JPH10502803A - 植物の病害を防除するための組成物と方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、スコットランド所在のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッドに受託番号ＮＣＩＭＢ ４０６１６で寄託されている新規なシュードモナス・クロロラフィス菌株ＭＡ３４２、ならびに植物の真菌性病害を防除する組成物と方法における、該菌株の用途、またはほとんと同じ特性を有する該菌株の突然変異株または該菌株の抗病原的に活性な代謝産物もしくはその誘導体の用途を提供するものである。

Description

【発明の詳細な説明】 植物の病害を防除するための組成物と方法 技術分野 本発明は植物を保護する製品に関する。さらに詳しくは本発明は、細菌の種シ ュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｃｈｌｏｒｏｒａｐ ｈｉｓ）の新規な菌株（ＮＣＩＭＢ 受託番号４０６１６）、および植物病原性 微生物体の侵襲に対して植物を保護するために上記細菌菌株または植物生産中に 上記菌株が産生する抗生物質を含有する組成物を使用することに関する。 発明の背景 植物の病害を誘発する性質を有するいくつもの微生物体は、作物に大きな損害 を起こして経済的損失を与える。これら微生物体の多くは、葉および／または植 物の他の気中部分を侵襲し、次いで通常、空気伝染胞子によって新しい未感染作 物に到達する。他の微生物体は種子伝染性であるため一つの作物世代から次の作 物世代へ伝染し、そしていくつかの経済的に重大な病害誘発体は土壌伝染性であ り、感染しやすい作物が成長するまでは土壌中に多少不活性な状態で存在してい る。 作物生産中に病害誘発性微生物体を防除するために行う方法は高コストである ことが多いが、大部分の作物成長系で経済上必要である。広く使用される一方法 は、制生物（ｂｉｏｓｔａｔｉｃ）化学薬剤または殺生物化学薬剤によって処理 する方法である。これらの薬剤は、ほとんどの場合、成長中の作物への噴霧剤、 種子もしくは根の処理剤または土壌殺菌剤として施用される。他の標準的な方法 は、抵抗性を得るための品種改良と作付体系自体の管理である。 これらの標準的防除法はすべていくつかの欠点をもっている。作付体系を管理 することは、特定の病害の問題にのみ有効であるかまたは好都合であるに過ぎな い。また抵抗性を得るため作物植物の品種改良を行うことは、特定の場合のみ可 能かもしくは適切であり、長期間を要し、そして得られた抵抗性は、ある期間の 後、その病原菌の新しい株が出現して中断されることがある。化合物は非常に有 効なことが多いが、環境に望ましくない作用を与え、大部分は人の健康に対して 危険なので慎重に取扱う必要があり、また耐性病原菌株が発生して効果がなくな ることもある。 生物学的防除剤または生物農薬（ｂｉｏｐｅｓｔｉｃｉｄｅ）を使用すること は、他の防除法を用いるより有効かまたは好ましいので、このような薬剤は広く 試みられている。いくつもの細菌および真菌の菌株が、各種の病害誘発性微生物 体の成長を阻害することは公知である。これら菌株は、有効でかつ使用可能であ るためには、圃場で安定で再現性がある結果を与えなければならず、そして圃場 条件下で施用可能でなければならない。今までこれら菌株は大部分がこれらの必 要条件を満たしていないので商業製品としてほとんど使用されていない。 発明の簡単な説明 本発明は、植物の商業栽培時に植物病原体の侵襲を防除するのに有用でかつ有 効な生物学的防除剤を提供するものである。望ましい特性を示す細菌シュードモ ナス・クロロラフィスの新規な菌株（ＭＡ３４２）を提供するものである。その 分離株は、ブダペスト条約に基づいて１９９４年２月１４日付でスコットランド のアバディーンに所在のザ・ナショナル・コレクションズ・オブ・インダストリ アル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッド（Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｉｎｄｓｕｔｏｒｉａｌ ａｎｄ Ｍａｒｉｎ ｅ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｌｉｍｉｔｅｄ）（ＮＣＩＭＢ）に寄託してＮＣＩＭＢ 受託番号４０６１６を受けた。 また本発明は、新規な菌株ＭＡ３４２もしくはほとんど同じ特性を有するその 突然変異株、またはその菌株の抗病原的に活性な代謝産物もしくはその誘導体を 有効成分として含有する植物病害防除組成物も提供するものである。さらに本発 明は、新規な菌株ＭＡ３４２もしくはほとんど同じ特性を有するその突然変異株 、またはその菌株の抗病原的に活性な代謝産物もしくはその誘導体を用いる、植 物病害防除方法を提供するものである。 図面の簡単な説明 図１は、細菌分離株ＭＡ３４２についてマイクロビアル・アイデンティフィケ ーション、システム（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓ ｙｓｔｅｍ（ＭＩＤＩ Ｌｔｄ．社）米国ニューアーク）によって得た脂肪酸プ ロフィルを示す。 発明の詳細な説明 以下に、上記の新規な細菌菌株の特性解析を行い、そして菌株の好ましい増殖 方法および好ましい製剤法と圃場もしくは温室での好ましい施用法を説明する。 いくつもの実施例を提供してさらに例証するが本発明の方法と組成物を限定する ものではない。 新規な細菌菌株３４２の特性解析形態学的特性 ：ＴＳＡ１０〔１０ｇのＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ Ｂｒｏｔｈ（Ｄ ｉｆｃｏ Ｌｔｄ．社）；１２ｇのＴｅｃｈｎｉｃａｌ Ａｇａｒ（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．社）の含有の１０００ｍｌ蒸留水〕上のコロニーの形態は、寒天中に 高い細胞密度で肉眼でよく見える無色透明の結晶を生成する円形で白色の中程度 の凸状のコロニーである。この菌株は、Ｋｉｎｇｓ培地Ｂ〔１０００ｍｌ蒸留水 中、１．５ｇのＫ₂ＨＰＯ₄；１．５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ；２０ｇのＰｒｏｔ ｅｏｓｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｄｉｆｃｏ Ｌｔｄ．社）；１０ｍｌのグリセリン ；１５ｇのＢａｃｔｏ Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ Ｌｔｄ．社）を含有〕上で鮮や かな黄色の蛍光を示すグラム陰性桿菌である。脂肪酸分析 ：上記細菌の脂肪酸プロフィルを図１に示す。この分析は、マイクロ ビアル・アイデンティフィケーション、システム（Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｉｄｅ ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＩＤＩ Ｌｔｄ．社）、米国ニュー アーク）バージョン３．７を使用して実施した。この試験プログラムによれば、 ＭＡ３４２は、マッチングインデックス（ｍａｔｃｈｉｎｇ ｉｎｄｅｘ）が０ ．７０５でシュードモナス・クロロラフィスときわめて類似している。生化学的特性 ＡＰＩ２０ＮＥ^*迅速試験法で試験 ＭＡ３４２分離株の反応 した特性値 硝酸塩還元 − インドール産生 − グルコースの酸 − アルギニンジヒドロラーゼ ＋ ウレアーゼ − エスクリン加水分解 − ゼラチン加水分解 ＋ β−ガラクトシダーゼ − グルコース同化 ＋ アラビノース同化 − マンノース同化 −？ マンニトール同化 ＋ Ｎ−アセチル−グルコサミン同化 − マルトース同化 − グルコン酸同化 ＋ カプリン酸同化 − アジピン酸同化 − リンゴ酸同化 ＋ クエン酸同化 ＋ 酢酸フェニル同化 − シトクロムオキジダーゼ ＋^* ＡＰＩ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｔｄ．社、フランス 追加の試験で試験した特性値 レバン産生 − キシロース同化 −？ ソルビトール同化 ＋？ 菌株の好ましい増殖方法ならびに好ましい製剤方法と圃場もしくは温室での好ま しい施用方法 多量の上記菌株の活性菌株が、上記菌株の純培養物の試料を液体振とう培地中 にまたは適切な醗酵培地が入っている醗酵曹中に接種することからなる醗酵法に よって最高に得られる。上記菌株は無菌表面例えば寒天表面上でも増殖させるこ とができ、そしてその細胞は増殖したならば水または当該技術分野で公知の他の 液体培地中に懸濁させることができる。増殖培地は原則的に当該技術分野で公知 のいずれの細菌増殖培地でもよい。醗酵は、細胞の充分な濃度、例えば液体培養 物１ｍｌ当り約５〜１０⁸ｃｆｕ（コロニー形成単位）が得られるまで実施する 。このようにして得た醗酵ブロスまたは細菌懸濁液は同様に採用して植物保護に 使用することができるか、または使用する前に処理または製剤化することができ る。 処理の一例として、醗酵ブロス中の細菌細胞は、例えば加熱で殺しまたは遠心 分離し、そして得られたブロスまたは上澄み液（細菌の代謝産物を含有している ）は、予め精製および／または濃縮を行うかまたは行わずに植物の保護に用いる ことができる。当該技術分野で公知の化合物が、上記菌株またはその菌株の抗原 的に活性な代謝産物もしくはその誘導体と相溶性であれば、このような化合物の １種以上または群と、細菌の懸濁液および醗酵ブロスを均一に混合しても良い。 適切な化合物としては、粉末の添加剤または固体の担体、例えばタルク、カオリ ン、ベントナイトもしくはモンモリロナイトのような当該技術分野で公知の水和 剤；炭素源栄養素類（例えばグルコース、スクロースおよびフルクトース）もし くは複合細菌栄養素類（例えば酵母エキス、細菌学的ペプトンとトリプシン）； 金属塩類；脂肪酸類由来の塩類；脂肪酸エステル類；ノニオン界面活性剤類もし くはイオン界面活性剤類；植物栄養素類；植物成長調節剤類；殺真菌剤類；殺虫 剤類；殺菌剤類などがある。また細菌の懸濁液と醗酵ブロスは適切な化合物と混 合する前または後に乾燥または凍結乾燥を行い、得られた生成物を植物の保護に 使用してもよい。適切な乾燥法としては、例えば細菌醗酵ブロスを供給されたバ ーミキュライトを風乾する方法がある。 バクテリアと代謝産物の製剤は、種子類、栄養繁殖ユニット類および植物と土 壌を細菌菌株で処理する公知の方式で施用することができる。噴霧、微粒化、散 粉、ペレット成形、浸漬または注入（ｐｏｕｒｉｎｇ）を予定の目標と支配的な 環境にしたがって選択することができる。種子処理に用いる有利な施用量は通常 １０¹¹〜１０¹²ｃｆｕ／ｈａでありそして噴霧の場合は１０¹²〜１０¹⁴ｃｆｕ／ ｈａでありまたは対応する量の細菌代謝産物が施用される。 実施例１ 微生物ＭＡ３４２の分離 植物ガンコウラン（Ｅｍｐｅｔｒｕｍ ｎｉｇｒｕｍ）の掘出した根を無菌水 道水で洗浄して粘着している土壌を除いた。幼根から２〜３ｃｍ長の切片を切取 り無菌条件下で扱った。その切片は根端領域の上方の領域から採取した。その根 の切片に、火炎殺菌したメスで小さな切れ目を作った。次にその根の切片をＴＳ Ａ１０寒天の面にこすりつけた。細菌が増殖した後、ＭＡ３４２を採取しＴＳＡ １０上で純粋培養を行った。 実施例２ 微生物ＭＡ３４２の保存 上記純粋培養地を、小アンプル中−７０℃で急速冷凍した。凍結保護剤として 、オートクレーブ処理をした後ｐＨを７．１５に調節した１０％グリセリン含有 水道水を用いた。−７０℃で冷凍した後、これらのアンプルを−２０℃で貯蔵し た。 長期間保存する場合は、上記分離物を凍結乾燥した。ＴＳＡ１０寒天上で４８ 時間増殖させた後、生成した細菌叢を寒天の表面からかきとり、凍結乾燥保護剤 〔５０ｇのデキストランＴ７０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃ ａｌｓ Ｌｔｄ．社）；５０ｇのＬ−グルタミン酸ナトリウム（Ｋｅｂｏ ＡＢ 社）を含有する１０００ｍｌの蒸留水〕と混合し、小アンプル（２０ｍｌ）内に 注入し次いでＨｅｔｏｓｉｃｃ凍結乾燥機（Ｈｅｔｏ Ｌｔｄ．社、デンマーク ）に２４時間入れた。凍結乾燥を行った後、それらアンプルはゴム製の栓で気密 シールを行い４℃で貯蔵した。 実施例３ 一時温室スクリーニングにおけるミクロドキウム・ニヴァーレ（Ｍｉｃｒｏｄｏ ｃｈｉｕｍ ｎｉｖａｌｅ）に対するＭＡ３４２の効果 該細菌と以下のようにして小麦の種子に施用した。すなわちＴＳＡ１０上で１ ５℃にて２４時間培養した培養物を、９ｃｍペトリ皿の寒天表面からかきとり、 次いで４０ｍｌの栄養ブイヨン〔ＳＮＢ：１８ｇのスクロース；５ｇの細菌ペプ トン（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．社）；２ｇの酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．社 ）；０．５ｇのＫ₂ＨＯＰ₄および０．２５ｇのＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ含有の１００ ０ｍｌ蒸留水でｐＨを７．２〜７．４に調節〕および４０ｍｌのカルボキシメチ ルセルロース（ＣＭＣ）ナトリウムの２％（Ｗ／Ｖ）無菌蒸留水溶液と混合した 。その混合物を種子上に注ぎ入れた。２０分後に過剰の混合物を流し出して種子 を換気扇下で一夜乾燥した。 この温室スクリーニングでの各処理について、二個ずつの植木鉢に各植木鉢当 り５０粒ずつ種子をまいた。これらの植木鉢は直径が１８ｃｍで高さが４ｃｍで あり、砂を２０％（Ｖ／Ｖ）混合した非滅菌の市販ピート混合物（Ｅｎｈｅｔｓ ｊｏｙｄ Ｋ Ｎｏｒｍａｌ）で２／３を満たした。 冬小麦の種子（ｃｖ．“ｋｏｓａｃｋ”）に人工的にＭ．ニヴァーレを侵襲さ せてから細菌で処理した。上記病原体は、回転振とう培養機で室温にて、ジャガ イモデキストロースブロス〔２４ｇのＰｏｔａｔｏ Ｄｅｘｔｒｏｓｅ Ｂｒｏ ｔｈ（Ｄｉｆｃｏ Ｌｔｄ．社）／１０００ｍｌ蒸留水〕中で７日間培養した。 得られたスラリーとキッチンブレンダーでホモジナイズし次いで上記種子上に注 いだ。３０分後、液体を流出させ、次に種子を換気扇下で一夜乾燥させた。この ようにして病原体を侵襲させた種子を次いでＭＡ３４２で処理し、上記のように 植木鉢にまいた。 種子をまいた後、これらの植木鉢にガラス製のふたをかぶせ、６℃の暗所に置 いた。５日後にふたを外し、各植木鉢に水を１００ｍｌづつ与え次いで二つの木 製の棒で支持された５１のプラスチック製バッグの中に置いた。次にこれらの植 木鉢を１２〜１５℃の温室内に８日間入れた。 種子に下記の処理を行って試験した。 １．Ｍ．ニヴァーレを侵襲させた種子を、ＳＮＢ／ＣＭＣと混合したＰ．クロロ ラフィス菌株ＭＡ３４２で処理したもの ２．疾病の対照としてのＭ．ニヴァーレを侵襲させた種子 ３．健康な対照としての未処理の種子 病害防除効果は、まいた種子から出芽した健康な（すなわち菌糸体なしの）植 物の百分率として記録した。典型的なＭ．ニヴァーレ一次スクリーニングからの 試験結果を表１に示す。 実施例４ 二次温室スクリーニングにおけるドレクスレラ・テレス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｔｅｒｅｓ）に対するＭＡ３４２の効果 これらのスクリーニングを行うため、ＭＡ３４２の分離菌を、１８〜２０℃の 暗所にて回転振とう培養液で１／２の濃度（ｈａｌｆ ｓｔｒｅｎｇｔｈ）（１ ５ｇ／１）のトリプシンソイブロス（ｔｒｙｐｔｉｃ ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ）（ Ｄｉｆｃｏ Ｌｔｄ．）中４８時間培養した。Ｄ．テレスに自然に感染した大麦 の栽培品種“Ｇｏｌｆ”の種子を、プラスチックバッグ内で、この種子１ｋｇ当 り３００ｍｌの上記細菌懸濁液と混合し、混合後バッグを約４分間振とうした。 このように処理した種子を室温で１日間換気扇下で乾燥し、次いで実施例３に記 載したようにして植木鉢にまいた。 種子をまいた植木鉢を各処理毎に三つずつ、実施例３に記載したようにして、 まず６℃の暗所に７日間置き次いで約２０℃の温室内に置いた。処理の効果を読 取るため、発芽した植物の数と第一葉に一次侵襲がみられる植物の数を計数した 。上記細菌の効果を、未処理の対照、および殺真菌剤のＰａｎｏｃｔｉｎｅ Ｐ ｌｕｓ ４００〔グアザチン（ｇｕａｚａｔｉｎｅ）１５０ｇ／１＋イマザリル （ｉｍａｚａｌｉｌ）１０ｇ／１〕Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｌｔｄ．で処 理した種子（１ｋｇの種子当り４ｍｌの使用量）を関連させて示した。 実施例５ 圃場試験での植物病原体に対するＭＡ３４２の効果 圃場試験（繰り返し数３〜８の乱塊法）は、試験区の大きさが試験毎に０．１ ５ｍ²〔１回のＴ．カリエス（Ｔ．ｃａｒｉｅｓ）の試験〕から約１５ｍ²（大部 分の試験）まで変化した。これらの試験はスウェーデンの異なる地域にて、大部 分は約３％の含量の腐植物を含有するローム質土壌で行った。 細菌およびＰａｎｏｃｔｉｍｅ Ｐｌｕｓ ４００による種子の処理は上記実 施例４に記載したようにして実施した。処理した種子は換気扇下で乾燥した後、 圃場の試験区にまく前に、室温で、各種の期間貯蔵した。Ｔ．カリエスを侵襲さ せた種子を除くすべての種子は、試験を行った各種病害に自然に感染しもしくは 侵襲されたものである。冬小麦（ｃｖ．“ｋｏｓａｃｋ”）の種子に、２ｇのつ ぶしたＴ．カリエスの穂を１ｋｇの小麦種子と混合することによって、Ｔ．カリ エスの胞子を人工的に侵襲させた。ティレチア・カリエス（Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓ）に対するＭＡ３４２ の効果 上記の効果は、成熟の時点で感染していた穂の数として読みとった。１９９１ 年／１９９２年における２回の試験および１９９２年／１９９３年における２回 の試験の結果を表３に示す。細菌による処理と殺真菌剤による処理の間には１９ ９２年／１９９３年の試験で有意差がある。 ドレクスレラ・テレス（Ｄｒｅｃｈｓｌｅｒａ ｔｅｒｅｓ）、Ｄ．グラミネア （Ｄ．Ｇｒａｍｉｎｅａ）、Ｄ．アベネ（Ｄ．ａｖｅｎａｅ）およびウスチラゴ ・アベン（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ａｖｅｎａｅ）に対するＭＡ３４２の効果 これら病原体による圃場試験では、１ｍ²当りの発芽植物の本数と１ｍ²当りの 感染植物の本数を測定し、さらに大部分の試験で、ｉ）穀物収量ｉｉ）千粒重お よびｉｉｉ）１ヘクトリットル当りの重量も測定した。 ドレクスレラ・テレスに対する効果：１９９１年−１９９３年に圃場試験を行 い大麦のＤ．テレス感染に対する効果を試験した結果を表４，５および６に示す 。 ドレクスレラ・グラミネアに対する効果：１９９１〜１９９３年に実施したＤ． グラミネアに感染した種子についての試験から得た試験結果を表７，８および９ に示す。 ドレクスレラ・アベネに対する効果：１９９１〜１９９３年に行ったＤ．アペネ に感染したエンバク種子に関する試験の試験結果を表１０，１１および１２に示 す。 ウスチラゴ・アベネに対する効果：Ｕ．アベネに関する圃場試験で、１ｍ²当り の黒穂の数または黒穂の百分率を成熟の時点で読み取った。穀物収量は測定しな かった。１９９１年〜１９９３年に実施した三つの試験結果を表１３に示す。 実施例６ 種子および植物の他の部分に対するＭＡ３４２の施用ＭＡ３４２含有水性混合物の種子に対する施用 。上記実施例３または実施例４に 記載したようにして調製した細菌懸濁液を、下記の各物質または各化合物と混合 した。 タルク粉末（Ｋｅｂｏ Ｌａｂ ＡＢ社）、４８ｇ／１の細菌懸濁液。細菌学的 ペプトン（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．社）、５ｇ／１の細菌懸濁液。Ｔｗｅｅｎ２０ （Ｍｅｒｃｋ Ｌｔｄ．社）２０ｍｌ／１の細菌懸濁液。Ｍｅｔｏｃｅｌ（セル ロースエーテル、Ｓｖｅｄａ ｋｅｍｉ ＡＢ社）、１２ｇ／１の細菌懸濁液。 Ｌｉｓｓｐｏｌ（ＩＣＩ Ａｇｒｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｔｄ．社）、１ｇ／ ｌの細菌懸濁液。Ｂｏｎｄ（Ｎｅｗｍａｎ Ａｇｒｏｃｈｅ ｍｉｃａｌｓ Ｌ ｔｄ．社）、１ｇ／１の細菌懸濁液。 他の試験では、細菌懸濁液を１０，０００ｘｇで約１０分間遠心分離にかけ、 得られたペレットを、０．１Ｍ Ｍｇｓｏ₄中またはペプトン水〔１１の水道水 当り５ｇの細菌学的ペプトン（Ｏｘｏｉｄ Ｌｔｄ．社）含有〕中に再懸濁させ た。 充分に混合した後、得られた懸濁液を、他の物質を混合していない細菌懸濁液 について実施例４に記載したようにして種子に施用した。凍結乾燥細菌の植物種子に対する施用 。上記実施例４に記載したようにして振と う培養機で増殖させたＭＡ３４２細菌を遠心分離にかけ、得られたペレットを、 凍結乾燥保護剤としての脱脂乳溶液〔無菌蒸留水１１当り脱脂乳粉末２００ｇ（ Ｓｅｍｐｅｒ ＡＢ社、スウェーデン）含有〕中に再懸濁させた。得られた混合 物をガラス広口びん内でシェル冷凍（Ｓｈｅｌｌ Ｆｒｅｅ ｚｉｎｇ）を行い 次いでＨｅｔｏｓｉｃｃ凍結乾燥機（Ｈｅｔｏ Ｌｔｄ．社、デンマーク）で、 約４８時間、これら広口びん内にて凍結乾燥を行った。得られた粉末を、使用す るまで、プラスチック製バック内またはねじぶた付きプラスチックフラスコ内に ４℃で貯蔵した。種子に施用する場合は、該粉末を水中または他の水溶液中で混 合し次いで細菌懸濁液について実施例４に記載したようにして種子に施用するか 、または該粉末と種子（約１０ｇの粉末／ｋｇ種子）をプラスチック容器内で充 分 振とうすることによって、乾燥条件で該粉末と種子を混合した。ＭＡ３４２で処理した種子のペレット成形 上記実施例４に記載したようにして 振とう培養で増殖させたＭＡ３４２細菌を、１：１の容積比で接着剤（カルボキ シ−メチルセルロースナトリウムの２％ｗ／ｖ水溶液またはアラビアゴムの５０ ％ｗ／ｖ水溶液）と混合した。種子を上記実施例４のようにこの混合物で処理し た。次に過剰量のベントナイト（Ｄｒｅｓｓｅｒ Ｍｉｎｅｒａｌｓ Ｉｎｃ． 社）またはタルク粉末（ｋｅｂｏ Ｌａｂ ＡＢ）を該プラスチックバッグに加 え、そのバッグを膨らませ２，３分間激しく振とうさせた。その後、種子を換気 扇の下の大きなトレイに広げて室温で乾燥させた。植物の苗条に対する細菌懸濁液の噴霧 上記実施例４に記載したようにして振と う培養で増殖させたＭＡ３４２細菌を、プラスチック製人力噴霧機または動力噴 霧機に充填し植物の葉と茎に噴霧した。他の処理法では、まず細菌を約１０．０ ００ｘｇで１０分間遠心分離にかけ、得られたペレットを水道水に再懸濁し、得 られた細菌懸濁液を用いて植物の葉と茎に噴霧した。 実施例７ 温室内でドレクスレラ・テレスによって起こる病害に対する、ＭＡ３４２由来の 精製代謝産物の効果 ＭＡ３４２の分離株を、１８〜２０℃の暗所にて回転振とう培養機で１／２濃 度（１５ｇ／１）のＴｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ ｂｒｏｔｈ（Ｄｉｆｃｏ．Ｌｔｄ ．社）中４８時間増殖させた。得られた細菌懸濁液を４８．０００ｇで３０分間 遠心分離にかけ、次いで上澄み液中の代謝産物を、下記のようにしてＳｅｐ−ｐ ａｋ Ｃ１８カートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｓｓｏｃｉａ ｔｅｓ社）でさら に精製した。 １．８０ｍｌの上澄み液を、１０ｍｌのメタノールで活性化されたＳｅｐ−ｐａ ｋに加えた。 ２．そのＳｅｐ−ｐｓｃをまず５ｍｌの３３０％エタノールで次に４０％エタノ ールで洗浄した。 ３．代謝産物を５ｍｌの７０％エタノールで溶出した。 ４．得られた７０％エタノール溶出液を、約１．５ｍｌの水溶液が残るまでロー タリーエバポレーターで蒸発させた。のこった水溶液を水道水で６．５ｍｌの容 積まで稀釈した。 Ｄ．テレスに自然に感染した大麦栽培品種“Ｇｏｌｆ”の種子を、６．５ｍｌ の上記代謝産物水溶液中に３０分間浸漬し、次いで１植木鉢当り５０粒づつ上記 種子をまいた。これらの植木鉢にガラス製ふたをかぶせ６℃の暗所に置いた。９ 日後にふたを取り外し、次いで植木鉢を１５〜２２℃で約２週間温室内に置いた 。 発芽した植物と病害の侵襲を上記実施例４に記載したようにして読取った。対 照として、１）未処理の種子および２）Ｓｅｐ−ｐａｃで精製せずＭＡ３４２細 胞を含有している上澄み液で処理した種子を用いた。 実施例８ ＭＡ３４２分離株および異なる微生物株保存機関から受入れたシュードモナス・ クロロラフィスの１１種の他の分離株の比較試験の試験結果 表１に記載の名称を有するシュードモナス・クロロラフィスの１１種のスウェ ーデン以外の分離株をＭＡ３４２分離株とともに、大麦の斑点病に対する効果お よび試験系ＡＰＩ２０ＮＥによる生化学試験での反応の誘発について試験した。 さらに、これらの分離株は寒天平板上のコロニーの外観と結晶生成について比較 した。上記のスウェーデン以外の１１種の分離株は、異なる国由来の分離株であ り、４ケ所の異なる著名な微生物株保存機関に寄託されている（表１）。 温室試験における疾病阻害性能の試験結果。 これらの試験は実施例４に記載したようにして、ドレクスレラ・テレスに感染 した大麦で実施し、そして適切な比較を行うためにすべての分離株を同時に試験 した。表１から明らかなように、試験結果は、ここで試験した他の分離株は、こ の種の試験におけるＭＡ３４２のような特性すなわちドレクスレラ・テレスによ る感染を阻害する性能を全くもっていないという意味でＭＡ３４２は明らかに独 特な菌株であることを示している。 試験系ＡＰＩ２０ＮＥによる生化学的試験における反応の誘発 これらの試験を上記のようにして実施した。試験結果を表２に示す。試験結果 は、ＭＡ３４２はこの点についても独特であり、試験した他の１１種の分離株と 異なっていることを示している。試験された分離株のいくつかは、この試験によ って、シュードモナス・クロロラフィスの種の中の中心的なものではないと考え られる。 寒天平板上のコロニーの外観と結晶形成の比較 これらの分離菌株を上記のようにしてペトリ皿内のＴＳＡ１０上で培養した。 本発明の発明者らはすべての異なる分離菌株のコロニーの外観に小さな差がある ことを観察したが、外観によってすべての分離菌株を識別することはできなかっ た。しかしＭＡ３４２分離株は、寒天中に典型的な無色透明の結晶を生成する唯 一の分離菌株であったので、この特性によって他のすべての分離菌株から識別す ることができた。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９５年９月４日 【補正内容】 請求の範囲 １．スコットランドのアバディーン所在のザ・ナショナル・コレクションズ・ オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッドにＮＣＩＭ Ｂ受託番号４０６１６で寄託されているシュードモナス・クロロラフィス菌株も しくは抗病原的に活性な代謝産物を産生する性能を有する該菌株の生物学的に純 粋な培養物、または親菌株とほとんど同じ特性を有する該菌株の突然変異株。 ２．有効成分として、請求の範囲１記載の微生物かまたはその微生物の抗病原 的に活性な代謝産物を含有する該微生物の培養グロスを含有していることを特徴 とする、病原真菌によって起こる植物の病害を防除するのに用いる組成物。 ３．病原体が真菌のドレクスレラ・テレスであることを特徴とする請求の範囲 ２記載の組成物。 ４．病原体が真菌のドレクスレラ・グラミネアであることを特徴とする請求の 範囲２記載の組成物。 ５．病原体が真菌のドレクスレラ・アベネであることを特徴とする請求の範囲 ２記載の組成物。 ６．病原体が真菌のミクロドキウム・ニヴァーレであることを特徴とする請求 の範囲２記載の組成物。 ７．病原体が真菌のティレチア・カリエスであることを特徴とする請求の範囲 ２記載の組成物。 ８．病原体が真菌のウスチラゴ・アベネであることを特徴とする請求の範囲２ 記載の組成物。 ９．有効成分が、農業を実施する場合に許容される担体組成物と混合されてい ることを特徴とする請求の範囲２〜８記載の組成物。 １０．有効成分が液状の担体と混合されていることを特徴とする請求の範囲９ 記載の組成物。 １１．有効成分が固体の多孔質材料に含浸されていることを特徴とする請求の 範囲９記載の組成物。 １２．接着剤として役立つ添加剤をさらに含有していること特徴とする請求の 範囲９記載の組成物。 １３．栄養素源をさらに含有していることを特徴とする請求の範囲９記載の組 成物。 １４．病原真菌によって起こる植物の病害を防除しかつ植物病害誘発病原体を 阻害しなければならない環境中に有効投与量の有効成分を導入することを含んで なる方法であって；有効成分が、請求の範囲１記載の微生物かまたはその微生物 の抗病原的に活性な代謝産物を含有する該微生物の培養ブロスであることを特徴 とする方法。 １５．有効成分を種子に施用することを特徴とする請求の範囲１４記載の方法 。 １６．有効成分を植物の栄養繁殖ユニットに施用することを特徴とする請求の 範囲１４記載の方法。 １７．有効成分を植物に施用することを特徴とする請求の範囲１４記載の方法 。 １８．有効成分を、植物が成長しているかまたは植物を成長させるべき成長媒 体に施用することを特徴とする請求の範囲１４記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:38） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，Ｍ Ｗ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ (72)発明者 イエルケマン、チイーユ スウェーデン国、メルスタ エス−195 33、ファーサンヴェーゲン 45 (72)発明者 ジングストローム、ブリット−マリー スウェーデン国、ブジョークリンゲ エス −740 30、ヘジェビイー （番地なし) (72)発明者 ジョンソン、レナート スウェーデン国、ウプサラ エス−757 57、ハンダルベッツヴェーゲン ４ (72)発明者 ヘーケバーグ、マルガレータ スウェーデン国、ウプサラ エス−757 55、ダラレーサン 28

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．スコットランドのアバディーン所在のザ・ナショナル・コレクションズ・ オブ・インダストリアル・アンド・マリン・バクテリア・リミテッドにＮＣＩＭ Ｂ受託番号４０６１６で寄託されているシュードモナス・クロロラフィス菌株ま たはその生物学的に純粋な培養物。 ２．請求の範囲１記載の菌株から誘導されかつ親菌株とほとんど同じ特性を有 する突然変異株。 ３．有効成分として、請求項の範囲１または２に記載の微生物かまたはその微 生物の抗病原的に活性な代謝産物もしくはその誘導体を含有していることを特徴 とする、病原真菌によって起こる植物の病害を防除するのに用いる組成物。 ４．病原体が真菌のドレクスレラ・テレスであることを特徴とする請求の範囲 ３記載の組成物。 ５．病原体が真菌のドレクスレラ・グラミネアであることを特徴とする請求の 範囲３記載の組成物。 ６．病原体が真菌のドレクスレラ・アベネであることを特徴とする請求の範囲 ３記載の組成物。 ７．病原体が真菌のミクロドキウム・ニヴァーレであることを特徴とする請求 項の範囲３記載の組成物。 ８．病原体が真菌のティレチア・カリエスであることを特徴とする請求の範囲 ３記載の組成物。 ９．病原体が真菌のウスチラゴ・アベネであることを特徴とする請求の範囲３ 記載の組成物。 １０．有効成分が、農業を実施する場合に許容される担体組成物と混合されて いることを特徴とする請求の範囲３ないし９に記載の組成物。 １１．有効成分が液状の担体と混合されていることを特徴とする請求の範囲１ ０記載の組成物。 １２．有効成分が固体の多孔質材料に含浸されていることを特徴とする請求の 範囲１０記載の組成物。 １３．さらに、接着剤として役立つ添加剤を含有していることを特徴とする請 求の範囲１０記載の組成物。 １４．さらに、栄養素源を含有していることを特徴とする請求の範囲１０記載 の組成物。 １５．病原真菌によって起こる植物の病害を防除しかつ植物病害誘発病原体を 阻害しなければならない環境中に有効投与量の有効成分を導入することを含んで なる穂法であって； 有効成分が、請求の範囲１または２に記載の微生物がまたはその微生物の抗病 原的に活性な代謝産物もしくはその誘導体であることを特徴とする穂法。 １６．有効成分を種子に施用することを特徴とする請求の範囲１５記載の方法 。 １７．有効成分を植物の栄養繁殖ユニットに施用することを特徴とする請求の 範囲１５記載の方法。 １８．有効成分を植物に施用することを特徴とする請求の範囲１５記載の方法 。 １９．有効成分を、植物が成長しているかまたは植物を成長させるべき成長媒 体に施用することを特徴とする請求の範囲１５記載の方法。