CN114921367B - 一株降解生物胺的暹罗芽胞杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株降解生物胺的暹罗芽胞杆菌及其应用，该菌株分类学命名为Bacillussiamensis，于2022年1月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo:62197。该菌株无生物胺合成能力且具有生物胺降解功能，能够有效降低发酵产物中的生物胺含量，总生物胺的降解率大于30％，其中对组胺的降解率高达55.40％，可有效控制豆制品等发酵食品生产过程中的生物胺含量，为消费者提供健康安全的发酵产品。

Description

一株降解生物胺的暹罗芽胞杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵领域，具体涉及一株降解生物胺的暹罗芽胞杆菌及其应用。
背景技术
发酵豆制品，是指以大豆、大豆制品及其加工副产物为发酵基质，在一种或多种微生物作用下制备具有特定风味和形态的食品或者调味品。中国传统的发酵豆制品，主要包括豆豉、豆酱、腐乳等。发酵豆制品富含多种营养物质，在发酵过程中，多种物质在微生物分泌酶的自然催化下发生一系列的生化反应，产生了功能性物质，使发酵豆制品更具营养和健康优势，具备多种生理功能，如降血压、抗氧化、抗癌、抗菌和溶解血栓等。
生物胺是一类非挥发性低分子量的含氮有机化合物的总称，在发酵食品中普遍存在。其中，发酵食品中常见的生物胺主要有八种，分别是：腐胺、尸胺、酪胺、β-苯乙胺、组胺、色胺、亚精胺和精胺。发酵食品中的生物胺主要源于微生物产生的系列氨基酸脱羧酶，这些酶通过脱羧作用将氨基酸转化为生物胺。人体摄入适量生物胺可调节多种正常的生理功能，但过量摄入则会引起人体产生一些不良反应，如血管和动脉舒张，产生偏头疼、血压异常、腹泻和呕吐等症状，甚至对肝脏、心脏和中枢神经系统等造成危害。大豆是发酵豆制品的主要原料，含有丰富的氨基酸，为发酵豆制品中生物胺的产生提供了充足前体物。相关技术表明，多种豆制品中含有生物胺，且部分豆制品中的生物胺含量实际上严重超标，对消费者的健康存在隐患。因此，控制发酵豆制品中生物胺的含量是尤为必要的。
目前控制发酵食品中生物胺的方法主要为物理法、化学法和生物法，物理法和化学法虽能够控制发酵食品中生物胺含量，但其对食品的品质影响较大，并容易造成二次污染。生物法因其高效、绿色的特点已成为控制食品生物胺的常用手段，其中微生物降解法已成为控制食品生物胺最具潜力的方法。但目前仅存在针对特定发酵基质，如奶酪、腐胺、发酵肉制品等发酵食品中的生物胺的菌株，但针对可降解发酵豆制品生物胺的菌株却鲜有报道，严重阻碍了发酵豆制品生物胺问题的解决。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一株降解生物胺的暹罗芽胞杆菌及其应用。在本发明中，发明人筛选并分离得到了一株可降解生物胺的暹罗芽胞杆菌，利用该菌株进行发酵，可有效降低发酵产物中的生物胺含量，从而使其更加健康安全。
本发明的第一个方面，提供一株暹罗芽胞杆菌，该暹罗芽胞杆菌是暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis)D11，其分类学命名为Bacillus siamensis，该菌株于2022年1月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为 GDMCC No:62197。
在本发明的一些实施方式中，所述暹罗芽胞杆菌是从豆豉中分离得到的。
在本发明中，发明人通过16S rDNA测序确认该菌株属于暹罗芽胞杆菌(Bacillussiamensis)，其16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
在本发明的一些实施方式中，所述暹罗芽胞杆菌可使用LB培养基进行培养或活化。当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，采用其他本领域常规培养基或培养基质进行培养或活化，包括但不限于LB固体培养基和LB液体培养基。
本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，该微生物菌剂中含有本发明第一个方面所述的暹罗芽胞杆菌。
在本发明的一些实施方式中，所述菌剂中还含有其他辅料。
在本发明的一些实施方式中，所述辅料包括冻干保护剂、溶剂、载体、培养基质中的至少一种。
当然，本领域技术人员也可以根据实际使用需求，先菌剂中加入其他本领域常规的辅料，已达到特定的使用效果，包括但不限于上述的冻干保护剂、溶剂、载体、培养基质。
本发明的第三个方面，提供一种低生物胺发酵制品的制备方法，包括：使用本发明第一个方面所述的暹罗芽胞杆菌作为发酵菌株进行发酵。
在本发明的一些实施方式中，发酵温度为30±1℃。
在本发明的一些实施方式中，发酵的接种量为3±2％(v/m)。
在本发明中，发明人发现使用上述暹罗芽胞杆菌作为发酵菌株，能够有效降低发酵产物中的生物胺含量，且降低效果显著，相比于对照组，其总生物胺能够降低30％以上。
在本发明的一些实施例中，所述制备方法具体为：将上述暹罗芽胞杆菌活化后接种于发酵物表面，其中，菌液和发酵物的料液比(v/m)为1～5：95～99，混合均匀后在置于30±1℃条件下进行发酵。
在本发明的一些实施方式中，发酵物预先经过灭菌处理。
在本发明的一些实施方式中，所述灭菌包括高温灭菌、微波灭菌、紫外灭菌。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵制品包括包括食品、药品、化妆品。
在本发明的一些实施方式中，所述食品包括谷物发酵制品、豆类发酵制品、乳类发酵制品、蔬菜发酵制品和肉类发酵制品。
在本发明的一些实施方式中，所述豆类发酵制品包括以大豆、豆汁或豆渣为原料发酵得到的产品。
本发明的第四个方面，提供含有下述至少一种的试剂在制备发酵制品中的应用；
(1)本发明第一个方面所述的暹罗芽胞杆菌；
(2)含有本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的菌剂；
(3)含有本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的活菌液；
(4)含有本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的死菌液；
(5)本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的代谢产物；
(6)本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的提取物。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵制品包括食品、药品、化妆品。
在本发明的一些实施方式中，所述食品包括谷物发酵制品、豆类发酵制品、乳类发酵制品、蔬菜发酵制品和肉类发酵制品。
在本发明的一些实施方式中，所述发酵制品中的暹罗芽胞杆菌有效接种量大于等于7 CFU/mL。
本发明的第五个方面，提供含有下述至少一种的试剂在降低或清除生物胺中的应用；
(1)本发明第一个方面所述的暹罗芽胞杆菌；
(2)含有本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的菌剂；
(3)含有本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的活菌液；
(4)含有本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的死菌液；
(5)本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的代谢产物；
(6)本发明第一个方面所述暹罗芽胞杆菌的提取物。
在本发明的一些实施方式中，所述生物胺包括色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺中的至少一种。
在本发明中，该Bacillus siamensis D11菌株显示出了极好的生物胺降解效果，其对于色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺的降解效果可达到21.92％、22.69％、34.73％、27.81％、 55.40％、26.22％，同比降低发酵产物中总生物胺的31.63％。相比与其他菌株具有更好的生物胺降解效果。
本发明的有益效果是：
1.本发明发现并分离得到了一株无生物胺合成能力，且具有生物胺降解功能的暹罗芽胞杆菌，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62197。
2.本发明提供了一种基于上述暹罗芽胞杆菌的产品，该产品能够用于制备发酵产品，并能够有效降低发酵产物中的生物胺含量，总生物胺的降解率大于30％，对于色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺这6种发酵食品中常见的生物胺均具有明显的降解作用，其中对组胺的降解率高达55.40％，可有效控制豆制品等发酵食品生产过程中的生物胺含量，为消费者提供健康安全的发酵产品。
附图说明
图1为本发明实施例中的B.siamensis D11菌株的形态特征图；
图2为使用本发明实施例中的B.siamensis D11菌株发酵后的豆豉。
具体实施方式
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
菌株的筛选与分离
发明人分别从贵州、四川、云南等各省的发酵豆豉样品进行采集，选择生物胺含量相对较低的豆豉样品作为生物胺降解芽胞杆菌的筛选样本。
具体操作为：称取5g豆豉样品加入含有45mL无菌生理盐水的无菌锥形瓶(250mL)中，置于摇床中150rpm孵育30min。取上清液进行梯度稀释涂布，将各浓度梯度稀释液涂布于LB固体平板上，然后置于37℃静置培养12h-24h。挑取菌落特征为中等大小，表面粗糙不规则，有很多隆起或褶皱，灰白或者有一点黄色的单菌落(如图1所示)作为测试菌株。共挑选出39株测试菌株。
其中，LB固体平板中的LB培养基具体组成为：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1L。
菌株的生物胺降解效果
取上述实施例中获得的39株测试菌株，进行生物胺降解效果测试。
具体操作为：将39株测试菌株分别接入新的LB培养基中，37℃条件下150rpm培养至 OD600＝4.0，然后在4℃条件下5000r/min离心10min。弃上清，收集沉淀，使用0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.0)洗涤沉淀，然后将其分别重悬至含六种生物胺(100mg/L)的0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.0)中，调整溶液中的菌密度至OD600＝0.8，以不接菌株的培养基为对照组，置于37℃恒温培养箱中培养48h。
培养结束后，参照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》中的测定方法检测各测试菌株培养液中的生物胺含量。其中，以不接入任何菌株的六种生物胺的培养液作为对照。
在本实施例中，以生物胺降解率表示各菌株的生物胺降解能力，其中，生物胺降解率的计算公式为：
Figure BDA0003635851960000051
结果如表1所示。
表1不同测试菌株的生物胺含量
Figure BDA0003635851960000052
Figure BDA0003635851960000061
通过上述结果可以发现，在上述试验中，菌株D11具有高效生物胺降解的能力，其总生物胺降解率可达到31.63％，远超其他测试菌株。
D11菌株的鉴定
采用16S rDNA测序对D11菌株进行菌种鉴定，将测序结果与NCBI中的核酸数据库进行BLAST比对。
16S rDNA测序结果发现D11菌株的16S rDNA序列为：
5’-TGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTG GGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACA TTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACC CGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGA CCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGT GATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAAT AAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGC CGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAG GTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAAC TGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGT AGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGA GGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC GATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCA CTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG ACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGT GCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAA CCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACG TGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAA ACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTA ATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCA CACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTTTT-3’(SEQ ID NO：1)。
BLAST比对结果发现D11菌株属于暹罗芽胞杆菌(Bacillus siamensis，B.siamensis)，因此将其命名为Bacillus siamensis D11。发明人将该菌株于2022年1月10日送至广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)进行菌种保藏，其分类学命名为Bacillussiamensis，保藏中心地址为：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCCNo:62197。
B.siamensis D11的生物胺产生效果
发明人将Bacillus siamensis D11接入LB培养基中，37℃条件下150rpm培养至OD600＝4.0， 4℃条件下5000r/min离心10min，弃上清，收集沉淀，使用0.05mol/L的PBS缓冲液(pH＝7.0) 洗涤沉淀，然后将菌体重悬至MMRS-C培养基中，调整培养液中的菌密度至OD600＝0.8。以不接菌株的MMRS-C培养基为对照组。将其置于37℃恒温培养箱中培养48h。培养结束后， 12000r/min离心10min，收集上清液，按照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》测定生物胺含量。
其中，MMRS-C培养基的具体组成为：葡萄糖20g，柠檬酸三胺2g，乙酸钠5g，MgSO4·7H2O 0.2g，MnSO4·4H2O 0.05g，磷酸氢二钾2g，吐温-80 1.08g，色氨酸1g，苯丙氨酸1g，鸟氨酸1g，赖氨酸1g，组氨酸1g，酪氨酸1g，加蒸馏水定容至1L。
结果发现接种了Bacillus siamensis D11的培养基中为测出任何色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺和酪胺，总生物胺含量为0mg/kg。说明Bacillus siamensis D11无生物胺合成能力。
B.siamensis D11对豆豉生物胺的降解效果
将Bacillus siamensis D11接种于LB固体培养基中，37℃培养12h，然后挑取菌落接种于 LB液体培养基中37℃培养12h。然后以0.5％(v/v)的接种量接入到新的LB液体培养基中进行二次活化，作为发酵菌剂的活化种子液。
取市售大豆，洗净，浸泡12h。称量30g加入250mL三角瓶中，121℃灭菌20min。以3％(v/m)的接种量向灭菌后的大豆中接种上述活化种子液，30℃发酵7d，得到发酵豆豉(如图2所示)。
以不接菌的自然发酵作为对照组。
按照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》测定生物胺含量。
结果如表2所示。
表2不同发酵处理的豆豉生物胺含量
Figure BDA0003635851960000081
可以发现，自然发酵组豆豉的生物胺含量较高，总生物胺含量达到446.50mg/kg，而接种B.siamensis D11发酵豆豉的生物胺含量显著低于自然发酵组，仅为16.87mg/kg，该结果表明B.siamensis D11能够有效控制豆豉发酵过程中生物胺的积累，可作为豆豉潜在的安全健康发酵菌剂。
B.siamensis D11对豆渣生物胺的降解
发酵菌剂的活化种子液的制备方法同上述实施例。
取市售大豆，洗净，浸泡12h，加水研磨粉碎，过滤后得到豆渣。称取70g豆渣加入250 mL三角瓶中，121℃灭菌20min。以3％(v/m)的接种量向灭菌后的豆渣中接种上述活化种子液，30℃发酵7d。
以不接菌的自然发酵作为对照组。
按照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》测定生物胺含量。
结果如表3所示。
表3不同发酵处理的豆渣生物胺含量
Figure BDA0003635851960000082
可以发现，自然发酵组豆渣的生物胺含量较高，总生物胺含量达到331.18mg/kg，而接种B.siamensis D11发酵豆渣的生物胺含量显著低于自然发酵组，仅为74.53mg/kg，该结果表明B.siamensis D11能够有效控制豆渣发酵过程中生物胺的积累，可作为豆渣潜在的安全健康发酵菌剂。
B.siamensis D11对豆汁生物胺的降解
发酵菌剂的活化种子液的制备方法同上述实施例。
取市售大豆，洗净，浸泡12h，加水研磨粉碎，过滤后得到豆汁。取70mL豆汁加入250mL三角瓶中，121℃灭菌20min。以3％(v/m)的接种量向灭菌后的豆汁中接种上述活化种子液，30℃发酵7d。
以不接菌的自然发酵作为对照组。
按照GB 5009.208-2016《食品中生物胺的测定》测定生物胺含量。
结果如表4所示。
表4不同发酵处理的豆汁生物胺含量
Figure BDA0003635851960000091
可以发现，自然发酵组豆汁的生物胺含量较高，总生物胺含量达到347.65mg/kg，而接种B.siamensis D11发酵豆汁的生物胺含量显著低于自然发酵组，仅为67.60mg/kg，该结果表明B.siamensis D11能够有效控制豆汁发酵过程中生物胺的积累，可作为豆汁潜在的安全健康发酵菌剂。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所
<120> 一株降解生物胺的的暹罗芽胞杆菌及其应用
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tggattaaga gcttgctctt atgaagttag cggcggacgg gtgagtaaca cgtgggtaac 60
ctgcccataa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggata acattttgaa 120
ccgcatggtt cgaaattgaa aggcggcttc ggctgtcact tatggatgga cccgcgtcgc 180
attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcaacga tgcgtagccg acctgagagg 240
gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg 300
aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat gaaggctttc 360
gggtcgtaaa actctgttgt tagggaagaa caagtgctag ttgaataagc tggcaccttg 420
acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg 480
tggcaagcgt tatccggaat tattgggcgt aaagcgcgcg caggtggttt cttaagtctg 540
atgtgaaagc ccacggctca accgtggagg gtcattggaa actgggagac ttgagtgcag 600
aagaggaaag tggaattcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatatgg aggaacacca 660
gtggcgaagg cgactttctg gtctgtaact gacactgagg cgcgaaagcg tggggagcaa 720
acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt gttagagggt 780
ttccgccctt tagtgctgaa gttaacgcat taagcactcc gcctggggag tacggccgca 840
aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900
tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatcct ctgacaaccc tagagatagg 960
gcttctcctt cgggagcaga gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020
gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgatc ttagttgcca tcattaagtt 1080
gggcactcta aggtgactgc cggtgacaaa ccggaggaag gtggggatga cgtcaaatca 1140
tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gacggtacaa agagctgcaa 1200
gaccgcgagg tggagctaat ctcataaaac cgttctcagt tcggattgta ggctgcaact 1260
cgcctacatg aagctggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1320
cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgagagtt tgtaacaccc gaagtcggtg 1380
gggtaacctt tt 1392

Claims (11)

1.一株暹罗芽胞杆菌，其特征在于，所述暹罗芽胞杆菌是暹罗芽胞杆菌（Bacillus siamensis）D11，其分类学命名为Bacillus siamensis，于2022年1月10日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:62197。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的暹罗芽胞杆菌的活菌液。
3.一种低生物胺发酵制品的制备方法，包括：使用权利要求1中的暹罗芽胞杆菌作为发酵菌株进行发酵，发酵温度为30±1℃，接种量为3%。
4.权利要求1所述的暹罗芽胞杆菌在制备发酵制品中的应用；所述发酵制品为豆豉、豆渣或豆汁。
5.含有权利要求1所述暹罗芽胞杆菌的活菌菌剂在制备发酵制品中的应用；所述发酵制品为豆豉、豆渣或豆汁。
6.含有权利要求1所述暹罗芽胞杆菌的活菌液在制备发酵制品中的应用；所述发酵制品为豆豉、豆渣或豆汁。
7.权利要求1所述的暹罗芽胞杆菌在降解生物胺中的应用。
8.含有权利要求1所述暹罗芽胞杆菌的活菌菌剂在降解生物胺中的应用。
9.含有权利要求1所述暹罗芽胞杆菌的活菌液在降解生物胺中的应用。
10.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，所述发酵制品中的暹罗芽胞杆菌有效接种量大于等于7 CFU/mL。
11.根据权利要求7-9任一项所述的应用，其特征在于，所述生物胺包括色胺、β-苯乙胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺中的至少一种。
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