RO118786B1

RO118786B1 - Tulpină de pseudomonas chlororaphis, compoziţie şi metodă pentru controlul bolilor plantelor

Info

Publication number: RO118786B1
Application number: RO96-01996A
Authority: RO
Inventors: Berndt Gerhardson; Annika Gustafsson; Tiiu Jerkeman; Britt Marie Jingstrom; Lennart Johnsson; Margareta Hokeberg
Original assignee: Svenska Lantmannen, Riksforbund Ek. For.
Priority date: 1994-04-18
Filing date: 1995-04-13
Publication date: 2003-11-28
Also published as: CA2187927A1; AU2354795A; NO964359D0; BG62753B1; CA2187927C; EE9600164A; EE03414B1; EP0756454B1; WO1995028085A1; FI964162A0; NL350040I1; LV11718A; SE9401307L; NL350040I2; DE69511691D1; PL316910A1; JP3536180B2; BG100919A; NO964359L; HU9602828D0

Abstract

Invenţia se referă la o tulpină de Pseudomonas chlororaphis depusă la The National Collection of Industrial and Marine Bacterio Limited, Aberdeen Scotland, cu numărul de depozit NCIMB 40616, la o compoziţie pentru controlul bolilor cauzate de fungii patogeni la plante, compoziţie care conţine ca ingredient activ tulpina de Pseudomonas chlororaphis şi la o metodă de control a bolilor cauzate de fungi parogeni la plante cuprinzând introducerea unei doze eficiente dintr-un ingredient activ în mediul în care agentul care induce boala este inhibat. ŕ

Description

Invenția se referă la un nou soi de tulpini bacteriene de Pseudomonas chlororaphis și la o compoziție conținând această tulpină bacteriană sau metaboliții activi patogenici ai acesteia și la o metodă de control al bolilor cauzate de fungi patogenici la plante.

Sunt cunoscuți câțiva agenți de natură microbiană cu capacitatea de a induce boli plantelor, care cauzează pagube considerabile și, în consecință, pierderi economice, la plantele recoltate. Mulți dintre aceștia atacă frunzele și/sau alte părți de suprafață ale plantelor și apoi, în mod obișnuit, ajung până la recoltele noi, necontaminate, prin spori aeropurtați. Alții se transmit de la o generație de recoltă la următoarea, prin însămânțare, prin împrăștiere și câțiva agenți de inducere a bolii, importanți din punct de vedere economic, sunt împrăștiați în sol și sunt, mai mult sau mai puțin, inactivi, până crește o recoltă impresionabilă.

Procedurile folosite pentru controlul agenților microbieni de inducere a bolii în producerea recoltelor sunt câteodată costisitoare, dar în cele mai multe sisteme de creștere a recoltelor sunt necesare din punct de vedere economic. O metodă extrem de folosită este tratarea cu substanțe chimice biostatice sau biocide. Acestea, în cele mai multe cazuri, sunt aplicate prin pulverizare pe recoltele în creștere, prin tratări ale seminței sau rădăcinii sau ca dezinfectanți ai solului. Alte metode obișnuite sunt dezvoltate pentru rezistența și administrarea sistemului însuși de recoltare.

Toate aceste metode obișnuite de control au câteva neajunsuri. Organizarea sistemului de recoltare este eficace sau convenabilă numai pentru anumite probleme de boală. De asemenea, creșterea rezistenței plantelor de recoltă este posibilă sau potrivită numai în anumite cazuri, poate avea loc timp îndelungat și rezistența obișnuită poate fi distrusă după puțin timp, prin apariția unor noi tulpini de patogeni. Adesea, compușii chimici sunt foarte eficienți, dar pot da efecte neașteptate în mediul înconjurător și necesită manipulare atentă, fiind la fel de riscanți pentru sănătatea umană și, de asemenea, pot deveni ineficienți când tulpinile patogene prezintă rezistență.

Utilizarea agenților biologici de control sau biopesticidelor poate fi mai eficace sau mai preferabilă decât utilizarea altor metode de control și de aceea, astfel de agenți au fost încercați în mod extensiv. Se cunosc tulpini bacteriene și de fungi care inhibă creșterea diferiților agenți microbieni de inducere a bolii. Pentru a fi eficienți și utilizabili, aceștia trebuie să fie stabili, să dea rezultate reproductibile pe câmp și să prezinte posibilități de aplicare în condițiile de pe câmp. Până acum, puțini dintre aceștia au îndeplinit cerințele de mai sus, fiind folosiți ca produse comerciale.

Problema pe care o rezolvă invenția este de a prezenta o nouă tulpină de Pseudomonas chlororaphis, o compoziție pentru controlul bolilor cauzate de fungi patogeni la plante și o metodă de control a bolilor cauzate de fungi patogeni la plante.

Tulpina de Pseudomonas chlororaphis, conform invenției, este depusă la The Național Collection of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB), Aberdeen, Scotland cu numărul de depozit NCIMB 40616 sau culturi pure biologic ale acesteia, având capacitatea de a produce metaboliți activi antipatogenici sau mutanți ai acestora, având, în principal, aceleași caracteristici ca tulpina parentală.

Compoziția pentru controlul bolilor cauzate de fungi patogeni la plante, conform invenției, conține ca ingredient activ microorganismul definit în revendicarea 1 sau bulionul acestei culturi care conține metaboliți activi antipatogeni ai acestora.

Metoda de control a bolilor cauzate de fungi patogeni la plante, cuprinzând introducerea unei doze eficiente dintr-un ingredient activ în mediul în care agentul care induce boala este inhibat, ingredientul activ este microorganismul definit în revendicarea 1 sau bulionul acestei culturi care conține metaboliți activi antipatogenici ai acestora sau sub forma unei compoziții farmaceutice, definit în revendicarea 2.

RO 118786 Β1

Prin aplicarea invenției, se obțin următoarele avantaje: atât tulpina de Pseudomonas chlororaphis, cât și compoziția realizată cu această tulpină este stabilă, dă rezultate repro- 50 ductibile pe câmp și prezintă posiblități de aplicare în condițiile de pe câmp.

Prezenta invenție se referă la un agent biologic de control, util și eficient în controlarea atacurilor patogene la plante, în creșterile de plante comerciale. Se prezintă o nouă tulpină (MA 342) a bacteriei Pseudomonas chlororaphis care prezintă caracteristicile dorite. Izolatul s-a depozitat la The Național Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, 55 Aberdeen, Scotland, la 14 februarie 1994 în condițiile Tratatului de la Budapesta și a primit numărul de depozit NCIMB 40616.

De asemenea, invenția se referă la o compoziție de control al bolilor la plante conținând ca ingredient activ tulpina nouă MA 342 sau mutanți ai acesteia, în principal, cu aceleași caracteristici sau metaboliți activi din punct de vedere antipatogenic sau derivați ai 60 acesteia. Mai departe, invenția se referă la o metodă de control al bolilor la plante care folosește tulpina nouă de MA 342 sau mutanții acesteia, în principal, cu aceleași caracteristici sau metaboliți activi antipatogenici sau derivați ai acesteia.

în continuare, se prezintă 8 exemple de realizare a invenției în legătură și cu figura care reprezintă profilul acidului gras obținut cu Microbial Identification System (MIDI, Newark 65 Ltd, SUA).

Se prezintă, în continuare, o caracterizare a noii tulpini bacteriene și o descriere a metodelor preferate pentru proliferarea tulpinei și pentru formulări și aplicări pe câmp sau în sere. Exemplele prezentate ilustrează, dar nu limitează, metoda și compoziția invenției.

Caracterizarea tulpinei noi bacteriene MA 342 70

Caracteristici morfologice: morfologia coloniei pe TSA10 (10 g de bulion de soia triptic (Difco Ltd); 12 g agar tehnic (Oxid Ltd) în 1000 ml apă distilată) este sferică, albă, din colonii moderate convex, care formează vizibil cristale vitroase în agar cu densități celulare ridicate. Dacă este un bacii gram negativ acesta prezintă o fluorescență galben strălucitoare pe mediile Kings B (1,5 K₂HPO₄; 1,5 g MgSO₄; 7 Η,Ο; 20 g peptonă de protează (Difco Ltd); 75 10 ml glicerină, 15 g agar Bacto (Difco Ltd) în 1000 ml apă distilată).

Analiza de acid gras: Profilul acidului gras al bacteriei este arătat în figura 1. Această analiză se realizează folosind Microbial Identification System (MIDI Ltd., Newark, USA), versiunea 3,7. în conformitate cu acest program de testare, MA 342 este cel mai asemănător cu Pseudomonas chlororaphis, cu un indice de corecție de 0,705. 80

Caracteristici testate în testul rapid API 20 NE*	Reacția izolatului de MA 342
Reducere de nitrat	-
Producere de indol	-
Acid din glucoză	-
Dihidrolaza argininei	+
Urează	-
Hidroliza esculinei	-
Hidroliza gelatinei	+
B-galactosidoză	-
Asimilare de glucoză	+

RO 118786 Β1

Tabel (continuare)

Caracteristici testate în testul rapid API 20 NE*	Reacția izolatului de MA 342
Asimilare de arabinoză	-
Asimilare de manoză
Asimilare de manitol	+
Asimilare de N-acetil-glucozamină	-
Asimilare de maltoză	-
Asimilare de gluconat	+
Asimilare de caprinat	-
Asimilare de adipat	-
Asimilare de malat	+
Asimilare de citrat	+
Asimilare de fenil-acetat	-
Citocrom oxidază	+
Caracteristici testate în teste suplimentare
Producere de levan	-
Asimilare de xiloză	-?
Asimilare de sorbitol	+?

Metode preferate pentru proliferarea tulpinei și pentru formulări și aplicări pe câmp sau în sere

Cantitățile din tulpina activă sunt obținute cel mai bine, printr-un proces de fermentație, care cuprinde inocularea unei probe dintr-o cultură pură a tulpinei într-o cultură în vibrare de lichid sau într-un fermentator care conține un mediu corespunzător de fermentație. De asemenea, tulpina poate crește pe o suprafață sterilă, de exemplu, o suprafață de agar și când se cultivă în afară, celulele pot fi suspendate în apă sau alt mediu lichid cunoscut în literatură. Mediile de cultură pot fi, în principal, orice mediu bacterian de cultură cunoscut în literatură. Fermentația are loc până când se obține o concentrație suficientă de celule, de culturi lichide, de exemplu: 5·10⁹ cfu. Bulionul astfel obținut prin fermentație sau suspensia bacteriană pot fi utilizate, ca atare, în scopul de a proteja planta sau pot fi tratate sau formulate înainte de a fi folosite.

într-un tip de tratare celulele bacteriene, în bulionul de la fermentație, pot fi distruse complet, de exemplu, prin încălzire sau centrifugare și bulionul care rezultă sau supernatantul, conținând metaboliți bacterieni, poate fi folosit pentru scopuri de protejare a plantei cu sau fără purificare și/sau concentrare anterioare. Suspensiile bacteriene sau bulioanele de la fermentație pot fi, de asemenea, amestecate omogen cu unul sau mai mulți compuși sau grupe de compuși cunoscuți în literatură, compușii astfel obținuți sunt compatibili cu tulpinile bacteriene sau cu metaboliți activi antipatogenici sau cu derivați ai acestora. Compușii corespunzători pot fi aditivi pulverulenți sau purtători solizi, cum ar fi talc, caolin, bentonită sau montmorillonit, pulberi umectabile cunoscute în literatură, substanțe nutritive surse de carbon (cum ar fi glucoză, zaharoză și fructoză) sau substanțe nutritive bacteriene complexe (cum ar fi extract de drojdie, peptonă și triptonă bacteriologică), săruri ale metalelor, săruri

R0118786 Β1 ale acizilor grași, esteri ai acizilor grași, agenți tensioactivi ionici sau neionici, substanțe nu- 135 tritive ale plantelor, regulatori de creștere a plantelor, fungicide, insecticide, bactericide și altele. De asemenea, suspensiile bacteriene și bulioanele de la fermentație pot fi uscate sau uscate prin înghețare, înaintea sau după amestecarea cu compușii corespunzători, și produsul care rezultă se folosește pentru protejarea plantelor. O cale potrivită de uscare este, de exemplu, uscarea cu aer a vermiculitului alimentat cu bulionul bacterian de la fermentație. 140

Preparatele metabolice și bacteriene pot fi aplicate în orice mod cunoscut pentru tratarea semințelor, unităților vegetative de propagare, plantelor și solului cu tulpini bacteriene. Pulverizarea, atomizarea, prăfuirea, împrăștierea, peletizarea, impregnarea sau turnarea pot fi alese în conformitate cu obiectivul intenționat și circumstanțele predominante. Vitezele avantajoase de aplicare pentru tratarea seminței sunt cuprinse, în mod normal între 10¹¹ și 145 10¹² cfu/ha iar pentru pulverizare între 10¹² și 10¹⁴ cfu/ha sau pentru o cantitate corespunzătoare de metaboliți bacterieni.

Exemplul 1. Izolarea microorganismului MA 342

Rădăcinile noi, ascendente, ale plantei Empetrum nigrum, se spală cu apă într-o cană sterilă pentru a îndepărta pământul aderent. De la o rădăcină tânără, se taie o bucată 150 lungă de 2 - 3 cm și se prelucrează în condiții sterile. Bucata se preia din zona de deasupra suprafeței rădăcinii. Se fac mici tăieturi în bucata de rădăcină cu un scalpel înroșit la flacără. Apoi, bucata de rădăcină se freacă de suprafața de agar TSA 10. După ce bacteriile au crescut mari, MA 342 se selecționează și se cultivă pur, pe TSA 10.

Exemplul 2. Conservarea microorganismului MA 342 155

Cultura pură se răcește foarte mult în fiole mici, la -70°C. Ca agent protector de răcire se folosește glicerină 10% în vas cu apă, pH-ul se ajustează la 7,15 după autoclavare. După răcire la -70°C, fiolele se depozitează la -20°C.

Pentru conservare pe termen lung, izolatul se îngheață uscat. După creștere timp de h, pe agar TSA 10, peluza bacteriană se răzuie de pe suprafața de agar, se amestecă 160 cu un agent de protejare prin înghețare uscată (50 g Dextran T 70 (Pharmacia Fine Chemicals Ltd.); 50 g Na-L-glutamat de sodiu (Kebo AB) în 1000 ml apă distilată), se pune în fiole mici (20 ml) și se introduce într-un uscător prin înghețare Hetosicc (Heto, Ltd., Denmark) timp de 24 h. După uscarea prin înghețare, fiolele se etanșează impermeabil la gaze cu dopuri de cauciuc și se păstrează la 4°C. 165

Exemplul 3. Efectul lui MA 342 împotriva lui Microdochium nivale în testele primare în sere

Bacteriile se aplică semințelor de grâu, după cum urmează: 24 h culturilor mature pe TSA 10, se cultivă la 15°C, se răzuie de pe suprafața de agar a unei forme concave Petri, de 9 cm și se amestecă cu 40 ml de bulion nutritiv (SNB: 18 g zaharoză; 5 g peptonă bacte- 170 riană (Oxoid Ltd.); 2 g extract de drojdie (Oxoid Ltd.); 0,5 g I^HPCY și 0,25 MgSO₄. 7 H₂O în 1000 ml apă distilată și pH-ul se ajustează la 7,2 - 7,4) și 40 ml dintr-o soluție 2% (masă/volum) de carboximetil celuloză de sodiu (CMC) în apă distilată sterilă. Acest amestec se trece peste semințe. După 20 de min, excesul de amestec se îndepărtează și semințele se usucă peste noapte cu un ventilator. 175

Pentru fiecare tratare în acest test în seră, două recipiente se însămânțează cu 50 de semințe în fiecare recipient. Recipientele sunt de 18 cm în diametru și 4 cm în înălțime și se umplu două treimi cu un amestec de turbă comercială nesterilizată (Enhetsjord K. Normal), amestecată cu 20% (v/v) nisip.

Semințele de grâu, de iarnă (cv. “Kosack”) sunt infestate artificial cu M. nivale înain- 180 tea tratării cu bacterii. Agentul patogen se cultivă timp de 7 zile în bulion de dextroză din cartof (24 g bulion de dextroză din cartof (Difcvo Ltd.), per 1000 ml apă distilată), la temperatura camerei, într-un vibrator rotativ. Șlamul care rezultă se omogenizează cu un agitator de

RO 118786 Β1 bucătărie și se toarnă peste semințe. După 30 min, lichidul se îndepărtează și semințele se lasă să se usuce cu un ventilator peste noapte. Semințele astfel infestate se tratează apoi cu MA 342 și se însămânțează în recipiente, după cum s-a descris mai sus.

După însămânțare, recipientele se acoperă cu capace de sticlă și se așază la întuneric la 6°C. După 5 zile, capacele se îndepărtează, fiecare recipient se spală cu 100 ml de apă și se așază în interiorul unei pungi de plastic de 51 care este așezată pe două bețișoare de lemn. Recipientele se așază apoi într-o seră la 12 - 15°C, timp de 8 zile.

S-au testat următoarele tratări ale semințelor:

1. tulpină de P. Chlororaphis MA 342 amestecată cu SNB/CMC, pe semințe infestate de M. nivale;

2. semințe infestate de M. nivale, ca control al bolii;

3. semințe netratate ca control al rezistenței.

Efectul supresiv al bolii s-a înregistrat ca procentaje de plante răsărite rezistente (= fără micelii), în afara celor însămânțate. Rezultatele de la o testare primară cu M. nivale sunt prezentate în tabelul 1.

Tabelul 1

Efectul lui MA 342 asupra răsării și dezvoltării bolii la grâu, toamna, cultivat din semințe infestate cu M nivale

Tratare	Procentaj (%)	Procentaj (%) al plantelor rezistente în afara celor însămânțate
1. MA 342	87	81
2. Controlul bolii	13	7
3. Controlul celor netratate	90	89

Exemplul 4. Efectul lui MA 342 împotriva lui Drechslera teres în testele secundare în seră

Pentru aceste teste, izolatul MA 342 se cultivă și crește timp de 48 h în bulion de soia triptic semiconcentrat (15 g/l) (Difco Ltd.), într-un vibrator rotativ, la întuneric, la 18 - 20°C. Semințele de orz din cultivator “Golf”, infectate în mod natural cu D. teres s-au amestecat apoi cu 300 ml de suspensia bacteriană care rezultă per kg de sămânță într-o pungă de plastic și după amestecare, punga s-a scuturat timp de circa 4 min. Semințele astfel tratate s-au uscat cu un ventilator, la temperatura camerei, timp de o zi și apoi s-au însămânțat întrun recipient, cum s-a descris în exemplul 3.

Recipientele însămânțate, 3 pe tratare, s-au așezat mai întâi la întuneric, la 6°C, timp de 7 zile și apoi într-o seră la circa 20°C, cum s-a descris în exemplul 3. Pentru terminarea tratării s-au numărat efectele frecvenței plantelor germinate și frecvenței plantelor cu atac primar asupra primei frunze. Efectul bacterian s-a asociat cu un control netratat și cu semințe tratate cu fungicid Panoctine Plus 400 (guazatin 150/g/l + imazalil 10 g), RhânePoulene Ltd., într-o doză de 4 ml per kg sămânță.

Tabelul 2

Efectul lui MA 342 și al Panoctinei Plus 400 împotriva D, teres la orz într-un test secundar într-o seră tip

Tratare	Plante germinate (%)	Plante cu atac pe prima frunză (%)
Control	92,5	13
Panoctine Plus 400, 4 ml/kg	95,5	0
MA 342, 300 ml/kg	96,1	0

RO 118786 Β1

235

Exemplul 5. Efectul lui MA 342 asupra patogenilor din plante în experimente pe câmp

Experimentele de pe câmp, aranjate haotic sub formă de blocuri și cu repetări de la 3 la 8, au dimensiunile parcelei variind, între experimente, de la 0,15 m² (un experiment cu T. caries) la circa 15 m² (cele mai multe experimente). Experimentele s-au desfășurat în diferite localități din Suedia și în cele mai multe cazuri pe soluri argiloase cu circa 3% conținut de humus.

Tratările semințelor cu bacterii și cu Panoctine Plus 400 s-au făcut cum s-a descris mai sus, în exemplul 4. După ce au fost tratate semințele, au fost uscate cu un ventilator și au fost depozitate la temperatura camerei pentru timpi diferiți, înainte ca acestea să fie însămânțate în recipiente pe câmp. Toate semințele cu excepția celor infestate cu T. caries, s-au infectat sau infestat natural, cu diferite boli testate. Semințele de grâu de iarnă (cv. “Kosack”) s-au infestat artificial cu spori de T. caries prin amestecarea cu 2 g spice măcinate T. caries cu 1 kg semințe de grâu.

Efectul lui MA 342 pe Tilletia caries

Efectul s-a înregistrat ca frecvență a spicelor infectate la timpul de coacere. Rezultatele obținute în două experiențe în 1991/1992 și două experiențe în 1992/1993 s-au prezentat în tabelul 3. Diferența între tratarea bacteriană și tratarea fungicidă este semnificativă în 1992/1993.

Tabelul 3

240

245

250

Efectul suspensiei bacteriene MA 342 Împotriva seminței care a suportat infecția cu Tilletia caries

Tratare	Spice infectate %
1991/1992	1992/1993
Control	23	65
Panoct. 400*, 4 ml/kg	2	24
MA 342, 300 mg/kg	0	9

* Panoctine 400 (guazatin 150 g/l), Rhone - Poulec Ltd.

255

260

Efectul lui MA 342 pe Drechslera teres, D. Graminea, D. avenae și Ustilago avenae în experimentele de pe câmp cu acești patogeni, s-au măsurat numărul de plante germinate per m² și numărul de plante infectate per m² și, în plus, în cele mai multe experimente s-au măsurat de asemenea: i) randamentul cerealelor; ii) greutatea a 1000 de sâmburi; iii) greutatea per hectolitru.

Efectul asupra Drechslera teres

Rezultatele din experimentele din câmp, realizate în 1991 - 1993, când s-au testat efectele împotriva infecției cu D-teres la orz, sunt prezentate în tabelele 4, 5 și 6.

Tabelul 4

265

270

Rezultate de la 4 experimente de pe câmpul cu orz infectat cu Drechslera teres în 1991. Valorile de la 4 experimente realizate în Alnarp, Lanna, Strângnâs și Ultuna

Tratare	Randament kg/ha	Nr. de plante /m²	Plante infectate /m²	Greutate a hectolitrului, kg	Greutatea a 1000 sâmburi
Control	4970	361	47	64,7	41,5
Pan. Plus 400, 4 ml	5390	353	1	66,3	43,8
MA 342, 300 ml/kg	5480	353	1	66,0	43,7

275

280

RO 118786 Β1

Tabelul 5

Rezultate de la 5 experimente de pe câmpul cu orz infectat cu Drechslera teres în 1992. Valorile de la experimentele realizate în Svalof, Nygard, Ultuna și Robâcksdalen

Tratare	Randament kg/ha	Nr. de plante /m²	Plante infectate /m²	Greutatea hectolitrului, kg	Greutatea a 1000 sâmburi
Control	4290	358	48	67,9	51,7
Pan. Plus 400, 4 ml	4380	378	1	67,8	50,5
MA 342, 300 ml/kg	4300	380	1	68,3	52,6

Tabelul 6

Rezultate de la 2 experimente de pe câmpul cu orz infectat cu Drechslera teres în 1993.

Valorile de la experimentele realizate în Kolbock și Ultuna

T ratare	Randament	Plante infectate/m²
Control	6310	74
Pan. Plus 400, 4 ml	6730	1
MA 342, 200 ml/kg	6720	5

Efectul asupra Drechslera graminea. Rezultatele de la experimentele cu semințe infectate cu D. Graminea, realizate în 1991-1992, sunt prezentate în tabelele 7, 8 și 9.

Tabelul 7

Rezultate de la un experiment de pe câmpul cu orz infectat cu D. graminea realizat în Uppsala

Tratare	Randament	Plante infectate/m²
Control	3440	31
Pan. Plus 400, 4 ml	4160	2
MA 342, 300 ml/kg	4390	1

Tabelul 8 Rezultate de la 5 experimente realizate în 1992 pe câmpul cu orz infectat cu D. Graminea.

Valori de la experimente realizate în Svalov, Nygard, Kolbâck, Ultuna și Robâcksdalen

T ratare	Randament kg/ha	Nr. de plante /m²	Plante infectate /m²	Greutatea hectolitrului kg	Greutatea a 1000 sâmburi g
Control	2590	388	101	66,2	40,2
Pan. Pis 400, 4 ml	3470	381	5	66,6	39,9
MA 342, 300 ml/kg	3460	368	7	66,2	39,8

Tabelul 9

Rezultate de la două experimente realizate în 1993 pe câmpul cu orz infectat cu D. graminea. Valori de la experimente realizate în Kolbâck și Ultuna

Tratare	Randament	Plante infectate/m²
Control	2810	46
Pan. Plus 400, 4 ml	4160	1
MA 342, 200 ml/kg	3390	8

RO 118786 Β1

Efectul asupra Drechslera avenae. Rezultatele de la experimentele cu semințe de ovăz, infectate cu D. Avenae, realizate în 1991-1993, sunt prezentate în tabelele 10, 11 și 12.

Tabelul 10

330

Rezultate de la un experiment de pe câmpul cu ovăz (“Puhti”) infectat cu D.avenae realizat în Uppsala

Tratare	Randament kg/ha	Nr. de plante/m²
Control	4940	74
Pan. Pis 400, 4 ml	4860	32
MA 342, 300 ml/kg	5090	17

335

340

Tabelul 11 Rezultate de la 4 experimente din 1992 de pe câmpul cu ovăz (“Puhti” și “Vital”) infectat cu D.avenae. Valori de la experimente realizate în Svalovși Ultuna

Tratare	Randament kg/ha	Nr. de plante /m²	Plante infectate /m²	Greutatea hectolitrului kg	Greutatea a 1000 sâmburi g
Control	3990	428	22	57,5	35,4
Pan. Pis 400, 4 ml	4080	456	13	57,8	35,5
MA 342, 300 ml/kg	4000	445	3	57,4	35,0

345

Tabelul 12

Rezultate de la un experiment de pe câmpul cu ovăz (“Vital”) infectat cu D avenae, realizat în Uppsala în 1993

Tratare	Randament	Plante infectate/m²
Control	7570	79
Pan. Plus 400, 4 ml	7870	14
MA 342, 200 ml/kg	7680	27

350

Efectul asupra Ustilago avenae. Pe câmp, experimentele cu snopi de spice infectate cu U. Avenae per m² sau procentele de snopi de spice s-au terminat la timpul de coacere. Greutatea cerealelor nu s-a măsurat. Rezultatele de la 3 experimente realizate între 1991 1993 s-au prezentat în tabelul 13.

Tabelul 13

355

360

Rezultate de la 3 experimente realizate între 1991 - 1993 în Uppsala pe câmpul cu ovăz infectat cu Ustilago avenae

T ratare	1991 Snopi de spice/m²	1992 % spice infectate	1993 snopi de spice/m²
Control	7	10,6	95
Panoctine Plus 400, 4ml	3	8,7	netestat
MA 342, 300¹⁾ ml/kg	1	1,7	15

”300 ml în 1991 și 1992; 200 ml în 1993

365

R0118786 Β1

Exemplul 6. Aplicarea lui MA 342 pe semințe și pe alte părți ale plantelor. Aplicarea amestecurilor apoase conținând MA 342 pe semințe

Suspensiile bacteriene preparate cum s-a descris în exemplul 3 sau cum s-a descris în exemplul 4, mai sus, s-au amestecat cu fiecare dintre substanțele sau compușii următori:

Pulbere de talc (Kebo Lab AB), 48 g/l de suspensie bacteriană;

Peptonă bacteriologică (Oxid, Ltd.), 5 g/l de suspensie bacteriană;

Tween 20 (Merck Ltd.), 20 g/l de suspensie bacteriană;

Metocel (eter de celuloză, Sveda Kemi AB), 12 g per litru de suspensie bacteriană; Lissapol (ICI Agrochemicals Ltd.), 1 g per litru de suspensie bacteriană;

Bond (Newman Agrochemicals Ltd), 1 g per litru de suspensie bacteriană.

în alte experimente, suspensiile bacteriene s-au centrifugat la 10.000 x g, timp de circa 10 min. și peletele care au rezultat s-au resuspendat în MgSO₄ 0,1 M sau în apă cu peptonă (5 g de peptonă bacteriologică (Oxid, Ltd.), per litru de apă din cană).

După agitarea puternică, suspensiile care au rezultat s-au aplicat pe semințe, cum s-a descris în exemplul 4 pentru suspensiile bacteriene neamestecate.

Aplicarea bacteriilor uscate prin îngheț pe semințele plantelor. Bacteriile MA 342 crescute într-o cultură agitată cum s-a descris în exemplul 4, s-au centrifugat și peleta care a rezultat s-a resuspendat într-o soluție de lapte degresat (200 g lapte praf degresat, Semper AB, Sweden, per litru de apă distilată sterilă) ca un agent de protecție, prin uscarea prin înghețare. Amestecul s-a înghețat sub forma unui strat subțire în recipiente de sticlă și apoi s-a uscat prin congelare în aceste recipiente, timp de 48 h, într-un uscător, prin înghețare Hetosicc (Heto Ltd., Denmark). Pulberea care a rezultat s-a depozitat la 4°C, în pungi de protecție sau în flacoane cu dop filetat până la utilizare. Pentru aplicarea pe semințe, pulberea s-a amestecat cu apă sau cu alte soluții apoase și apoi s-a aplicat pe semințe cum s-a descris în exemplul 4 pentru suspensiile bacteriene, sau aceasta s-a amestecat cu semințe în stare uscată prin scuturarea puternică a pulberii și semințelor (circa 10 g pulbere per kg semințe), într-un container de plastic.

Peletizarea semințelor tratate cu MA 342. Bacteriile MS 342, crescute într-un mediu de cultură amestecat cum s-a descris în exemplul 4 mai sus, s-au amestecat în rapoarte volumerice de 1:1 cu un umezitor (soluție apoasă 2% greutate/volum de carboximetilceluloză de sodiu sau soluție apoasă 50% greutate/volum de gumă arabică). Semințele s-au tratat cu acest amestec ca în exemplul 4 mai sus.

O cantitate în exces de bentonită (Dresser Minerals Inc.), sau pudră de talc (Kebb Lab AB) s-a adăugat apoi în punga de plastic, punga s-a umflat și s-a amestecat puternic, timp de câteva minute. După aceasta, semințele s-au răspândit pe o tavă mare cu un ventilator și s-au lăsat să se usuce la temperatura camerei.

Pulverizarea mugurilor de plante cu suspensii bacteriene. Bacteriile MA 342, crescute într-un mediu de cultură amestecată cum s-a descris în exemplul 4 mai sus, s-au încărcat în flacoane de pulverizare, manuale, din plastic, sau în flacoane de pulverizare pentru pulbere și apoi s-au pulverizat pe frunzele și pe mugurii plantelor. în alte tratări, bacteriile s-au centrifugat mai întâi la circa 10.000 x g, timp de 10 min, peleta s-a resuspendat în vasul cu apă și această suspensie bacteriană care a rezultat s-a folosit pentru pulverizarea frunzelor și mugurilor.

R0118786 Β1

Exemplul 7. Efectele metabolicilor purificați din MA 342 împotriva bolilor cauzate de

Drechslera teres în experimentele din seră. Izolatul MA 342 s-a cultivat timp de 48 h în semiconcentrat (15 g/l) bulion de soia triptic (Difco Ltd.), într-un vibrator rotativ, la întuneric, la

18-20°C. Suspensia bacteriană, care a rezultat, s-a centrifugat la 48.000 x g timp de 30 min.

și metaboliții din suspernatant s-au purificat apoi prin filtre Sep-pak C18 (Waters Associates) 415 după cum urmează:

1. 80 ml de supernatant s-au adăugat pe un filtru Sep-pak activat cu 10 ml de metanol;

2. filtrul Sep-pag s-a spălat mai întâi cu 5 ml de etanol 30% și apoi cu 5 ml de etanol

40%; 420

3. metaboliții s-au eluat cu 5 ml de etanol 70%;

4. eluatul cu etanol 70% s-a evaporat într-un evaporator rotativ până când un volum de 1,5 ml soluție apoasă s-a evaporat. Apoi s-a diluat cu apă până la un volum de 6,5 ml.

Semințe de orz în cultivator “Golf”, infectate natural cu D. teres s-au scufundat în

6,5 ml de soluție apoasă de metaboliți, timp de 30 min și s-au însămânțat apoi în recipiente 425 cu 50 de semințe per recipient. Recipientele s-au acoperit cu capace de sticlă și s-au așezat la întuneric, la 6°C. După 9 zile, s-au îndepărtat capacele și recipientele s-au așezat în seră la 15 - 22^QC, timp de circa 2 săptămâni. Plantele germinate și atacurile bolii s-au citit, cum s-a descris în exemplul 4, mai sus. Controalele folosite au fost 1) semințe netratate și 2) semințe tratate cu spernatant nepurificat prin filtru Sep-pak și conținând celule MA 342. 430

Tabelul 14

Efectul metaboliților purificați din MA 342 și supernatantului conținând celule MA 342 împotriva lui D, teres la orz într-o testare tipică în seră

Tratare	Plante germinate	Plante cu atac pe prima frunză
Control netratat	97,0	21,6
Supernatant cu celule MA 342	99,0	1,0
Eluat evaporat, fără celule	99,0	0,0

Exemplul 8. Rezultate ale testelor comparative ale izolatului MA 342 și ale altor 11 440 izolate de Pseudomonas chlororaphis primite de la diferite colecții de culturi izolate diferite de Pseudomonas chlororaphis, din afara Suediei având statele precizate în tabelul 15, s-au testat împreună cu izolatul MA 342, pentru efectul împotriva bolii frunzei pătate și pentru inducerea reacțiilor în testele biochimice, în conformitate cu sistemul testului API 20 NE. în plus, izolatele s-au comparat pentru apariția coloniei și formarea de 445 cristale pe plăcile cu agar. Cele 11 izolate din afara Suediei au fost din diferite țări și sunt depuse în 4 colecții de culturi, bine cunoscute, (tabelul 15).

Testul capacității de inhibare a bolii în testele din seră

Testele s-au realizat cu orz infectat cu Drechslera teres, cum s-a descris în exemplul și toate izolatele s-au testat simultan cu scopul de a obține o comparație adecvată. După 450 cum este evident din tabelul 1, rezultatele arată că MA 342 este clar unic în sensul că nici unul din celelalte izolate testate mai sus, nu are proprietăți la fel ca MA 342 în acest tip de test și anume, capacitatea de a inhiba infecția datorată lui Drechslera teres.

RO 118786 Β1

455

460

465

470

Tabelul 15

Denumiri, țara de origine și efectele lui MA 342 și altor 11 izolate de P. Chlororaphis împotriva infecției cu D. teres la orz în testele din seră

Denumirea izolatului	Țara de unde provine	Efectul pe frunza pătrată în testele din seră. Plantele infectate (%) după tratarea cu izolatul în cauză
MA 342	Suedia	9
USDA B 2075	Cehoslovacia	53
USDA B1869	Noua Zeelandă	60
USDA B14874	USA, Colorado	56
USDA B14869	USA, llinois	58
USDA B1854	USA, Louisiana	43
NCTC 1068	Anglia	54
NCTC 7357	Anglia	58
DSM 6508	Germania	56
ATCC 9446	USA	61
ATCC 17414	USA	50
ATCC 17811	USA	58
Control netratat		71

Inducerea reacțiilor în testele biochimice în conformitate cu sistemul testului API20 NE 475 Testele s-au realizat cum s-a descris mai sus. Rezultatele sunt prezentate în tabelul 2.

Acestea arată că MA 342 este unic în privința aceasta și poate fi diferențiat de celelalte 11 izolate testate. Câteva dintre izolatele testate, în conformitate cu acest test, nu pot fi considerate ca fiind fundamentale în speciile Pseudomonas chlororaphis.

RO 118786 Β1

RO 118786 Β1 m o m o

in m in

Izolat testat

ATCC 17811

+

1

+

17811

ATCC 17414

+

1

+

1

+

1

+

ATCC 9446

+

1

+

1

+

DSM 6508

+

1

+

1

+

NCTC 7357

+

i

+

NCTC 10686

+

1

+

1

+

1

B 1854

+

B 14869

+

1

+

1

+

B 14874

l

1

t

+

1

+

B 1869

+

1

+

1

+

B 2075

+

(

+

t

+

1

MA 342

1

+

1

+

1

+

Proprietate testată în testul API 20 NE

Asimilare de manoza

Asimilare de manitol

Asimilare de glcozamină

Asimilare de maltoză

Asimilare de gluconat

Asimilare de caprinat

Asimilare de adipat

Asimilare de malat

Asimilare de citrat

Asimilare de fenil-acetat

Citocrom oxidată

RO 118786 Β1

Comparația apariției conloniei și formării cristalelor pe tăvile cu agar. Izolatele s-au cultivat în cuve concave Petri pe TSA 10, așa cum s-a descris mai sus. S-au observat mici diferențe în apariția coloniei între toate izolatele diferite, dar toate izolatele nu pot fi diferențiate în acest mod. Cu toate acestea, izolatul MA 342 a fost singurul care a format cristale 520 vitroase tipice în agar și, de aceea, poate, prin această proprietate, să fie diferențiat de celelalte izolate.

Claims

Revendicări

525

1. Tulpină de Pseudomonas chlororaphis, caracterizat prin aceea că este depusă la The Național Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited, Aberdeen, Scotland cu numărul de depozit NCIMB 40616 sau culturi pure biologic ale acesteia, având capacitatea de a produce metaboliți activi antipatogeni sau mutanți ai acestora, având, în principal, aceleași caracteristici ca tulpina parentală. 530
2. Compoziție pentru controlul bolilor cauzate de fungi patogeni la plante, caracterizată prin aceea că, conține, ca ingredient activ, microorganismul definit în revendicarea 1 sau bulionul acestei culturi, care conține metaboliți activi antipatogeni ai acestora.
3. Compoziție conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că agentul patogen este fungul Drechslera teres. 535
4. Compoziție conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că agentul patogen este fungul Drechslera graminea.
5. Compoziție conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că agentul patogen este fungul Drechslera avenae.
6. Compoziție conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că agentul patogen 540 este fungul Microdochium nivale.
7. Compoziție conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că agentul patogen este fungul Tilletia caries.
8. Compoziție conform revendicării 2, caracterizată prin aceea că agentul patogen este fungul Ustilago avenae. 545
9. Compoziție conform revendicărilor 2-8, caracterizată prin aceea că ingredientul activ este în amestec cu o compoziție a unui purtător acceptabil în practica agricolă.
10. Compoziție conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că ingredientul activ este în amestec cu un purtător lichid.
11. Compoziție conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că ingredientul activ 550 este impregnat într-un material poros, solid.
12. Compoziție conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde aditivi care servesc ca substanțe aderente.
13. Compoziție conform revendicării 9, caracterizată prin aceea că aceasta cuprinde o sursă de substanță nutritivă. 555
14. Metodă de control a bolilor cauzate de fungi patogeni la plante cuprinzând intro- ducerea unei doze eficiente dintr-un ingredient activ în mediul în care agentul care induce boala este inhibat, caracterizată prin aceea că ingredientul activ este microorganismul definit în revendicarea 1 sau bulionul acestei culturi care conține metaboliți activi antipatogeni ai acestora sau sub forma unei compoziții definite în revendicarea 2. 560
15. Metodă conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că ingredientul activ se aplică pe semințe.

565

RO 118786 Β1
16. Metodă conform revendicării14, caracterizată prin aceea că ingredientul activ se aplică pe unități de propagare vegetativă a plantei.
17. Metodă conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că ingredientul activ se aplică pe plante.
18. Metodă conform revendicării 14, caracterizată prin aceea că ingredientul activ se aplică pe un mediu de cultură în care planta crește sau se află pentru a crește.