CN110656065A - 一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株生产ε‑聚赖氨酸的链霉菌及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的小白链霉菌菌株(Streptomyces albulus)M‑Z18，已于2019年7月29日保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号CGMCC NO：M 2019589。本发明的小白链霉菌M‑Z18菌株是可以在以琥珀酸为碳源的培养基上快速生长，且具有磺胺胍抗性的高效合成ε‑聚赖氨酸的能力。本发明的菌株在pH冲击策略下进行分批补料发酵，ε‑聚赖氨酸累积浓度可达54.7g/L,生产效率达6.83g/L/d，是一株极具潜力的ε‑聚赖氨酸工业生产菌株。

Description

一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用，属于生物工程技术领域。
技术背景
ε-聚赖氨酸(简写ε-PL)作为一种新型天然生物食品防腐剂，其抑菌谱广泛，极易溶于水，热稳定强，安全性高，适用pH值宽。上世纪八十年代，日本首先批准ε-PL用作食品防腐剂。随后，美国、韩国、欧洲和中国相继批准ε-PL作为新品种食品添加剂。另一方面，ε-PL作为一种阳离子生物聚合物，被广泛用作生物可降解材料、药物载体，生物芯片外被、乳化剂、高吸收性水凝胶和抗癌增进剂等领域的研究和应用。因此，ε-PL是一种应用范围广、附加值高的新型工业生物技术产品，具有广阔的市场应用前景。
已被发现的可以合成ε-PL的微生物主要集中在链霉菌属(包括小白链霉菌、吸水链霉菌和灰褐链霉菌等)、北里孢菌属、麦角真菌和芽孢杆菌属，其中小白链霉菌是食品级ε-PL产生菌的最主要来源。野生小白链霉菌的ε-PL合成效率极很低，选育稳定的、ε-PL合成效率高的小白链霉菌是高产ε-PL的关键。
目前为止，已知岩田敏治等在中国申请专利(名称：大量生产ε-聚-L-赖氨酸的菌株和生产方法，专利号：97182253.0)是通过对小白链霉菌lysinopolymerus亚种11011A-1菌株(FERM BP-1109)进行诱变处理而获得大量合成ε-PL的诱变菌株B21021(FERM BP-5926)，其对浓度10mg/mL或更高的AEC具有抗性，并从发酵液中分离和提取了ε-PL。1989年日本Chisso公司利用小白色链霉菌实现了产业化生产，垄断了ε-PL的国际市场。
贾士儒等申请的专利(名称：一种诱变菌株白色链霉菌TUST2及利用该诱变菌株生产ε-聚赖氨酸及其盐的方法，专利号：200710057098.4)是以在中国海南省的土壤中分离得到的TUST1为基础，利用紫外诱变、化学诱变相与氮离子注入等诱变方法相结合而选育出的ε-PL高产菌株TUST2，该菌株对10mg/mL或更高的S-2-氨基乙基-L-半胱氨酸(AEC)和ε-PL具有抗性。
李树等申请的专利(名称：一种灰褐链霉菌菌株、及利用该菌株制备ε-PL及其盐的方法，专利号：200910224087.X)中公开了经筛选获得的一种产ε-PL的灰褐链霉菌(CCTCCM209211)，并将其应用于ε-PL及其盐的生产和制备。
宋存江等申请的专利(名称：一株链霉菌及其应用，专利号：201210081685.8)公开了一株生产ε-PL的链霉菌Streptomyces sp.NK-49(CGMCC No.5932)，以及利用该菌发酵生产ε-PL和产物分离纯化的方法。
徐虹等申请的专利(名称：一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用)公开了一株小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1(CCTCCM 2011043)在制备ε-PL和聚二氨基丁酸的方法，采用该菌作为出发菌株进行发酵生产后，ε-PL产量达到30g/L以上，聚二氨基丁酸的产量达12g/L；随后，徐虹以PD-1为出发菌，通过过表达基因组上的铵转运蛋白基因amtB构建了一株小白链霉菌基因工程菌Streptomyces albulus PD-4，提高了氮源利用效率，同时ε-PL的产量达到35.7g/L。虽然工程菌的ε-PL合成效率有所提高，但由于基因工程仅提高了单一代谢通路、而不是多条代谢通路的强度，因此小白链霉菌ε-PL产量仍有较大的提升空间。同时，工程菌在传代过程中也常出现由于质粒不稳定造成的遗传稳定性较差的现象。因此，需要提供一株合成效率高且稳定性优良的ε-PL生产菌株以满足工业生产的需要。
对于ε-PL高产菌株的选育，常见的是筛选具有L-赖氨酸结构类似物抗性和产物ε-PL抗性的突变菌株。然而这些“筛子”筛选效果一般，价格也十分昂贵，不适合大规模的应用于育种工作中。
发明内容
发明人经过大量研究分析，发现在琥珀酸为碳源的培养基上快速生长的菌株，其前体L-赖氨酸与ε-PL的合成能力显著提高，同时发现具有15g/L或更高浓度的磺胺胍抗性突变体可具有大量合成ε-PL的能力，该菌株在培养基中进行好氧发酵可以大量合成ε-PL。
本发明的第一个目的是提供一株可以大量合成ε-PL的小白链霉菌M-Z18，其ε-PL产量与产率显著高于常规ε-PL生产菌；该菌株能够以甘油为碳源，通过分批补料发酵192h合成ε-PL，产量可达到54.7g/L，生产效率高达6.83g/L/d。该菌株已于2019年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019589；保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
本发明的第二个目的是提供含有所述微生物的组合物。
在一种实施方式中，所述组合物为微生物制剂。
在一种实施方式中，所述微生物制剂包括所述小白链霉菌M-Z18和细胞保护剂。
在一种实施方式中，所述小白链霉菌M-Z18的含量≥1×104CFU/g或1×104CFU/mL。
本发明的第三个目的是提供所述小白链霉菌M-Z18的应用。
本发明的第四个目的是提供一种生物法发酵合成ε-PL的方法，是利用所述小白链霉菌CGMCC NO.菌株进行生产。
在一种实施方式中，所述方法是以葡萄糖、甘油、琥珀酸、果糖、蔗糖、麦芽糖乳糖或阿拉伯糖为中的一种或几种为生长碳源，经微生物发酵合成ε-PL。
在一种实施方式中，所述方法是以有机氮源牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、鱼粉、玉米浆等，以及无机氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4NO3中的一种或几种为生长氮源，经微生物发酵合成ε-PL。
在一种实施方式中，所述方法是在28～30℃发酵120～192h。
在一种实施方式中，所述发酵过程调控pH为3.5～4.0。
在一种实施方式中，所述方法在发酵第35～40h开始补加终浓度为700～900g/L的碳源甘油和终浓度为30～40g/L的氮源硫酸铵。
在一种实施方式中，所述方法在是在RSM发酵培养基中，通过5mol/L浓度的氨水将发酵液的pH控制在3.5～4.5之间，于30℃、1vvm搅拌通气条件下发酵，并于发酵40h时开始补充纯甘油和终浓度为35g/L的氮源硫酸铵。
在一种实施方式中，所述方法以5-15％的接种量接种浓度为1×108～5×108CFU/mL的种子液。
在一种实施方式中，以5-15％的接种量接种菌浓为1×108～5×108CFU/mL的种子液，初始搅拌转速80～120r/min，通风量设定为1vvm，罐压0.05MPa，当溶氧浓度降低到20％以下时，每次手动调节搅拌转速30r/min将溶氧控制在20％～40％，直至达到最高转速300r/min为止；采用5mol/L浓度的氨水将发酵液的pH控制在3.5～4.5之间，于30℃搅拌通气条件下进行发酵；并于发酵40h时开始补充纯甘油碳源和浓度/含量为35g/L的硫酸铵氮源。
在一种实施方式中，所述方法还调控发酵液pH在5.0～6.0一段时间后下降至2.8～3.0，持续8～15h后采用5mol/L浓度的氨水将发酵液的pH控制在3.5～4.0。发酵于30℃，200～800,rpm搅拌通气条件下进行，通风量设定为1vvm，调控转速控制溶氧为30％；为避免高浓度甘油和硫酸铵对菌体生长的抑制，于发酵40h时开始补充甘油碳源和硫酸铵氮源。
本发明还要求保护所述小白链霉菌M-Z18或上述任一所述方法在制备ε-PL或其衍生产品方面的应用。
本发明的有益效果：
1、本发明的小白链霉菌M-Z18具有较高的ε-PL合成能力。该菌株能够以甘油为碳源，通过分批补料发酵192h合成ε-PL，产量可达到54.7g/L，生产效率高达6.83g/L/d。
2、小白链霉菌M-Z18可以甘油为碳源大量合成低聚合度(范围为10-32)的ε-PL。
3、本发明的小白链霉菌M-Z18还具有优良的传代稳定性：经6次连续传代培养后，在RSM发酵培养基中的摇瓶产量稳定在1.72±0.08g/L。
生物材料保藏
小白链霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18，分类学命名为小白链霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18，已于2019年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019589；保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
附图说明
图1小白链霉菌M-Z18的菌体形态和孢子形态特征图；
图2诱变小白链霉菌M-Z18于5L规模的分批补料发酵曲线；
图3诱变小白链霉菌M-Z18于50L规模的分批补料发酵曲线；
图4诱变小白链霉菌M-Z18于1m3规模的分批补料发酵曲线；
图5诱变小白链霉菌M-Z18在葡萄糖-甘油双碳源培养基上的补料分批发酵曲线；
图6诱变小白链霉菌M-Z18在pH策略下的补料分批发酵曲线。
具体实施方式
以下是实施例，将对本发明进一步说明，但对本发明没有限制。
首先对本实施方式进行几点说明：
1.本发明的诱变菌株M-Z18是以来自山东的土壤中筛选获得的野生菌Z-18为出发菌株经诱变获得，其可以在以琥珀酸为唯一碳源的平板上生长，对15g/L或更高浓度的磺胺胍具有抗性。
2.本发明中采用琥珀酸提高小白链霉菌ε-PL产量的原因是：在以琥珀酸为唯一碳源的培养基上快速生长的突变菌内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)到草酰乙酸(OAA)途径加强，增加了天冬氨酸、前体L-赖氨酸的供应和ε-PL的合成。
3.本发明选用的磺胺胍是天冬氨酸的结构类似物。向培养基中加入磺胺胍会明显抑制微生物的生长，选育磺胺胍抗性菌株可以增加L-赖氨酸的供应和ε-PL的合成。
4.本发明的诱变小白链霉菌M-Z18已于已于2019年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019589；保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
下面具体叙述本发明的实施方式。
实施例1：小白链霉菌M-Z18的选育
贝特纳固体培养基：葡萄糖2％，酵母提取物0.2％，蛋白胨0.4％，琼脂2％，均为质量-体积分数，pH 7.5，115℃灭菌20min。
以琥珀酸为碳源的固体培养基：琥珀酸2％，酵母提取物0.2％，蛋白胨0.4％，琼脂2％，均为质量-体积分数，pH 7.5，115℃灭菌20min。
具体步骤如下：
(1)将土壤中筛选获得的野生菌小白链霉菌Z-18制备的10～100μL孢子悬浮液均匀涂布于火焰灼烧冷却的金属载片上，在常温常压等离子(ARTP)诱变系统操作(仪器功率为100W，气流量为10SLM)下处理50～400s；
(2)将经步骤(1)处理的野生菌Z-18孢子接种于贝特纳固体斜面培养基上，30℃恒温培养5-8天后，将其孢子悬浮在5mL磷酸缓冲液中(0.2mol/L，pH 7.0)获得新鲜成熟的孢子(浓度为1×107～1×108CFU/mL)。吸取菌悬液，经常温常压等离子诱变100-400s后，稀释涂布于以琥珀酸为碳源的固体平板上培养5-8天后再次制备5mL孢子悬浮液，并加入200μL甲基磺酸乙酯，随后用钴-60(γ射线)处理所获孢子悬浮液，接种于含有磺胺胍和甘氨酸的贝特纳固体培养基上，30℃恒温培养5～8天，选取生长速度快、产孢能力强、菌落形态变化大的菌株至斜面培养基中划线培养，30℃恒温培养5～8天至孢子成熟。评价所得诱变菌株的ε-PL产量和产率，获得高产突变株M-Z18。
(3)对出发菌Z-18与在琥珀酸为碳源平板上快速生长、具有高浓度磺胺胍抗性的诱变菌株的评价如下：
(a)Z-18和M-Z18在琥珀酸为碳源平板上的生长情况
将亲本菌株Z-18和诱变菌株M-Z18接种至琥珀酸为碳源的固体培养基上(如上述)，30℃恒温培养1～7天，观察Z-18与M-Z18在培养基上的生长速度，结果示于表1。
表1 Z-18和M-Z18在琥珀酸为碳源固体培养基上的生长速度
Figure BDA0002247043810000051
注释：+生长，±生长较少，—无生长。
本发明诱变菌株M-Z18能在琥珀酸为碳源的培养基上快速生长，可以与亲本菌株Z-18明确区分。
(b)Z-18和M-Z18对磺胺胍的抗性
将亲本菌株Z-18和诱变菌株M-Z18接种至贝特纳固体培养基上(如上述)，培养基中加入的磺胺胍浓度如下表所示，30℃恒温培养1～7天，观察Z-18与M-Z18在培养基上的生长情况，结果示于表2。
表2 Z-18和M-Z18含磺胺胍的固体培养基生长速度
Figure BDA0002247043810000061
注释：+生长，±生长较少，－无生长。
本发明诱变菌株能对磺胺胍具有明显抗性，可以与亲本菌株明确区分。
实施例2：出发菌Z-18与诱变小白链霉菌M-Z18的形态特征
通过微生物形态特征和理化特征鉴定，比较出发菌Z-18与诱变菌株M-Z18的特性，具体如下：
1、形态特征
菌株Z-18在含酵母膏或蛋白胨的培养基上气生菌丝生长良好，孢子丝呈波曲状，孢子呈浅灰色链状，在显微镜下呈椭圆形；菌落及其背面呈黄色。
菌株M-Z18在蛋白胨酵母膏培养基上气生菌丝生长良好，孢子丝呈螺旋状或波曲状，孢子呈深灰色链状，在显微镜下呈椭圆形；菌落及其背面呈黄色或黄褐色。
2、培养特征
30℃恒温培养5～8天，观察Z-18与M-Z18在各种培养基上的特征。
表3 Z-18的培养特征
Figure BDA0002247043810000062
表4 M-Z18的培养特征
Figure BDA0002247043810000071
3、生理生化特征
(1)培养温度：Z-18的培养温度为20～40℃，最适温度为30℃；M-Z18的培养温度为25～35℃，最适温度为30℃。
(2)明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化：均为阳性。
(3)牛奶凝固：均为阳性。
(4)纤维素应用：均为阴性。
(5)H2S生成：均为阴性
(6)几丁质酶产生：均为阴性
(7)色素产生：无
实施例3
M3G种子培养基：葡萄糖5％，(NH4)2SO4 1％，Na2HPO4 0.14％，KH2PO4 0.1％，MgSO7·H2O 0.025％，ZnSO7·H2O 0.005％，FeSO7·H2O 0.001％，酵母粉0.5％，pH 6.8，115℃灭菌20min。
RSM液体发酵培养基：甘油6％，(NH4)2SO4 0.5％，牛肉浸膏1％，KH2PO4 0.4％，MgSO4 0.08％，FeSO4 0.005％，均为质量-体积分数，115℃灭菌20min，自然pH发酵。
将纯化的M-Z18孢子接种于分装有M3G的种子培养基中，30℃×200rpm摇瓶培养24h制备成为种子液。将种子液以8％的接种量接种于RSM发酵培养基，摇瓶发酵培养72h。利用甲基橙检测法检测所得突变株发酵上清液中ε-PL的含量为1.8g/L，菌株生产效率为0.45g/L/d。小白链霉菌M-Z18的菌体形态如图1所示。
实施例4：利用小白链霉菌M-Z18菌株以甘油为碳源进行5L规模的补料发酵合成ε-PL
将3L的RSM发酵培养基装入5L的生物反应器，115℃灭菌20min。将斜面上活化的菌株M-Z18接种于M3G种子培养基中，30℃×200rpm摇瓶培养24h制备成为菌浓1×108～5×108CFU/mL种子液。种子和发酵培养基的配制方法同实施例3。将种子液以8％的接种量接入冷却后的发酵液中，在192h的整个发酵过程中，使用生物反应器控制温度30℃，通气量1vvm，调控转速控制溶氧为30％，以5mol/L氨水控制pH为4.0，流加甘油控制碳源浓度≤10g/L(经实验证实，甘油浓度高于10g/L会抑制菌体生长)。发酵上清液采用甲基橙比色法或检测高效液相色谱检测ε-PL含量，结果如图2所示。在整个发酵过程中，菌株始终具有活力，ε-PL浓度逐步增加，说明菌株具有较强的ε-PL合成能力，在发酵192h时ε-PL的浓度为36.95g/L，生产效率高达4.62g/L/d。
实施例5：利用小白链霉菌M-Z18菌株以甘油为碳源进行50L规模的补料发酵合成ε-PL
将35L的RSM发酵培养基装入50L的生物反应器，115℃灭菌20min。将一茄子瓶活化的菌株M-Z18接种3.5L的M3G种子培养基中，30℃条件下在5L生物反应器中培养24h制备成为种子液。种子和发酵培养基的配制方法同实施例3。将种子液以8％的接种量接入冷却后的发酵液中，在192h的整个发酵过程中，使用生物反应器控制温度30℃，通气量1vvm，调控转速控制溶氧为30％，以5mol/L氨水控制pH为4.0，流加甘油控制碳源浓度≤10g/L。发酵上清液采用甲基橙比色法或检测高效液相色谱检测ε-PL含量。结果如图3所示，在整个发酵过程中，菌株始终具有活力，ε-PL浓度逐步增加，说明菌株具有较强的ε-PL合成能力，在发酵186h时ε-PL的浓度为36.22g/L，生产效率高达4.53g/L/h。
实施例6：利用小白链霉菌M-Z18菌株以甘油为碳源进行1m3规模的补料发酵合成ε-PL
将700L的RSM发酵培养基装入1m3的生物反应器，115℃灭菌20min。将2只茄子瓶活化的菌株M-Z18接种100L的M3G种子培养基中，30℃条件下在5L生物反应器中培养至pH降至4.5。将种子和发酵培养基的配制方法如上述。将种子液以12％的接种量接入冷却后的发酵液中，在192h的整个发酵过程中，使用生物反应器控制温度30℃，初始转速为100r/min，调控转速控制溶氧为20％，以5mol/L氨水控制pH为4.0，流加甘油控制碳源浓度在1～10g/L。发酵上清液采用甲基橙比色法或检测高效液相色谱检测ε-PL含量。结果如图4所示，该实施重复了3批次，ε-PL在发酵192h的平均产量为31.3g/L，相对偏差为1.5g/L，这是目前国内报道1m3生物反应器上ε-PL产量首次超过30g/L。
实施例7：利用小白链霉菌M-Z18菌株以葡萄糖：甘油(1：1)为混合碳源进行控酸分批补料发酵合成ε-PL
以RSM为基础培养基，分别以摩尔比为1:1的葡萄糖-甘油为混合碳源对小白链霉菌进行控酸发酵。将斜面上活化的菌株M-Z18接种M3G种子培养基中，30℃×200rpm摇瓶培养24h制备成为种子液。将种子培养液以8％接种量接与RSM发酵培养基(60g/L的甘油被30g/L葡萄糖+30g/L甘油替换)中，在192h的整个发酵过程中，使用生物反应器控制温度30℃，通气量1vvm，调控转速控制溶氧为30％，以5mol/L氨水控制pH为4.0，流加甘油控制碳源浓度在2～10g/L。发酵上清液采用甲基橙比色法检测高效液相色谱检测ε-PL含量。发酵结果如图5所示，在整个发酵过程中，小白链霉菌M-Z18菌株始终具有活力，菌体浓度逐步增加，说明菌株可具有持续生产ε-PL的能力，在发酵174h时ε-PL的浓度为35.14g/L，生产效率为4.85g/L/h。
实施例8：小白链霉菌M-Z18菌株在pH冲击策略下发酵合成ε-PL
进行5L规模的pH冲击策略的分批次补料发酵。采用生物反应器，将小白链霉菌M-Z18以15％的接种量接种于RSM发酵培基中，调控发酵液pH在5.0～6.0一段时间后下降至最低点3.0，持续8～15h后采用5mol/L浓度的氨水将发酵液的pH控制4.0。发酵于30℃×(200～800)rpm搅拌通气条件下进行，通风量设定为1vvm，调控转速控制溶氧为30％。为避免高浓度甘油和硫酸铵对菌体生长的抑制，于发酵40h时开始补充甘油碳源和硫酸铵氮源。整个发酵过程将甘油碳源和硫酸铵氮源的浓度分别控制在1～10g/L和0.2～0.5g/L。发酵结果如图6所示，ε-PL在发酵192h的浓度为54.7g/L，生产效率高达6.83g/L/d，超过了国际最高ε-PL产量(48.3g/L)和ε-PL产率(6.03g/L/d)，证明M-Z18是一株极具潜力的ε-PL工业生产菌株。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一株小白链霉菌(Streptomyces albulus)M-Z18，已于2019年7月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019589；保藏地址为中国，武汉，武汉大学。
2.含有权利要求1所述小白链霉菌的组合物。
3.一种微生物制剂，其特征在于，含有权利要求1所述小白链霉菌，活菌数≥1×104CFU/g或1×104CFU/mL。
4.权利要求2所述的组合物或权利要求3所述的微生物制剂，其特征在于，还含有细胞保护剂。
5.权利要求1所述的小白链霉菌M-Z18在制备ε-聚赖氨酸或其衍生产品方面的应用。
6.一种生产ε-聚赖氨酸的方法，其特征在于，利用权利要求1所述的小白链霉菌在含碳源的培养基中进行发酵。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以葡萄糖、甘油、琥珀酸、果糖、蔗糖、麦芽糖乳糖或阿拉伯糖为中的至少一种为碳源，和/或以有机氮源牛肉膏、酵母提取物、蛋白胨、鱼粉、玉米浆等，以及无机氮源(NH4)2SO4、NH4Cl、NH4 NO3中的至少一种为氮源，经微生物发酵合成ε-PL。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，在28～30℃发酵120～192h；发酵过程调控pH为3.5～4.0。
9.根据权利要求6～8所述的方法，其特征在于，在发酵第35～40h补加终浓度为700～900g/L的碳源和终浓度为30～40g/L的氮源；所述碳源包括但不限于甘油；所述氮源包括但不限于硫酸铵。
10.权利要求1所述的小白链霉菌在发酵生产氨基酸、有机酸或抑菌物质方面的应用。
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