CN113667624A - 一株暹罗芽孢杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株暹罗芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。所述菌株为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS‑M04，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20901。该菌株可有效降解聚乙烯塑料，为环境中聚乙烯废弃物的生物降解提供了新资源和解决方案。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，涉及一株暹罗芽孢杆菌及其应用。
背景技术
塑料是重要的有机合成高分子材料，应用非常广泛。但塑料在环境中难以自然降解，废弃塑料带来的“白色污染”也越来越严重。聚乙烯（Polyethene，简称PE）是乙烯经聚合制得的一种热塑性树脂。聚乙烯无臭，无毒，手感似蜡，具有优良的耐低温性能，化学稳定性好，能耐大多数酸碱的侵蚀，其常温下不溶于一般溶剂，吸水性小，电绝缘性优良，极易在自然环境中积累，造成二次污染。因此，寻找一种对废弃聚乙烯等塑料的安全处置技术迫在眉睫。然而，当前针对聚乙烯等塑料废弃物生物降解的研究较少，有效微生物资源不多，且治理效率低。
红树林生长在热带、亚热带近海海岸潮间带，长期受周期性海水浸淹。具有防汛、防浪、防风暴、护堤的功能，在维护大气碳氧平衡、净化大气和水体环境等方面具有其独特的社会和经济价值。红树林特殊的生境决定了其丰富的微生物资源，蕴藏着不同于其他环境微生物来源的遗传资源。
发明内容
本发明的目的在于提供一株暹罗芽孢杆菌及其应用。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一株暹罗芽孢杆菌，所述菌株为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20901，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述暹罗芽孢杆菌的菌落特征及菌体形态为：
将YZS-M04在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为浅黄色，无光泽，呈圆形、无流动性，革兰氏染色阳性，有芽孢，无荚膜；菌落直径4-5mm。
所述暹罗芽孢杆菌的生理生化特征：
YZS-M04接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阴性，MR测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阳性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阴性，产H2S试验试验阳性。
将所述暹罗芽孢杆菌的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明:YZS-M04与Bacillus siamensis同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Bacillus siamensis（KY962351.1）的相似度达100%。结合菌落形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析，初步鉴定为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。
本发明的优点在于：
本发明所提供的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04对于聚乙烯塑料生物降解方面具有很好的效果，为环境中聚乙烯废弃物的生物降解提供了新资源和解决方案，具有极大的应用前景。
附图说明
图1为本发明提供的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04降解30天后PE薄膜在光学显微镜下的形貌特征图。a：对照；b：接菌YZS-M04。
图2为本发明提供的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04降解30天后PE薄膜在扫描电子显微镜下的形貌特征图。a：对照；b：接菌YZS-M04。
图3为本发明提供的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04降解前后PE薄膜的水接触角变化图。a：对照；b：接菌YZS-M04。
图4为本发明提供的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04降解前后PE薄膜表面官能团变化图。a：对照；b：接菌YZS-M04。
具体实施方式
下面结合实例对本发明进一步说明。
一株暹罗芽孢杆菌，其分类命名为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20901，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
实施例1 暹罗芽孢杆菌的分离筛选与鉴定
（1）分离、筛选过程：
通过梯度稀释法，从福建红树植物中分离出319株分离物。通过三区划线法对分离到的内生细菌进行纯化，并通过镜检判断菌株是否纯化，对纯化后的细菌进行编号，挑取单菌落，转移到NA斜面上保存备用。在无碳源矿物盐固体培养基平板表面涂布0.02g/平板/（平板直径9 cm)已灭菌的聚乙烯粉末，将以上获得的菌株在表面划线培养，挑选生长迅速的单菌落于NA平板上培养保存。通过聚乙烯为唯一碳源的无碳源矿物盐培养基生长测定，初步筛选出7株具有较好聚乙烯降解效果的菌株，并最终筛选出一株生长迅速、且可高效降解聚乙烯塑料的内生细菌，标记为YZS-M04。
其中，无碳源矿物盐培养基：K2HPO4·3H2O 0.7 g，KH2PO4 0.7 g，NH4NO3 1.0 g，NaCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeSO4·7H2O 0.002 g，ZnSO4·7H2O 0.002 g，MnSO4·H2O0.001 g；将上述试剂溶解于1 L去离子水中，用1 mol/L NaOH调节pH至7.0。
无碳源矿物盐固体培养基在无碳源矿物盐培养基的基础上加1.5wt%的琼脂。
筛选培养基在无碳源矿物盐固体培养基平板表面涂布0.02g/平板/（平板直径9cm)已灭菌的聚乙烯粉末作为唯一碳源。
（2）菌落特征及菌落形态：
将YZS-M04在NA平板上培养24h后形成菌落颜色为浅黄色，无光泽，呈圆形、无流动性，革兰氏阳性，有芽孢，无荚膜；菌落直径4-5mm。
（3）生理生化特征：
YZS-M04接触酶反应呈阴性，V．P测定呈阴性，MR测定呈阴性，葡萄糖产酸试验阴性，葡萄糖产气试验阴性，柠檬酸盐试验阴性，硝酸盐还原呈阳性，淀粉水解呈阳性，吲哚实验呈阴性，丙二酸测定呈阴性，产H2S试验试验阳性。
（4）16S rDNA序列分析
16S rDNA基因序列，见核苷酸序列表SEQ ID NO.1所示。将所测的16S rDNA序列与GenBank数据库中的序列比对，结果表明：YZS-M04与Bacillus siamensis 同处于一个分支上，其16S rDNA序列与Bacillus siamensis（KY962351.1）的相似度达100%。结合菌落形态，生理生化特征和16S rDNA序列分析，初步鉴定为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）。
实施例2 暹罗芽孢杆菌对聚乙烯薄膜的降解效果
为评估暹罗芽孢杆菌YZS-M04在聚乙烯降解中的应用，选取常见的聚乙烯薄膜进行降解效果测定。
将暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04在NA斜面上活化，挑取一环接入NA培养基（牛肉膏3g、蛋白胨10g、Nacl 5g、琼脂18g溶于去离子水并定容至1L；pH7.0-7.2）中培养至对数生长期。将聚乙烯膜片裁剪为1×1 cm2，称重后用75%（v/v）的乙醇灭菌2 h，然后在超净台中用无菌气流挥发掉表面的乙醇。锥形瓶中加入100 mL无碳源矿物盐液体培养基，加入表面灭菌的聚乙烯膜片3片，以1%（v/v）的接种量接种上述YZS-M04培养液（OD600调整为1.0）。以不接菌处理为对照组，每种处理设置3个平行样。将锥形瓶放置于恒温震荡培养箱中25 ℃、180 r/min培养30 d后，取样测定聚乙烯膜片质量损失及表面形貌变化、官能团变化、疏水性变化。
聚乙烯膜片质量变化测定：用2wt% SDS溶液振荡洗涤聚乙烯膜片2 h，超声15min，去除表面的生物膜；再用无菌水洗涤膜片3次，将洗涤后的聚乙烯膜片放置在干燥器中干燥48 h后称重。聚乙烯的质量损失率（%）=（聚乙烯初始质量-降解后质量）/初始质量×100%
聚乙烯膜片表面微观形貌变化测定：用无菌水冲洗聚乙烯膜片表面多余的培养基，用2.5%（v/v）戊二醛固定2 h；再依次用30vol%、50vol%、70vol%、90vol%、100vol%乙醇梯度脱水，每次15 min；再用叔丁醇置换2次，每次30 min。采用光学显微镜观察处理好的聚乙烯膜片样品的表面形貌变化；固定喷金后在扫描电子显微镜（日立SU3800）下观察聚乙烯膜片样品的微观形貌特征。
聚乙烯膜片表面疏水性变化采用接触角测量仪进行测定。
聚乙烯膜片表面官能团测定：清洗干净的聚乙烯膜片自然干燥后，采用傅里叶红外光谱仪进行测定，扫描波长范围600-4000 cm-1，分辨率4 cm-1，扫描次数32次。
从表1 可以看出，聚乙烯膜片在上述培养方式培养至30 d时，接种YZS-M04处理的聚乙烯膜片质量平均降低了0.33mg，质量损失比为6.47%。而对照处理未发生变化，表明暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04对聚乙烯膜片起到了降解的作用。
表1 YZS-M04对聚乙烯膜片质量损失的影响
由图1、图2可见，经过30 d的降解，在光学显微镜及扫描电子显微镜下观察到接种YZS-M04处理的聚乙烯膜片与对照组相比表面粗糙，边缘出现了崩解，表面出现明显的微生物侵蚀孔洞。
由图3可见，经接触角测量仪结果显示，接种YZS-M04处理的聚乙烯膜片水接触角为70.83±3.27°，比对照处理低20.57°（对照处理聚乙烯膜片水接触角为91.40±0.79°），水接触角降低了22.51%。表明暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04显著降低了聚乙烯薄膜的疏水性，使得聚乙烯薄膜更易于被微生物附着侵蚀。
由图4可见，接种YZS-M04处理的聚乙烯膜片红外光谱在1658.77 cm-1出现了新的特征峰，即羰基峰。羰基 [-C=O-键]的出现是PE发生生物降解的基本标志，表明聚乙烯膜片在暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04的作用下发生了生物降解。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 闽江学院
<120> 一株暹罗芽孢杆菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1384
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca 60
aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc 120
acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag atttgtggga ttggcttaac 180
ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgccc attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa 240
ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt 300
agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa 360
cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc acctgtcact ctgcccccga 420
aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag acctggtaag gttcttcgcg 480
ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg cccccgtcaa ttcctttgag 540
tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa tgcgttagct gcagcactaa 600
ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg gcgtggacta ccagggtatc 660
taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca gttacagacc agagagtcgc 720
cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac cgctacacgt ggaattccac 780
tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc ctccccggtt gagccggggg 840
ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta cgcccaataa ttccggacaa 900
cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag ttagccgtgg ctttctggtt 960
aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt tcttccctaa caacagagct 1020
ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc cgtcagactt tcgtccattg 1080
cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtg 1140
gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgtcgccttg gtgagccgtt acctcaccaa 1200
ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg aagccacctt ttatgtctga 1260
accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt agccccggtt tcccggagtt atcccagtct 1320
tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc taacatcagg gagcaagctc 1380
ccat 1384
Claims (2)
1.一株暹罗芽孢杆菌，其特征在于：所述菌株为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）YZS-M04，已于2020年10月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC No.20901。
2.如权利要求1所述的暹罗芽孢杆菌在聚乙烯塑料生物降解中的应用。
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