CN109777755A - 一株暹罗芽孢杆菌dh35及其发酵上清液的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)DH35及其发酵上清液，该菌于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16866；及该菌株及其发酵上清液在防治水产病原细菌的应用，本发明暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)DH35及其发酵上清液对迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)都有较好的抑菌效果。

Description

一株暹罗芽孢杆菌DH35及其发酵上清液的应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株及其应用，尤其涉及一株暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)DH35及其发酵上清液的应用。

背景技术

水产病原细菌引起水产病害是水产3类病原菌(细菌致病菌、真菌致病菌和病毒致病菌)引起之首，其频繁发生成灾，造成海洋渔业和水产养殖业经济损失惨重，是阻碍中国水产经济发展的主要问题之一。因此，寻求安全、高效、生态的防治方法迫在眉睫。

深海是指水深大于1000米的海洋，广泛分布着海山、海盆和海沟等，有着热液口、冷泉、高压、高温、高污染等多种复杂独特生境。深海微生物在这极端生境中，往往能够产生结构和功能独特的生物活性物质，并与陆源活性物质结构和功能不同。其中，芽孢杆菌以其抗逆性强、稳定性好及能产生多种功能特异的活性物质而成为海洋极端生境微生物开发的重点，益生和抗菌功能是当前相关研究的热点。

芽孢杆菌是广泛存在于自然界之中的非致病性细菌，繁殖能力和环境耐受性强，能产生多种抑菌物质，具有巨大的开发利用价值。相对于陆地芽孢杆菌，深海芽孢杆菌生活在非常特殊的高温、高压、高污染环境里，决定了其次级代谢产物更丰富、结构新颖和具有特异的生物活性，如具有新型抑菌活性物质的能力。因此，深海芽孢杆菌资源具有防控水产病原细菌潜力。

发明内容

本发明的目的在于提供一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis) DH35，该菌株已于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16866。

本发明暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)DH35是从蛟龙号第 150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深的海水样品中分离并筛选得到的菌株，根据菌株形态学和生理生化特性，并采用16S rDNA法对该菌株进行测序分析，最终鉴定其为暹罗芽孢杆菌Bacillussiamensis。

本发明的另一目的是提供暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液，该发酵上清液由以下步骤制得：

首先，将暹罗芽孢杆菌DH35在含活化培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到发酵培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到发酵上清液；

所述的活化培养为将暹罗芽孢杆菌DH35接种到活化培养基中， 28～40℃，150～220rpm，6～14h，得种子液；

将所述种子液按发酵培养基1～10％(体积)接种量接种至发酵培养基中，在28～40℃，150～220rpm，培养10～38h，得到暹罗芽孢杆菌DH35发酵液；

发酵结束后5000～10000rpm，离心10～30min，取上清液经0.22 μm微孔滤膜过滤，除去菌体得到发酵上清液；

所述活化培养基pH为6.0～8.0，包括以下按质量份计各组分：蛋白胨9～11份，酵母粉2～6份，氯化钠0～15份，0.1MPa灭菌30min；

所述发酵培养基pH为6.0～8.0，包括以下按质量份计各组分：蛋白胨5～12份，酵母粉2～8份，氯化钠0～15份，0.1MPa灭菌30min。

本发明的又一目的在于暹罗芽孢杆菌DH35及其发酵上清液在防治水产病原细菌中的应用。

所述水产病原细菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、坎氏弧菌(Vibrio campbellii)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。

本发明的有益效果：

本发明提供的暹罗芽孢杆菌DH35及其发酵上清液能够有效防控水产病原细菌，如迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌，对水产病原细菌有良好的抵制作用，制备工艺简单，且抑菌谱广，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为菌株DH35的16S rDNA序列系统进化树。

具体实施方式

本发明中所述的暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)DH35于2018 年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.16866。

一、暹罗芽孢杆菌DH35分离与鉴定

本发明暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)DH35是从蛟龙号第 150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深的海水样品中分离并筛选得到的菌株，根据菌株形态学和生理生化特性，并采用16S rDNA法对该菌株进行测序分析，最终鉴定其为暹罗芽孢杆菌Bacillussiamensis。

1、菌株的分离

(1)初筛：取5～10mL蛟龙号第150潜次中西太平洋雅浦海沟6000米深海水样品，70～80℃恒温水浴20～30min，用无菌海水采用十倍稀释法进行梯度稀释，每个浓度各取100μL液体分别涂布在细菌分离培养基，28～37℃倒置培养24～48h。根据菌落大小、颜色、边缘光滑程度等对细菌进行分离、纯化。

上述细菌分离培养基为：NB(Nutrient Broth)固体培养基(0.5％蛋白胨，3％牛肉膏，0.5％氯化钠，1.5％琼脂，pH7.3)、M1固体培养基(1％淀粉，0.4％酵母粉，0.2％蛋白胨，1.5％琼脂，pH7.3)和 Zobell 2216E固体培养基(0.5％蛋白胨，0.1％酵母提取物，天然过滤海水：纯水＝2:1(V/V)，1.5％琼脂，pH7.6)；

天然过滤海水为把从不被陆上污物污染的或很少混有淡水的地方取来的海水装入玻璃瓶储放在暗处数星期后形成的海水。

(2)复筛：挑选步骤(1)中的细菌进行抑菌活性筛选，将细菌接种于8mL活化培养基，37℃，180rpm，18h，发酵液在10000rpm， 4℃，离心30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，得发酵上清液。

改良琼脂扩散法：取1.5mL新鲜的指示细菌液(迟缓爱德华氏菌、嗜水气单胞菌、坎氏弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌和无乳链球菌)在18mm×180mm试管培养37℃，180rpm， 12h，于150mL的LB固体培养基46℃中，迅速摇匀倒入9cm规格的培养皿中，凝固后用直径为8.58mm无菌打孔器在抑菌板上打孔，并用灭过菌的牙签挑出培养基块。每孔加入50μL发酵上清液，在超净台中吹干后置于37℃，培养12h后观察是否有抑菌圈，测量抑菌圈的直径。挑选抑菌活性强、抑菌谱广菌株，并将该菌株标记为DH35 菌株。

2、菌株鉴定

将筛选所得DH35菌株接种至LB固体培养基，于37℃下培养，观察菌落形态，并做部分生理生化特性的测定，结果如下：DH35菌株微泛黄大菌落，表面褶皱，边缘不规则，革兰氏阳性，DH35菌株能分解D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、D-甘露糖和七叶苷，能水解明胶、淀粉和酪蛋白，硝酸盐还原反应、V-P反应和吲哚试验均呈阳性，氧化酶实验呈阴性。

利用OMEGA的细菌DNA试剂盒提取菌株基因组DNA，采用细菌通用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’ -GGTTACCTTGTTAGGACTT-3'进行16S rDNA的PCR扩增，所得P CR产物经生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

16S rDNA的测序序列在GenBank进行BLAST分析，并采用 MEGA7.0软件进行序列比对和聚类分析，Neighbour-joining (Maximum Composite Likelihood模型，bootstrap1000)法构建系统发育树。

对DH35菌株16S rDNA序列PCR扩增，得到的基因序列片段长度为1398bp，基因序列如SEQ ID NO：1所示。将该基因序列进行 BLAST分析，构建系统进化树，从图1中可以看出，DH35菌株序列与Bacillus siamensis亲缘关系最近。

基于以上分子生物学鉴定结果，结合形态学和生理生化特性，鉴定该菌株为暹罗芽孢杆菌Bacillus siamensis，命名为暹罗芽孢杆菌 Bacillus siamensis DH35。

3、暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液的制备，其具体步骤如下：

暹罗芽孢杆菌DH35在含有8mL活化培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到500mL发酵培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到防治水产病原细菌发酵上清液，该发酵上清液可直接应用水产病原细菌防治。

(1)暹罗芽孢杆菌DH35活化：取暹罗芽孢杆菌DH35在含有活化培养基的试管中进行活化培养，28～40℃，150～220rpm，6～ 14h，得种子液；

(2)发酵液的制备：将上述种子液按发酵培养基1～10％(V/V) 接种量接种到发酵培养基中，在28～40℃，150～220rpm，培养10～ 38h，得到暹罗芽孢杆菌DH35发酵液；

(3)发酵上清液：暹罗芽孢杆菌DH35发酵液5000～10000rpm， 10～30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，除去菌体。

本发明实施例使用的活化培养基pH为6.0～8.0，包括以下按质量份计各组分：蛋白胨9～11份，酵母粉2～6份，氯化钠0～15份， 0.1MPa灭菌30min；发酵培养基pH为6.0～8.0，包括以下按质量份计各组分：蛋白胨5～12份，酵母粉2～8份，氯化钠0～15份， 0.1MPa灭菌30min；LB固体培养基组分为：1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％氯化钠，1.5％琼脂，pH7.3。

为了更好对本发明中暹罗芽孢杆菌DH35及其发酵上清液进行进一步阐述说明，申请人例举了如下实施例：

实施例1：暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液制备

暹罗芽孢杆菌DH35接种于活化培养基，28℃，150rpm，14h，按5％(体积)接种量接种到发酵培养基，28℃，220rpm，38h后，所有发酵液在5000rpm，4℃，离心30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，即得。

实施例2：暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液制备

暹罗芽孢杆菌DH35接种于活化培养基，37℃，180rpm，8h，按2.5％(体积)接种量接种到发酵培养基，37℃，150rpm，24h 后，所有发酵液在8000rpm，4℃，离心15min，取上清液经0.22μm 微孔滤膜过滤，即得。

实施例3：暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液制备

暹罗芽孢杆菌DH35接种于活化培养基，40℃，220rpm，6h，按5％(体积)接种量接种到发酵培养基，40℃，180rpm，10h后，所有发酵液在10000rpm，4℃，离心10min，取上清液经0.22μm 微孔滤膜过滤，即得。

实施例4：对水产病原细菌抑菌谱的测定

采用改良琼脂扩散法，检测暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液对水产病原细菌的抑菌活性。制作抑菌板：46℃熔融LB固体培养基添加 1％(体积)活化的水产病原细菌，冷却凝固后，打孔，孔内添加50μL 实施例2中发酵上清液，置于37℃培养过夜，观察记录抑菌板上抑菌圈直径，结果见表1。

表1 暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液对不同水产病原细菌抑菌活性

ND：未检出

实施例5：对养殖水体中南美白对虾苗成活率的影响

在1立方米养殖水池里，放入南美白对虾苗100尾，设对照组和实验组，对照组为不做任何处理，实验组用实施例1至3制备的发酵上清液，实验开始时使用1次，以后每间隔3天施用一次，于10天、 15天、20天检测虾苗成活率，结果见表2。

表2 虾苗成活率检测结果

从表2的实验数据可知，空白对照组由于未施用发酵上清液，虾苗成活率较低；而实验组施用发酵上清液后，虾苗成活率明显提高。结果表明，本发明提供的暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液可提高南美白对虾苗的成活率。

实施例6：对养殖水体中草鱼苗成活率的影响

在1立方米养殖水池里，放入草鱼苗50尾，设对照组和实验组，对照组为不做任何处理，实验组用实施例1至3制备的发酵上清液，实验开始时使用1次，以后每间隔3天施用一次，于10天、15天、 20天检测草鱼苗成活率，结果见表3。

表3 草鱼苗成活率检测结果

从表3的实验数据可知，空白对照组由于未施用发酵上清液，草鱼苗成活率较低；而实验组施用发酵上清液后，草鱼苗成活率明显提高。结果表明，本发明提供的暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液可提高草鱼苗的成活率。

序列表

<110> 自然资源部第三海洋研究所

<120> 一株暹罗芽孢杆菌DH35及其发酵上清液的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1398

<212> DNA

<213> Bacillus siamensis

<400> 1

gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg gcggacgggt gagtaacacg 60

tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac cggggctaat accggatggt 120

tgtctgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg ctaccactta cagatggacc 180

cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa ggcgacgatg cgtagccgac 240

ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc cagactccta cgggaggcag 300

cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag caacgccgcg tgagtgatga 360

aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca agtgccgttc aaatagggcg 420

gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa 480

tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa agggctcgca ggcggtttct 540

taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt cattggaaac tggggaactt 600

gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag agatgtggag 660

gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag cgaaagcgtg 720

gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag tgctaagtgt 780

tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc ctggggagta 840

cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt 900

ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct gacaatccta 960

gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg 1020

tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt agttgccagc 1080

attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg 1140

tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga cagaacaaag 1200

ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc ggatcgcagt 1260

ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tgccgcggtg 1320

aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg taacacccga 1380

agtcggtgag gtaacctt 1398

Claims (5)

1.一株暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)DH35，已于2018年12月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.16866。

2.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌DH35在防治水产病原细菌中的应用。

3.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液，其特征在于，所述发酵上清液由以下步骤制得：

首先，将暹罗芽孢杆菌DH35在含活化培养基的试管中进行活化培养，然后将活化的菌株接种到发酵培养基中进行培养，发酵结束后离心除去菌体，得到发酵上清液；

所述的活化培养为将暹罗芽孢杆菌DH35接种到活化培养基中，28～40℃，150～220rpm，6～14h，得种子液；

将所述种子液按发酵培养基1～10％(体积)接种量接种至发酵培养基中，在28～40℃，150～220rpm，培养10～38h，得到暹罗芽孢杆菌DH35发酵液；

发酵结束后5000～10000rpm，离心10～30min，取上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，除去菌体得到发酵上清液；

所述活化培养基pH为6.0～8.0，包括以下按质量份计各组分：蛋白胨9～11份，酵母粉2～6份，氯化钠0～15份，0.1MPa灭菌30min；

所述发酵培养基pH为6.0～8.0，包括以下按质量份计各组分：蛋白胨5～12份，酵母粉2～8份，氯化钠0～15份，0.1MPa灭菌30min。

4.如权利要求3所述的暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液在防治水产病原细菌中的应用。

5.如权利要求2所述的暹罗芽孢杆菌DH35或权利要求4所述的暹罗芽孢杆菌DH35发酵上清液在防治水产病原细菌中的应用，其特征在于，所述水产病原细菌为迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、坎氏弧菌(Vibriocampbellii)、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)。