赖氨酸的白色链霉菌及其应用。 

背景技术

ε-聚L-赖氨酸(ε-PL)是必需氨基酸L-赖氨酸通过α-羧基和ε-氨基形成的同聚物，是一种具有抑菌功效的多肽，抑菌谱广，对于酵母菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和霉菌均有明显的抑菌效果。ε-PL能在人体内分解为赖氨酸，是人体必需的8种氨基酸之一，世界各国均允许在食品中强化赖氨酸，因此，ε-PL是一种营养型的抑菌剂。ε-PL在食品添加剂领域作为天然食品防腐剂正日益受到人们的重视，其安全性明显高于其他的化学防腐剂。 

现有技术已知可以利用白色链霉菌生产ε-PL，但多存在白色链霉菌对培养条件要求高、生长速度慢、ε-PL产量低以及分离纯化工艺复杂等缺陷。 

发明内容

本发明提供了一种能够产生聚赖氨酸的白色链霉菌(Streptomyces albus)Ls2，其能够代谢产生ε-聚L-赖氨酸(ε-PL)，从而能够用于生产ε-PL。 

本发明的白色链霉菌Ls2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.8472，保藏时间为2013年11月15日，其16SrDNA片段长度为1462bp，具体如SEQ ID No：1所示。BLAST检索发现菌种Ls2与白色链霉菌基因组序列的同源性很高，达到99％，结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认本发明的菌种Ls2为白色链霉菌(Streptomyces albus)。 

本发明的白色链霉菌Ls2从采自杭州的土壤中筛选分离得到，在高氏一号固体培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为白色丝状，边缘干燥中央塌陷；镜检细胞为杆状，无隔断，长度1.0-3.0mm；革兰氏阴性；在20-40℃的温度下均能生长，最适生长温度为28-30℃；生长pH范围为3.0-9.5，最适生长pH为6.8-7.2；需氧生长；碘化铋钾实验生成橙红色沉淀，甲基橙实验生成橙色沉淀；高氏一号固体培养基的配方为：葡萄糖50份，氯化钠0.5份，硝酸钾1份， 磷酸氢二铵0.5份，硫酸镁0.5份，硫酸亚铁0.01份，硫酸铵0.66份，硫酸锌0.01份，酵母膏0.1份，琼脂粉15份和水1000份。 

本发明的白色链霉菌Ls2能够代谢产生ε-聚L-赖氨酸，因此，本发明还涉及白色链霉菌Ls2在生产ε-聚L-赖氨酸中的应用。本发明的白色链霉菌Ls2代谢所产生的ε-PL具有很强的抑菌性，分子量大约在3KDa左右，可广泛应用于食品防腐剂和药物载体等其他领域。 

本发明还涉及生产ε-聚L-赖氨酸的方法，其包括如下步骤： 

(1)将白色链霉菌Ls2的试管种接种于液体摇瓶发酵培养基中，培养温度为28-30℃，培养时间为2-3天，获得发酵液，在培养过程中无需调节pH值； 

液体摇瓶发酵培养基的组成以重量份计为： 

酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸铵10份，硫酸亚铁0.03份，硫酸镁0.5份，硫酸锌0.04份，磷酸氢二钾0.8份，磷酸二氢钾1.36份，和水1000份； 

制备液体摇瓶发酵培养基的方法为：称取酵母膏、硫酸铵、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾放入水中，充分混匀后将pH值调节至6.8，121℃湿热灭菌20分钟，然后再加入经单独灭菌的葡萄糖水溶液，混匀冷却后备用； 

(2)将发酵液离心，取上清液用1mol/L的NaOH溶液将其pH值调节至8，静置0.5h后用滤纸过滤去除沉淀，得滤液； 

(3)用弱酸性阳离子交换树脂HD-2对滤液进行震荡吸附8-16h，优选12h，例如可以摇床震荡，150r·min-1，其中，滤液要浸过树脂，并高于树脂约3厘米，静置0.5-1h后过滤，将树脂用蒸馏水冲洗3-5次，然后用0.1mol/L的HCl溶液对树脂进行震荡洗脱8-16h，优选12h，静置0.5-1h后过滤，用1mol/L的NaOH溶液将洗脱液的pH值调节至6.5，然后减压浓缩得浓缩液； 

(4)在浓缩液中加入乙醇乙醚体积比为2:1的混合液，浓缩液与乙醇乙醚混合液的体积比大约为1:10，混匀，过滤除去液体，保留沉淀物，即ε-聚L-赖氨酸，经检测，其纯度达80％，产量达0.6克/L发酵液。将所得的ε-聚L-赖氨酸溶于去离子水中，用G-250柱进行吸附解析，可得纯度超过98％的ε-聚L-赖氨酸，产量达0.42克/L发酵液。 

本发明的优点在于：(1)本发明的白色链霉菌Ls2适应环境的能力强，在pH3.0-9.5和温度为20-40℃条件下均能很好地生长，并产生ε-聚L-赖氨酸，从而在生产赖氨酸的过程中无需监测和调节培养基的pH值，简化了生产工艺；(2)本发明的白色链霉菌Ls2能够快速产生ε-聚L-赖氨酸，培养时间仅需2-3天， 降低了生产成本；(3)本发明的白色链霉菌Ls2以葡萄糖为碳源，以酵母膏和硫酸铵为氮源，培养基成分简单，价格低廉，便于后期对ε-聚L-赖氨酸的分离纯化；(4)本发明的白色链霉菌Ls2生产的ε-聚L-赖氨酸性质稳定，分子量在3KDa左右，抑菌效果好，且稳定性好，不易降解。 

附图说明：

图1：本发明的白色链霉菌Ls2在含有染料亚甲基蓝的选择性培养基中产生排斥圈； 

图2：本发明的白色链霉菌Ls2的摇瓶发酵液在碘化铋钾实验中生成橙红色沉淀，其中，第1个试管为发酵液；第2个试管为在不产聚赖氨酸菌种的发酵液中加入碘化铋钾试剂；第3个试管为在白色链霉菌Ls2发酵液中加入碘化铋钾试剂；第4个试管为在水溶聚赖氨酸标准品中加入碘化铋钾试剂； 

图3：本发明的白色链霉菌Ls2分别对革兰氏阳性金黄色葡萄球菌(图3a)和革兰氏阴性大肠杆菌(图3b)的抑菌试验； 

图4：本发明的白色链霉菌Ls2的16SrDNA PCR后琼脂糖凝胶电泳图。 

具体实施方式

实施例1.白色链霉菌Ls2的分离和保藏 

本发明的白色链霉菌Ls2通过如下步骤分离得到： 

(1)利用富集培养基对采自杭州的土壤中的微生物进行富集培养，培养温度为28-30℃，培养时间为6-7天，得到边缘干燥中央塌陷的白色放线菌。 

富集培养基的组成以重量份计为： 

可溶性淀粉20份，氯化钠0.5份，硝酸钾1份，磷酸氢二钾0.5份，硫酸镁0.5份，硫酸亚铁0.01份，硫酸铵0.66份，硫酸锌0.01份，酵母膏0.1份，重铬酸钾0.05份，琼脂粉15份，和水1000份。 

制备富集培养基的方法为：称取可溶性淀粉、氯化钠、硝酸钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵、硫酸锌、酵母膏、重铬酸钾和琼脂粉放入水中，充分混匀后将pH值调节至7.0-7.2，121℃湿热灭菌20分钟，冷却后备用。 

(2)利用选择性培养基筛选产物中含有带正电物质的菌种。将含染料亚甲基蓝的选择性培养基灭菌后，倒平板，待培养基凝固后，用划线法进行接种。培养温度为28-30℃，培养时间为6-7天，结果如图1所示，周围存在排斥圈的菌落其产物中含有带正电物质。挑选单菌落在高氏一号固体培养基中进行划线 纯化，纯化菌株于4℃保存。 

选择性培养基的组成以重量份计为： 

葡萄糖50份，氯化钠0.5份，硝酸钾1份，磷酸氢二铵0.5份，硫酸镁0.5份，硫酸亚铁0.01份，硫酸铵0.66份，硫酸锌0.01份，酵母膏0.1份，亚甲基蓝0.02份，琼脂粉15份，和水1000份。 

制备选择性培养基的方法为：称取氯化钠、硝酸钾、磷酸氢二铵、硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸铵、硫酸锌、酵母膏、亚甲基蓝和琼脂粉放入适量水中，充分混匀后将pH值调节至7.0-7.2，121℃湿热灭菌20分钟，然后再加入经单独灭菌的葡萄糖水溶液，混匀冷却后备用。 

本发明的白色链霉菌Ls2在高氏一号固体培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为白色丝状，边缘干燥中央塌陷；镜检细胞为杆状，无隔断，长度1.0-3.0mm；革兰氏阴性；在20-40℃的温度下均能生长，最适生长温度为28-30℃；生长pH范围为3.0-9.5，最适生长pH为6.8-7.2；需氧生长；碘化铋钾实验生成橙红色沉淀(结果如图2所示)，甲基橙实验生成橙色沉淀。高氏一号固体培养基的配方为：葡萄糖50份，氯化钠0.5份，硝酸钾1份，磷酸氢二铵0.5份，硫酸镁0.5份，硫酸亚铁0.01份，硫酸铵0.66份，硫酸锌0.01份，酵母膏0.1份，琼脂粉15份和水1000份。 

本发明的白色链霉菌Ls2在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.8472，保藏时间为2013年11月15日。 

实施例2.利用白色链霉菌Ls2生产ε-聚L-赖氨酸 

(1)将白色链霉菌Ls2的试管种接种于液体摇瓶发酵培养基中，培养温度为28-30℃，培养时间为2天，获得发酵液，在培养过程中无需调节pH值； 

液体摇瓶发酵培养基的组成以重量份计为： 

酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸铵10份，硫酸亚铁0.03份，硫酸镁0.5份，硫酸锌0.04份，磷酸氢二钾0.8份，磷酸二氢钾1.36份，和水1000份； 

制备液体摇瓶发酵培养基的方法为：称取酵母膏、硫酸铵、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾放入适量水中，充分混匀后将pH值调节至6.8，121℃湿热灭菌20分钟，然后再加入经单独灭菌的葡萄糖水溶液，混匀冷却后备用； 

(2)将发酵液离心，取上清液用1mol/L的NaOH溶液将其pH值调节至8，静置0.5h后用滤纸过滤去除沉淀，得滤液； 

(3)取20ml的滤液加入到装有大约5g弱酸性阳离子交换树脂HD-2的100ml三角瓶中，其中，滤液要浸过树脂，并高于树脂约3厘米，放置在摇床中，150r·min-1震荡吸附12h，，然后静置0.5h，过滤，将树脂用适量蒸馏水冲洗4次，重新放入100ml三角瓶中，再加入20ml0.1mol/L的HCl溶液，放置在摇床中，震荡洗脱12小时。用1mol/L的NaOH溶液将洗脱液的pH值调节至6.5，然后用旋转蒸发仪进行减压蒸发浓缩，得浓缩液； 

(4)在浓缩液中加入乙醇乙醚的混合液(体积比2:1)，不断的向浓缩液中添加乙醇乙醚的混合溶液，直至不在有沉淀析出，边加混合液，边震荡，浓缩液与乙醇乙醚混合液的体积比例大约为1:10。混匀，过滤除去液体，沉淀物即ε-聚L-赖氨酸，经检测，其纯度达80％，产量为0.6克/L发酵液。 

实施例3.ε-聚L-赖氨酸的纯化和检测 

将实施例2所得的ε-聚L-赖氨酸溶于去离子水中，用G-250柱进行吸附解析，可得纯度超过98％的ε-聚L-赖氨酸，产量为0.42克/L发酵液。通过SDS-PAGE电泳，可知该ε-聚L-赖氨酸的分子量大约为3000Da。 

取实施例2所得的ε-聚L-赖氨酸用去离子水溶解，制成浓度为0.1克/升的溶液，进行滤纸片抑菌试验，结果表明其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均具有明显抑制作用，如图3a和3b所示。 

将实施例2所得的ε-聚L-赖氨酸存放于4℃冰箱中1个月后，分子量和抑菌性能均没有变化。 

实施例4 

使用DNA提取试剂盒进行菌种总DNA的提取。以菌种Ls2的总DNA为模板，上游引物P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物P2：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’，对16SrDNA进行PCR扩增提取，然后进行琼脂糖凝胶电泳，16SrDNA片段长度为1500bp左右，结果如图4所示。对胶进行回收纯化后测序，结果表明，菌种Ls2的DNA为1462，具体如SEQ ID No：1所示。BLAST检索发现菌种Ls2与白色链霉菌基因组序列的同源性很高，达到99％，结合形态学和生理生化性状的鉴定结果，可以确认菌种Ls2为白色链霉菌。 

SEQ ID No1： 

<110>北京化工大学 

<120>一种白色链霉菌及其应用 

<160>1 

<210>1 

<211>1462 

<212>DNA 

<213>白色链霉菌(Streptomyces albus) 

<400>1 

CGGGGCTGCTCTTGTTCGACTTCGTCCAATCGCCAGTCCCACCTTCGACGATTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGACTTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAATGCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATCCGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCACCTCGCGGTATCGCAGCTCATTGTACCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGTGAGTCCCCATCACCCCGAAAGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCACGCACCACCTGTACACCGACCACAAGGGGGACCGTGTCTCCACGGTTTTCCGGTGTATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCGTCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTTAGCTGCGGCACGGACGACGTGGATGTCCCCACACCTAGTTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCRCTCCTACAGCGTCAGWATCGGCCCARAKATCCGCYTTCGCCACCGGTGTTCCTCCTGATATGTGCGCATTTCACCGCTACACCAGGAAATCCGATCTCCCCTACCGAGCTCTAGCCTGCCCGTATCGAATGCAGACCCGGGGTTAAGCCCCGGGCTTTCACATCCGACGTGACAAGCCGCCTACGAGCTCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTCGCGCCCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGGCGCTTCTTC TGCAGGTACCGTCACTCTCGCTTCTTCCCTGCTGAAAGAGGTTTACAACCCGAAGGCCGTCATCCCTCACGCGGCGTCGCTGCATCAGGCTTTCGCCCATTGTGCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGGTCGCCCTCTCAGGCCGGCTACCCGTCGTCGCCTTGGTGAGCCACTACCTCACCAACAAGCTGATAGGCCGCGGGCTCATCCTTCACCGCCGGAGCTTTCCACACGGAGATCATGCGACCCCGTGTCATATCCGGTATTAGACCCCGTTTCCAGGGCTTGTCCCAGAGTGAAGGGCAGATTGCCCACGTGTTACTCACCCGTTCGCCACTAATCCCCTCCCGAAGGAGGTTCATCGTCGACTGCATGGTAGACCCGCCACTGGT 

Claims (4)

1.一种白色链霉菌(Streptomyces albus)Ls2，其特征在于，其保藏号为CGMCC NO.8472。

2.如权利要求1所述的白色链霉菌Ls2，其特征在于，其在高氏一号固体培养基上单细胞繁殖生长形成的菌落为白色丝状，边缘干燥中央塌陷；镜检细胞为杆状，无隔断，长度1.0-3.0mm；革兰氏阴性；在20-40℃的温度下均能生长，最适生长温度为28-30℃；生长pH范围为3.0-9.5，最适生长pH为6.8-7.2；需氧生长；碘化铋钾实验生成橙红色沉淀，甲基橙实验生成橙色沉淀；其中，所述高氏一号固体培养基的配方为：葡萄糖50份，氯化钠0.5份，硝酸钾1份，磷酸氢二铵0.5份，硫酸镁0.5份，硫酸亚铁0.01份，硫酸铵0.66份，硫酸锌0.01份，酵母膏0.1份，琼脂粉15份和水1000份。

3.如权利要求1或2所述的白色链霉菌Ls2在生产ε-聚L-赖氨酸中的应用。

4.一种生产ε-聚L-赖氨酸的方法，其包括如下步骤：

(1)将如权利要求1或2所述的白色链霉菌Ls2的试管种接种于液体摇瓶发酵培养基中，培养温度为28-30℃，培养时间为2-3天，获得发酵液，在培养过程中无需调节pH值；

其中，液体摇瓶发酵培养基的组成以重量份计为：

酵母膏5份，葡萄糖50份，硫酸铵10份，硫酸亚铁0.03份，硫酸镁0.5份，硫酸锌0.04份，磷酸氢二钾0.8份，磷酸二氢钾1.36份，和水1000份；

制备液体摇瓶发酵培养基的方法为：称取酵母膏、硫酸铵、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锌、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾放入水中，充分混匀后将pH值调节至6.8，121℃湿热灭菌20分钟，然后再加入经单独灭菌的葡萄糖水溶液，混匀冷却后备用；

(2)将发酵液离心，取上清液用1mol/L的NaOH溶液将其pH值调节至8，静置0.5h后用滤纸过滤去除沉淀，得滤液；

(3)用弱酸性阳离子交换树脂HD-2对滤液进行震荡吸附8-16h，其中，滤液浸过树脂并高于树脂约3厘米，静置0.5-1h后过滤，将树脂用蒸馏水冲洗3-5次，然后用0.1mol/L的HCl溶液对树脂进行震荡洗脱8-16h，静置0.5-1h后过滤，用1mol/L的NaOH溶液将洗脱液的pH值调节至6.5，然后减压浓缩得浓缩液；

(4)在浓缩液中加入乙醇乙醚体积比为2:1的混合液，其中，浓缩液与乙醇乙醚混合液的体积比大约为1:10，混匀，过滤除去液体，沉淀即ε-聚L-赖氨酸。