CN102399717A - 一株抗病毒放线菌ha10206及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株产生抗病毒活性物质的放线菌HA10206，保藏号为CGMCC No.4861，属于微生物技术领域。本发明的优点是：所述的放线菌HA10206为一株链霉菌属新种，其发酵液对H1N1及其同一系列的H2N2、H3N2、H5N1病毒具有明显抑制作用，对HIV、HBV也存在一定抑制，具有良好的药物开发前景。

Description

一株抗病毒放线菌HA10206及其应用

技术领域

本发明涉及一株抗病毒的链霉菌属(Streptomyces)放线菌HA10206，属于微生物技术领域。

背景技术

病毒性疾病严重威胁着人类健康，而目前对病毒感染缺乏特异、有效的预防和治疗手段，因此，研究特异性抗病毒药物具有十分重要的现实意义。流感病毒引起的流行性感冒是一种急性病毒性呼吸道传染病，传染速度快，是导致人类死亡的主要原因之一，尤其是H1N1流感病毒在全世界范围内未得到有效控制，严重威胁人类的生命安全。寻找新的有效的抗病毒药，特别是对病毒具有高度选择性、而对宿主细胞无毒副作用的药物仍是当前迫切而重要的任务。

近年来微生物药物的发展受到世界各国的关注，目前的微生物药物主要是由放线菌产生的，利巴韦林是由略黄拟诺卡氏菌(Nocardiopsis flavidus)产生的间型霉素(formycin)改造的衍生物，抗疱疹病毒及乙肝病毒的阿糖腺苷也可由放线菌产生。目前对抗病毒放线菌的研究报道相对较少，从放线菌中筛选抗病毒抗生素仍是当前研究的热点之一。

海洋里生存繁衍着数量巨大的微生物，为了适应海洋这种特殊的生态环境，海洋微生物形成了独特的生理特性和代谢特性，进而产生了多种多样的次生代谢产物，成为人类寻找和开发具有药用或其他用途天然产物的重要源泉。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一株能够产生抗病毒活性物质的链霉菌。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株能抗病毒的链霉菌属(Streptomyces)放线菌HA10206，保藏号为CGMCC No.4861。

放线菌HA10206是由东寨港红树林淤泥中分离得到。

放线菌HA10206具有以下微生物特性：

(1)形态与培养特性

菌株HA10206在燕麦汁培养基、酵母粉-淀粉培养基、土豆汁培养基3种培养基中生长好，在无机盐-淀粉培养基、高氏一号合成培养基上较好，均形成丰富的气生菌丝和基内菌丝，气生菌丝红黄色至灰色，基内菌丝白色至暗黄色。在甘油天门冬素培养基中生长较差。在6种培养基上均无可溶性色素生成，具体特征见表1。在高氏一号培养基上培养10d时，显微镜下可看出菌株HA10206基内菌丝无横隔，不断裂；孢子丝螺旋形(图1)。

表1菌株HA10206的培养特征

(2)生理生化特征

常用的9种碳源中，利用D-葡萄糖、L-鼠李糖、D-甘露醇、L-肌醇的能力较强，利用蔗糖、棉子糖能力较弱，不利用D-果糖、D-木糖、L-阿拉伯糖。纤维素上生长良好，不产生H2S，淀粉水解能力较强，产生类黑色素，硝酸盐还原，牛奶不凝固不胨化，不能使明胶液化。

(3)本发明所述的菌株HA10206，其16S rDNA序列如下：

TCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACCACTGAGGGCATCCTCGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCGGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTGTGTTGCCAGCGGGTCATGCCGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCTGCGT。

本发明涉及的菌株HA10206 CGMCC No.4861，经多项分类鉴定，确定为链霉菌属的一个新种，暂命名为Streptomyces sp.HA10206，已于2011年5月16日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了菌种保藏，并证明存活，其保藏登记号为CGMCCNo.4861。保存地址为北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所。

本发明的优点是：该菌产生的次生代谢产物对多种病毒有较强的抑制作用，尤其对H1N1流感病毒有明显抑制作用。

下面结合说明书附图和具体实施方式对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为本发明所述菌株在高氏一号培养基中的培养形态(培养10天)。

图2为本发明所述菌株的菌丝及孢子丝形态，400×。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明：

实施例1：菌株HA10206 CGMCC No.4861的分离

将采集的海绵样品用无菌海水洗涤3-5次后，用无菌手术刀将样品切成小块，于无菌研钵中研磨5-10min，使成为均匀浆状。对样品做10倍系列梯度稀释，各取100μL 10^-1、10^-2、10^-3、10^-4稀释度的菌液涂布于高氏一号培养基上，28℃倒置培养。适时挑取形态、颜色不同的菌落进行划线纯化。对于已纯化的放线菌，根据菌落形态学特征，排除相同菌株，转入斜面4℃保存，编号，留作菌株筛选用。

实施例2：菌株HA10206 CGMCC No.4861的培养

(1)斜面培养：培养6天。培养基：可溶性淀粉10g，硝酸钾1g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，硫酸亚铁0.01g，陈海水配制，pH7.2。

(2)种子培养：从斜面挑取经活化的单菌落接入种子培养基，28℃、180r/min培养48小时。培养基：葡萄糖1％，大豆粉1％，酵母膏1％，可溶性淀粉0.5％，磷酸氢二钾0.025％，

天然陈海水(新鲜海水静置一周后)配制，pH7.2。

(3)发酵培养：按10％的接种量接入种子培养液，28℃、180r/min摇瓶培养6天。培养基：葡萄糖0.5％，可溶性淀粉1.5％，大豆粉1％，酵母膏0.5％，磷酸氢二钾0.025％，用75％天然陈海水与25％蒸馏水配制，初始pH值7.2。

实施例3：菌株HA10206 CGMCC No.4861抗H1N1病毒活性检测

按实施例2的方法进行发酵培养，收集发酵6天的发酵产物，10000r/min离心10min，取上清液再用0.22μm无菌滤膜过滤备用。

发酵液按下列CPE+MTT结合法进行抗H1N1病毒活性检测：

CPE+MTT结合法：培养MDCK犬肾细胞，待细胞长成单层后，接种H1N1病毒液50μL，37℃，5％CO₂孵育2h，弃去上清，加入稀释20倍的发酵液50μL，37℃、5％CO2孵育，于倒置显微镜下观察试验细胞病变(cytopathic effect；CPE)情况。CPE的记录方法为：无CPE为“-”；25％细胞出现病变为“+”；25％～50％细胞病变为“++”；50％～75％细胞病变为“+++”；75％～100％的细胞病变为“++++”。待病毒对照出现“+++～++++”时，将待检的细胞孔弃上清，每孔加入5mg/mL的MTT溶液50μL，置37℃孵育2h，弃上清，加入DMSO 50μL，室温放置10min后，震荡混匀，用酶标仪于570nm波长下测定吸光度(A)值。50μg/mL的利巴韦林作为阳性对照，实验设置病毒对照和细胞对照，每一发酵液均做3个重复。根据以下公式计算病毒抑制率：

病毒抑制率％＝(试验组平均A值-病毒对照组平均A值)/(细胞对照组平均A值-病毒对照组平均A值)×100％

结果表明，菌株HA10206发酵液稀释20倍时对H1N1抑制率为58.3％。

实施例4.菌株HA10206 CGMCC No.4861抗其他病毒活性检测

按实施例2的方法进行发酵培养，检测方法参照实施例3。菌株HA10206发酵液对H1N1同一系列其他病毒有较强的抑制作用，对HIV和HBV也存在一定的抑制，结果如表2。

表2菌株HA10206发酵液稀释20倍时抗病毒活性测定

Claims (3)

1.一株产生抗病毒活性物质的链霉菌属(Streptomyces)放线菌，保藏号为CGMCC No.4861。

2.权利要求1所述放线菌的特征在于，其16S rDNA的序列为：

TCGGGAGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACCACTGAGGGCATCCTCGGTGGTGGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTGATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCGGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAGCATCAGAGATGGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTGTGTTGCCAGCGGGTCATGCCGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCTGCGT。

3.权利要求1所述放线菌的应用，其特征在于该菌发酵产物在制备抑制H1N1、H2N2、H3N2、H5N1、HIV、HBV病毒药物中的用途。

Images