WO2014069922A1 - 신규한 균주 바실러스 아밀로리쿼페이션스 ｃｊ ３-２７ 및 아스퍼질러스 오리재 ｃｊ ｋｇ를 이용한 한식 메주된장의 제조방법 - Google Patents

신규한 균주 바실러스 아밀로리쿼페이션스 ｃｊ ３-２７ 및 아스퍼질러스 오리재 ｃｊ ｋｇ를 이용한 한식 메주된장의 제조방법 Download PDF

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이승연
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    • C12R2001/07—Bacillus
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    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/69—Aspergillus oryzae

Definitions

  • the present invention is a Korean strained soybean paste using Bacillus amyloliquefaciens CJ 3-27 and Aspergillus oryzae CJ KG, which have excellent protease activity isolated from traditional meju. It is about the manufacturing method of.
  • Soybeans have traditionally been used as a dietary source of protein and essential fatty acids due to their high protein and fat content.
  • doenjang a fermented food
  • Aspergillus flavus produces aflatoxin, a mycotoxin that is harmful to the human body, and Bacillus cereus produces emetic toxin or diarrhea. Produces diarrhetic toxin.
  • histamine a representative biogenic amine that can be caused by microorganisms during fermentation in protein-containing foods, is difficult to breathe, redness, sweating, headache, diarrhea and cramps when ingested at a certain level or more. May cause blood pressure rise and drop, hives.
  • the strains have been developed by screening excellent strains in traditional Koreans, and by inoculating such excellent strains as starters, a manufacturing method for overcoming problems in traditional Koreans has been developed.
  • a manufacturing method for overcoming problems in traditional Koreans has been developed.
  • the improved soybean paste is advantageous in terms of fermentation, ripening period and quality control, but there are technical limitations that cannot realize the rich and deep taste of traditional doenjang.
  • the present invention aims to solve the problems of the quality of the traditional Korean traditional miso and to develop a technique for producing a Korean Meju soybean paste having a sensory excellent taste quality that cannot be improved.
  • the present invention provides Bacillus amyloliquefaciens CJ 3-27 and Aspergillus oryzae CJ KG, which are strains having excellent protease activity isolated from traditional meju. .
  • the present invention is Bacillus amyloliquefaciens CJ 3-27 which is a strain excellent in protease activity isolated from traditional meju and strains excellent in protease activity Aspergillus oryzae CJ KG is provided.
  • the invention also comprises the steps of sorting, washing and soaking soybeans; Cooling the soybeans after cooking them; Preparing a culture solution by culturing Bacillus amylolytics CJ 3-27; Inoculating the cooled soybeans with a culture solution of Bacillus amylolytics CJ 3-27 and then chopping; Shaping the chopped chilled soybeans; Overlaying the molded meju; Aspergillus Duck Culturing the CJ KG to produce a final; Spraying and inoculating the final meju in the molded meju; Salting the fermented meju by brine; And it provides a method for producing a Korean-made meju soybean paste excellent in functional quality, comprising the step of aging the brine separated doenjang.
  • the present invention has an excellent effect in shortening the fermentation period and maturation period of the meju in the production of the traditional Korean traditional doenjang, while making the Korean traditional meju miso with a uniform taste quality while ensuring safety against pathogenic microorganisms.
  • 1 is a process-specific diagram for the production of Korean Meju soybean paste of the present invention.
  • Figure 2 shows the degree of cracking outside the meju according to whether the cooked soybeans are cooled.
  • Figure 3 shows the amount of water decrease according to the degree of cracking outside the meju during the fermentation process.
  • Figure 4 shows the descriptive analysis of the detailed taste properties and strength of each doenjang.
  • the present invention provides Bacillus amyloliquefaciens CJ 3-27 and Aspergillus oryzae CJ KG, which are strains having excellent protease activity in traditional meju.
  • the present invention isolates various strains from the traditional Meju of Korea and then isolates the genus Bacillus spp. Strain excellent protease activity among them.
  • the isolate of the genus Bacillus was isolated by 16s rDNA sequencing. the results are as follow.
  • Bacillus amyloliquefaciens SEQ ID NO: 1. This strain with excellent antimicrobial activity was named Bacillus amyloliquefaciens CJ 3-27, which was deposited with the Korea Microorganism Conservation Center on October 22, 2012 (Accession No. KCCM11317P).
  • the present invention isolates a variety of fungi (fungi) from the traditional Meju of Korea, and among them, isolates of the genus Aspergillus sp. Excellent in the production efficiency of protease (protease).
  • the isolated Aspergillus strain was identified by 18s rDNA sequencing. the results are as follow.
  • the isolated Aspergillus strain is Aspergillus duck material ( Aspergillus oryzae (SEQ ID NO: 2). Excellent production efficiency of protease This strain Aspergillus duck Aspergillus oryzae ) CJ KG, which was deposited on September 27, 2012 to the Korea Center for Microbiological Conservation (Accession No. KCCM11301P).
  • the present invention also provides Bacillus amyloliquefaciens CJ 3-27, a strain having excellent protease activity isolated from the traditional meju, and Aspergillus duck, a strain having excellent production efficiency of protease. It provides a method of preparing Korean Meju Doenjang using ash ( Aspergillus oryzae ) CJ KG.
  • the present invention comprises the steps of sorting, washing and soaking soybeans; Cooling the soybeans after cooking them; Preparing a culture solution by culturing Bacillus amylolytics CJ 3-27; Inoculating the cooled soybeans with a culture solution of Bacillus amylolytics CJ 3-27 and then chopping; Shaping the chopped chilled soybeans; Overlaying the molded meju; Aspergillus Duck Culturing the CJ KG to produce a final; Spraying and inoculating the final meju in the molded meju; Salting the fermented meju by brine; And it provides a method for producing a Korean-made meju soybean paste excellent in functional quality, comprising the step of aging the brine separated doenjang.
  • the cooked soybean is preferably cooled to above a certain temperature, more preferably to a temperature of 50-65 °C.
  • the cooling step not only blocks the growth potential of Bacillus cereus , a pathogenic microorganism that does not grow above 50 ° C, but also promotes the germination of spores of Bacillus amyloliquidosis CJ 3-27 strain. Domination of bacteria inhibits the growth of Bacillus cereus.
  • the cooling step also induces external cracking of the meju during the kneading process. The external cracking of the meju enables the proliferation of aerobic bacteria and molds sequentially from the inside of the meju by inducing air from the surface of the meju to the inside of the meju during the fermentation stage. By increasing the fermentation period and ripening period of the meju can be shortened.
  • the Bacillus amyloliquisions CJ 3-27 strain is preferably used as a culture medium cultured by switching to spores.
  • the culture medium of the strain is preferably inoculated 0.1 to 5% by weight of the soybean grains in the chilled cooked soybeans.
  • the culture medium for culturing the bacteria is preferably soy medium.
  • the soy medium is 1-10% of soy sauce selected from Korean soy sauce, brewed soy sauce or mixed soy sauce and 0.1-10% of a sugar member selected from the group consisting of glucose, sucrose, galactose or maltose It can be prepared by mixing.
  • the present invention is inoculated in Bacillus amyloliquefaction CJ 3-27 strain stored purely in soy sauce medium (brewed soy sauce + glucose), spores in the temperature range of 30 °C to 42 °C Incubate for 20 to 42 hours until production to prepare a culture solution of Bacillus amyloliquation CJ 3-27 strain.
  • Bacillus amyloliquefaction CJ 3-27 strain stored purely in soy sauce medium (brewed soy sauce + glucose), spores in the temperature range of 30 °C to 42 °C Incubate for 20 to 42 hours until production to prepare a culture solution of Bacillus amyloliquation CJ 3-27 strain.
  • chopping refers to a process of grinding soybeans into small sizes, and the size thereof is not particularly limited.
  • the shape of the meju may be selected from a shape including all three-dimensional shapes such as a cuboid, a cube, a cylindrical shape, a donut shape, a round oval shape, a ball shape, and the like.
  • the meju may be a cuboid having a size of 2 ⁇ 2 cm 3 to 30 ⁇ 30 cm 3 and having a weight of 100 g to 5 kg.
  • wrap refers to drying the molded meju.
  • the kneading is preferably carried out by hot air drying at a temperature of 50 °C to 65 °C for 5 to 24 hours.
  • the kneading process has the effect of inhibiting external contamination and growth of harmful microorganisms in the air during the fermentation period by drying the moisture outside the meju in a short time.
  • the Aspergillus Duck End of CJ KG is preferably inoculated 0.01 to 1% of the soybean grain weight.
  • Fermentation is preferably performed for 7 to 30 days at a temperature of 10 °C to 45 °C.
  • Salted soybean paste is aged at room temperature for 4 to 6 months with minimal surface contact with air.
  • the bacteria are plated in a plate counting agar (PCA) medium, incubated at 37 ° C, a plate containing about 30 to 50 colonies is selected, and platinum is used.
  • PCA plate counting agar
  • the pure water was separated by three stages of separation. Mold was aseptically isolated from colonies that appeared on PDA (potato dextrose agar) and incubated at 28 °C. A total of 893 strains, including 773 strains of bacteria and 120 strains of fungi, were isolated.
  • bacteria were inoculated at 37 ° C. and molds at 28 ° C. after inoculation into Soybean slurry agar containing 1% skim milk. Incubated for 1-7 days. After that, the size of the clear zone (Clear zone) appeared was selected one bacterium with high enzyme activity and one fungus.
  • Strain identification was carried out by 16s rDNA sequencing and 16s rDNA sequencing of bacteria and 16s rDNA sequencing, respectively.
  • soy sauce 1% to 10%
  • glucose 0.1% to 5%
  • Bacillus amyloliquefaciens ( Bacillus amyloliquefaciens ) CJ3-27 strain according to the culture time and the number of spores change results are shown in Table 1 below.
  • Aspergillus duckwood which was purified by adding purified water to bran, water content in 40% ⁇ 60% range, sterilized at 121 °C for 15 ⁇ 30 minutes, cooled to below 40 °C, and purely cultured in PDA medium.
  • Aspergillus oryzae Platinum was inoculated with CJ KG strain, and incubated for about 5 to 10 days in the range of 25 ° C. to 40 ° C., and spores were produced, and then pulverized in a sterile state.
  • the soybean was washed through a selection step of removing foreign matters of the soybean, and water was immersed after adding water three times the weight of the soybean.
  • the soaked soybeans were drained and steamed, and then cooled to a temperature of 50 to 65 ° C. within 30 minutes using a blower.
  • the strained culture solution prepared in Example 2 was inoculated and mixed in a chilled soybean so as to be 0.1-5% of the weight of soybean grains, and then chopped to form a meju in the form of a weight of 1.2-2 kg cuboid.
  • the molded meju was dried for 10 to 24 hours at a temperature of 50 to 65 °C using a hot air dryer.
  • the dried meju was taken out of the dryer, and the strain culture solution prepared in Example 3 was inoculated to 0.01 to 1% of the soybean grain weight.
  • the prepared meju is fermented at a temperature of 10 to 45 ° C. for about 7 to 30 days, and then brine having a salt concentration of 18% to 25% of 1.8 to 2.5 times the weight of meju is added, followed by salting for 10 to 50 days. After brine was separated.
  • the separated doenjang was placed in a maturing vessel, and aged at room temperature by minimizing the surface of direct contact with air by using a salt and pressing plate on top of the doenjang.
  • the salt used at this time may use any of refined salt, roasted salt, bamboo salt, rock salt, preparation salt and toppan salt.
  • Molded meju and steamed soybeans were cooled to 50-65 ° C. using a blower without cooling the cooked soybeans, respectively, to prepare shaped mejus. Each prepared meju was dried at 50-65 ° C. for 10-24 hours in a hot air dryer.
  • this reduces the water to form a water gradient inside the meju to allow the fungus that requires low water content to grow outside, and to promote the growth of bacteria and lactic acid bacteria within the relatively high water. It has the effect of causing multiple fermentation of various microorganisms in one mass of meju.
  • Example 6 Bacillus amylolytics ( Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 And Aspergillus duck Aspergillus oryzae ) Comparison of Quality after Fermentation According to CJ KG Inoculation
  • Korean meal meju miso showed a higher preference in the overall taste.
  • the most important taste attributes of doenjang were found to have high taste and taste level (p ⁇ 0.05), and bitter strength tended to be weak (p ⁇ 0.1), which seemed to have a positive effect on overall taste quality.
  • the Korean Meju soybean paste according to Example 4 was found to have a better 'aftertaste / sweetness / salty / sweet / feeling taste' compared to the control (p ⁇ 0.05).
  • the control product had a sour odor that was not good.
  • the Korean-style meju soybean paste according to Example 4 was mentioned as having good taste and rich taste, and the response was high (20% or more), and it was analyzed that the unique taste of the doenjang was well implemented.
  • the product according to Example 4 it was analyzed that the traditional soybean flavor, soy sauce flavor, meju flavor, salty flavor, fresh flavor, bitter flavor and salty taste, sour taste, rich flavor, soy sauce flavor, meju flavor, and traditional miso flavor.

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Abstract

본 발명은 전통메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG를 이용한 한식 메주된장의 제조방법에 대한 것이다.

Description

신규한 균주 바실러스 아밀로리쿼페이션스 ＣＪ ３-２７ 및 아스퍼질러스 오리재 ＣＪ ＫＧ를 이용한 한식 메주된장의 제조방법
본 발명은 전통메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 이 우수한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG를 이용한 한식 메주된장의 제조방법에 대한 것이다.
전통적으로 채식 위주의 식생활을 하는 우리 민족에게 대두는 높은 단백질과 지방함량으로 인하여 단백질 및 필수지방산의 급원 식품으로서 사용되어 왔다. 특히, 발효식품인 된장은 대두를 사용하여 발효시킨 메주를 주원료로 하여 제조한 발효식품으로서, 발효과정을 거치면서 생성된 다양한 생리활성 물질에 의해 항암, 혈당 강하, 돌연변이 억제, 혈전 용해능 등의 다양한 생리활성을 나타내며, 대두로부터 전이된 토코페롤(tocopherol), 이소플라본(isoflavones) 및 페놀산(phenolic acids) 등의 항산화 성분을 함유하는 영양학적으로 우수한 우리 고유의 전통 발효식품이다.
전통 재래식 된장은 대두로 메주를 쑤어 벽돌형 또는 구형으로 빚어 자연발효시킨 후, 식염수에 침지시켜 6 내지 12개월 숙성한 다음 간장을 분리하고 고형분을 숙성시켜 제조된다.
전통 재래식 된장은 상기와 같은 우수한 영양과 생리활성 등의 기능적인 면에도 불구하고, 지역에 따라 약간씩 그 제조방법에 차이가 있으며, 토착 미생물에 의해 발효가 진행되기 때문에 품질의 편차가 심할 뿐만 아니라, 여러 위해 미생물들이 발효에 영향을 미쳐 맛품질이 일정하지 않다는 문제점이 있다.
상기 위해 미생물의 예로, 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)는 인체에 유해한 곰팡이 독소(mycotoxin)인 아플라톡신(aflatoxin)을 생성하며, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 구토형 독소(Emetic toxin) 또는 설사형 독소(Diarrhetic toxin)를 생성한다. 또한, 단백질 함유 식품 속에서 발효 과정 중 미생물에 의해 발생할 수 있는 대표적인 바이오제닉 아민(Biogenic amines)인 히스타민(histamine)은 일정 수준 이상의 농도로 섭취 시 호흡곤란, 발열홍조, 발한, 두통, 설사, 경련, 혈압상승 및 강하, 두드러기를 유발할 수 있다.
전통 재래식 된장을 글로벌한 식품으로 성장시키기 위해서는 표준화된 제조방법의 확립으로 식품의 안전성, 맛품질의 편차 최소화 및 관능상 우수한 품질의 제품을 확보하기 위한 공정개발이 필수적이라 할 수 있다.
최근 한식의 세계화를 위해 된장의 우수성을 알리고자 된장의 제조방법의 표준화 및 된장의 영양성분과 기능성 효과에 대한 많은 연구가 진행되고 있다.
그 연구의 일환으로서 전통 장류에서 우수 균주들을 스크리닝하여 개발하고 있으며, 이러한 우수 균주를 스타터(starter)로 접종하여 전통 장류에서 나타나는 문제점들을 극복하는 제조공법을 개발하고 있다. 그러나, 덩어리 형태의 전통 한식메주의 방식 연구보다는 콩알메주 형태의 개량된장 제조방법에 대한 연구가 거의 대부분이다. 개량된장은 발효 및 숙성기간 단축과 품질관리 측면에서 유리한 면도 있지만, 전통 메주된장에서 발현되는 전통된장의 풍부하고 깊은 구수한 맛을 구현해 내지 못하는 기술적 한계가 존재한다.
본 발명은 종래 전통 재래식 된장에서 가지고 있던 품질적 문제점들의 해결 및 개량된장이 가질 수 없는 관능상 우수한 맛품질을 가지는 한식 메주된장을 제조하는 기술을 개발하고 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
따라서, 본 발명은 전통메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 또한 상기 신규한 균주를 이용한 한식 메주된장의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 전통메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 및 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG를 제공한다.
본 발명은 또한 대두를 선별 및 세척하고 침지하는 단계; 상기 대두를 증자한 후 냉각시키는 단계; 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27을 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 상기 냉각 대두에 상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27의 배양액을 접종한 후 쵸핑하는 단계; 상기 쵸핑된 냉각 대두를 성형하는 단계; 상기 성형된 메주를 겉말림하는 단계; 아스퍼질러스 오리재 CJ KG를 배양하여 종국을 제조하는 단계; 상기 성형된 메주에 상기 종국을 분사 접종한 후 발효하는 단계; 상기 발효된 메주를 염지하여 염수분리하는 단계; 및 염수분리된 된장을 숙성시키는 단계를 포함하는, 관능상 품질이 우수한 한식 메주된장을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은 종래의 전통 한식된장의 제조에 있어 메주 발효기간 및 숙성기간을 단축시키고, 병원성 미생물에 대한 안전성도 확보하면서 균일한 맛품질을 갖는 한식 메주된장을 만드는데 뛰어난 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 한식 메주된장의 제조를 위한 공정별 다이어그램이다.
도 2는 증자대두의 냉각 여부에 따른 메주 외부의 갈라짐 정도를 나타낸 것이다.
도 3은 발효 과정 중 메주 외부의 갈라짐 정도에 따른 수분 감소량을 나타낸 것이다.
도 4는 각 된장의 세부 맛속성 및 강도에 대한 묘사분석 결과를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 전통메주에서 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG를 제공한다.
구체적으로, 본 발명은 우리나라의 전통메주에서 다양한 균주들을 분리한 다음 그 중에서 단백질 분해효소 활성이 탁월한 바실러스 속(Bacillus spp.) 균주를 분리하였다. 16s rDNA 염기 서열분석(16s rDNA sequencing)을 통하여 분리된 바실러스 속 균주의 동정을 진행하였다. 그 결과는 다음과 같다.
Figure PCTKR2013009805-appb-I000001
상기와 같은 16s rDNA 서열분석에 기반한 계통수(phylogenetic tree)에 의하여, 분리된 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens)로 동정되었다(서열번호 1). 항균활성이 우수한 이 균주를 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27로 명명하고, 이를 2012년 10월 22일에 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 KCCM11317P).
또한, 본 발명은 우리나라의 전통메주에서 다양한 곰팡이(fungi)들을 분리한 다음 그 중에서 단백질 분해효소(protease) 생산효율이 우수한 아스퍼질러스 속 (Aspergillus sp.) 균주를 분리하였다. 18s rDNA 서열분석(18s rDNA sequencing)을 통하여 분리된 아스퍼질러스 속 균주의 동정을 진행하였다. 그 결과는 다음과 같다.
Figure PCTKR2013009805-appb-I000002
상기와 같은 18s rDNA 염기서열분석에 기반한 계통수에 의하여, 분리된 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)로 동정되었다(서열번호 2). 단백질 분해효소(protease) 생산효율이 우수한 이 균주를 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG로 명명하고, 이를 2012년 9월 27일에 한국미생물보존센터에 기탁하였다(수탁번호 KCCM11301P).
본 발명은 또한 상기 전통메주에서 분리한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 및 분해효소(protease) 생산효율이 우수한 균주인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG를 이용한 한식 메주된장의 제조방법을 제공한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은 대두를 선별 및 세척하고 침지하는 단계; 상기 대두를 증자한 후 냉각시키는 단계; 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27을 배양하여 배양액을 제조하는 단계; 상기 냉각 대두에 상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27의 배양액을 접종한 후 쵸핑하는 단계; 상기 쵸핑된 냉각 대두를 성형하는 단계; 상기 성형된 메주를 겉말림하는 단계; 아스퍼질러스 오리재 CJ KG를 배양하여 종국을 제조하는 단계; 상기 성형된 메주에 상기 종국을 분사 접종한 후 발효하는 단계; 상기 발효된 메주를 염지하여 염수분리하는 단계; 및 염수분리된 된장을 숙성시키는 단계를 포함하는, 관능상 품질이 우수한 한식 메주된장을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 증자된 대두는 일정 온도 이상으로 냉각시키는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 50 - 65℃의 온도로 냉각시킨다.
상기 냉각 단계는 50℃ 이상에서는 증식하지 못하는 병원성 미생물인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 증식 가능성을 차단시킬 뿐만 아니라, 또한 포자 상태의 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27 균주의 발아를 촉진시켜 초기균으로 우점화시킴으로써 바실러스 세레우스의 증식을 억제한다. 상기 냉각 단계는 또한 겉말림 공정 중 메주의 외부 갈라짐을 유도한다. 메주의 외부 갈라짐은 발효 단계에서 메주 표층으로부터 메주 내부까지의 공기 유입을 유도함으로써 메주 내부까지 순차적으로 호기성 세균 및 곰팡이의 증식을 가능하게 하고, 이들 균주의 증식으로 인한 효소 분비 작용으로 메주의 효소역가를 상승시켜 메주의 발효기간 및 숙성기간을 단축시킬 수 있다.
상기 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27 균주는 포자상태로 전환시켜 배양한 배양액으로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 균주의 배양액은 냉각된 증자대두에 대두 원곡 중량대비 0.1~5%를 접종하는 것이 바람직하다.
상기 세균을 배양하는 배양배지는 간장배지인 것이 바람직하다. 상기 간장배지는 한식간장, 양조간장 또는 혼합간장으로부터 선택된 간장 1~10% 및 글루코스(glucose), 수크로스(sucrose), 갈락토스(glactose) 또는 말토오스(maltose) 로 이루어진 군으로부터 선택된 당원 0.1~10%를 혼합하여 제조될 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현에 있어서, 본 발명은 순수 분리하여 보관한 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27 균주를 간장배지(양조간장+글루코스)에 접종하고, 30℃ 내지 42℃의 온도범위에서 포자가 생성될 때까지 20 내지 42시간 배양하여 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ 3-27 균주의 배양액을 제조하였다.
본 발명에서, 쵸핑(Chopping)은 대두를 작은 크기로 분쇄하는 공정을 의미하며, 그 크기는 특별히 제한되지 않는다.
메주의 성형 형태는 직육면체, 정육면체, 원기둥 모양, 도너츠 모양, 둥근 타원형, 공모양 등 덩어리 형태의 입체적인 모양을 모두 포함하는 형태로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 메주는 2×2cm3 내지 30×30cm3 의 크기를 가지고, 100g 내지 5kg의 중량을 가지는 직육면체일 수 있다.
본원에서, 상기 용어 겉말림은 성형된 메주를 건조시키는 것을 의미한다.
상기 겉말림은 5~24 시간 동안 50℃ 내지 65℃의 온도에서 열풍건조로 수행되는 것이 바람직하다. 상기 겉말림 공정은 메주 외부의 수분을 단시간에 건조킴으로써 발효기간 중 공기 중의 위해 미생물의 외부 오염 및 증식을 억제하는 효과가 있다.
상기 아스퍼질러스 오리재 CJ KG의 종국은 대두 원곡중량대비 0.01 내지 1%를 접종하는 것이 바람직하다.
발효는 10℃ 내지 45℃의 온도에서 7 내지 30일간 수행하는 것이 바람직하다.
상기 발효 후, 발효된 메주에 18 내지 25% 염농도의 염수를 메주 중량의 1.8 내지 2.5배로 첨가하여 10 내지 50일간 염지하고 염수를 분리하였다.
염수분리된 된장은 최대한 공기와 직접 접촉하는 표면을 최소화하여 실온에서 4 내지 6개월간 숙성시킨다.
이하 본 발명의 내용을 실시 예에 의해 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만 이들 실시예는 본 발명의 내용을 이해하기 위해 제시되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들 실시한 예로 한정되어지는 것으로 해석되어져서는 아니된다.
[ 실시예 ]
실시예 1 : 전통메주로부터 균주의 분리 및 동정
균주를 분리하기 위하여 경기, 강원, 충남, 충북, 경북, 전남 소재의 전통 식품 제조 업체에서 수거한 전통메주를 시료로 사용하였다.
전통 메주를 멸균수에 희석한 다음, 세균은 PCA(Plate counting agar)배지에 도말하여 37℃에서 배양하고, 약 30~50여개의 콜로니가 나타나는 플레이트(plate)를 선택하고, 백금이를 사용하여 3단 분리를 행하여 순수분리하였다. 곰팡이는 PDA(potato dextrose agar)에 도말하여 28℃에서 배양하면서 나타나는 집락을 무균적으로 분리하였다. 세균은 773 균주, 곰팡이는 120 균주 등 총 893 균주를 분리하였다.
상기 분리 균주 중에서 단백질 분해효소 활성이 높은 균주를 선별하기 위하여 1% 스킴 밀크(Skim milk)를 함유한 대두 경사 한천배지(Soybean slurry agar)에 접종 후 세균은 37℃에서, 곰팡이는 28℃에서 3일~7일 배양하였다. 그 후 나타나는 클리어 존(Clear zone)의 크기를 측정하여 효소 활성이 높은 균들 증 세균 1종과 곰팡이 1종을 선별하였다. 균주 동정은 순수분리 균주를 대상으로 세균은 16s rDNA 염기 서열분석(16s rDNA sequencing)과 곰팡이는 18s rDNA 염기 서열분석(16s rDNA sequencing)을 통하여 각각 동정을 진행하였다.
실시예 2: 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ3-27 균주 배양액의 제조
간장(1%~10%)과 글루코스(0.1%~5%)를 혼합한 후, 식용 수산화나트륨으로 pH를 중성으로 보정하고, 120℃에서 15분간 멸균하여 간장배지를 제조하였다. 영양 한천배지(Nutrient agar)에 순수 분리하여 보관해 놓은 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ3-27 균주 콜로니를 1 백금이 취하여 상기 멸균된 간장배지에 접종하였다. 이를 30℃~42℃ 온도 범위에서 포자가 생성될 때까지 20시간 내지 42시간 동안 배양하여 바실러스 아밀로리쿼페이션스 CJ3-27 배양액을 제조하였다. 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ3-27 균주의 배양 시간별 균수 및 포자수 변화결과를 하기 표 1에 나타내었다.
표 1 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ3-27 균주의 배양 시간별 균수 및 포자수 변화결과
배양시간 pH 흡광도(660nmｘ10) 총균수(cfu/ml) 포자수(cfu/ml)
0 시간 7.0 0.056 7.E+06 　
8 시간 5.2 0.413 1.E+09 　
12시간 6.6 0.533 4.E+08 　
16시간 6.8 0.775 3.E+08 3.E+04
20시간 6.7 0.829 3.E+09 5.E+08
24시간 6.0 0.840 4.E+09 9.E+07
실시예 3 : 아스퍼질러스오리재 CJ KG 균주 종국의 제조
밀기울에 정수를 첨가하여 수분함량을 40%~60% 범위로 가수하고, 121℃에서 15분~30분간 멸균하여 40℃ 이하로 냉각시키고, PDA배지에서 순수배양한 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG 균주를 일 백금이 접종하여, 25℃~40℃ 범위에서 5일에서 10일 정도 정치배양 한 후 포자 생성한 후에 무균상태에서 분쇄하여 종국을 제조하였다.
실시예 4 : 한식 메주된장의 제조
(1) 대두 선별 및 세척
대두의 이물질을 제거하는 정선단계를 거쳐 대두를 세척하고, 대두 중량의 3배의 물을 가수한 후 침지하였다.
(2) 대두 증자 및 냉각
수침한 대두의 물을 빼고 증자한 다음, 송풍기를 이용하여 30분 이내로 50 내지 65℃의 온도로 냉각하였다.
(3) 바실러스 아밀롤리쿼파시엔시스 CJ3-27 균주 접종 및 메주 성형
상기 냉각된 증자대두에 상기 실시예 2에서 제조된 균주 배양액을 대두 원곡 중량대비 0.1 내지 5%가 되도록 접종 혼합하고 쵸핑하여, 중량 1.2~2kg 직육면체의 형태로 메주를 성형하였다.
(4) 성형된 메주의 겉말림 및 아스퍼질러스 오리재 CJ KG 균주 접종
상기 성형된 메주를 열풍건조기를 이용하여 50~65℃의 온도에서 10~24시간을 겉말림 하였다. 겉말림한 메주를 건조기에서 꺼내어, 상기 실시예 3에서 제조된 균주 배양액을 대두 원곡 중량대비 0.01 내지 1%가 되도록 접종하였다.
(5) 메주의 발효, 염지, 숙성
상기 제조된 메주를 10~45℃ 온도에서 약 7~30일간 발효를 진행한 후, 메주 중량의 1.8~2.5배의 18%~25%의 염농도를 갖는 염수를 첨가하고, 10 내지 50일간 염지한 후 염수분리 하였다.
염수분리한 후 분리된 된장을 숙성 용기에 담고, 된장 윗쪽에 덧소금과 누름판을 이용하여 공기와 직접 접촉하는 표면을 최소화하여 실온에서 숙성시켰다. 이 때 사용하는 소금은 정제염, 구운소금, 죽염, 암염, 제제염 및 토판염 중 어느 것을 사용하여도 좋다.
실온에서 숙성시키면서 된장의 숙성된 정도(아미노태 질소 함량, mg%)를 측정하고 맛을 보아 품질을 확인하여 숙성을 종료시켰다. 숙성기간에 따른 한식메주된장 아미노태 질소함량(mg%) 변화를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2 숙성기간에 따른 한식메주된장 아미노태 질소함량(mg%) 변화
숙성기간 아미노태질소함량(mg%)
염수분리 직후 404
1개월 561
2개월 610
3개월 654
4개월 695
5개월 724
6개월 751
비교예 1 : 전통 재래식 된장의 제조
증자대두를 냉각시키는 단계 및 실시예 2와 3에서 제조된 균주를 접종하는 단계를 제외하고는, 실시예 4에 기재된 것과 동일한 방법에 따라 전통 재래식 된장을 제조하였다. 이를 대조구로 사용하였다.
실시예 5: 증자대두 냉각여부에 따른 메주 외부의 갈라짐 정도 및 수분 감소량 비교
증자대두를 냉각하는 단계를 거치지 않고 성형한 메주와 증자대두를 송풍기를 이용하여 50~65℃ 범위로 냉각시키고 성형한 메주를 각각 제조하였다. 상기 각각 제조된 메주를 열풍건조기에서 50~65℃에서 10~24 시간 건조시켰다.
그 결과, 증자대두의 냉각 여부에 따라 메주의 외부 갈라짐 정도에 차이가 발생함을 알 수 있었다. 증자대두 냉각 후 성형한 메주의 경우 냉각 단계를 거치지 않은 메주에 비하여 갈라짐이 현저히 많고, 색상도 좀더 밝은 것을 관찰할 수 있었다. 이를 도 2에 나타내었다.
또한, 발효과정 중 증자대두를 냉각시켜 외부 갈라짐을 유도하여 성형한 메주의 수분 감소량이 큰 것을 알 수 있었으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다. 발효 과정 중 초기 한식메주 무게의 감소율을 측정한 결과, 증자대두 냉각 후 성형한 한식메주의 수분 감소율이 냉각하지 않고 성형한 대조구에 비해 무게 감소량이 많은 것을 알 수 있었다. 이는 메주 외부의 갈라짐 형성으로 내부 수분의 증발량이 많아졌기 때문에 나타난 결과이다. 메주 외부의 갈라짐 현상은 메주 내부에 공기를 유입시켜 호기적 미생물인 세균과 곰팡이의 증식에 도움을 준다. 또한, 이는 수분을 감소시켜 메주 내부의 수분 구배(water gradient)를 형성하여 외부에서는 낮은 수분함량을 요구하는 곰팡이가 증식을 하게 하고, 수분이 상대적으로 높은 메주 내부에서는 세균과 유산균의 증식을 도모하여 메주 한 덩어리에서 다양한 미생물의 복합발효가 일어나게 해 주는 효과가 있다.
실시예 6 : 바실러스 아밀로리쿼페이션스( Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27과 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG 균주 접종 여부에 따른 발효 후 품질 비교
바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27과 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG 균주의 접종여부에 따른 발효 후 한식 메주된장의 품질지표 항목인 미생물 및 pH, 단백질 분해효소역가(protease activity), 바이오제닉 아민의 한 성분인 히스타민(Histamin)의 함량을 분석하였으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3 발효 완료 후 한식메주의 성분분석결과
구분 pH 유산균(cfu/g) 단백질분해효소역가 바실러스 세레우스(cfu/g) 히스타민(ppm)
대조구(비교예 1) 6.65 1.E+02 50 3.E+02 4.49
실시예 4 5.86 9.E+08 145 2.E+01 1.75
발효 후의 한식 메주 품질분석 결과, 실시예 4에 따라 제조된 한식메주가 대조구인 비교예 1에 따라 제조된 한식메주에 비하여 pH가 낮게 측정이 되었으며, 이는 유산균의 수와도 상관관계가 있다. 즉, 이는 초기 메주 성형온도가 낮아질수록 유산균의 증식이 유도되는 것으로 분석되었으며, 단백질 분해효소 역가도 대조구인 비교예 1에 비해 2.9배 높게 분석되었다. 이는 실제 메주 내부에 곰팡이 증식이 더 많이 된 것을 관찰할 수 있었으며, 그 영향으로 판단된다.
바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 경우는 대조구와 실시예 4의 한식메주가 모두 초기에 50℃ 이상의 높은 온도에서 발효를 시작하여 온도 제어의 영향으로 증식이 일어나지 않았으며, 바이오제닉 아민의 일종인 히스타민을 측정한 결과 대조구보다 실시예 4에 따라 제조된 한식메주가 더 낮게 분석되었다. 한식메주 제조시 적용한 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 균주는 바이오제닉아민 중 특히 히스타민 생성에 관여하는 탈탄산효소 활성이 매우 낮은 균으로 보여진다.
한식 메주된장의 숙성 완료 후 품질 지표인 pH, 및 아미노태 질소 함량(mg%)을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
표 4 숙성완료 후 한식메주된장 품질평가
구분 pH 바실러스 세레우스(cfu/g) 아미노태질소함량(mg%)
대조구(비교예 1) 5.30 1.E+02 430
실시예 4 5.02 1.E+01 751
숙성완료 후 한식 메주된장의 분석결과, 실시예의 한식 메주된장이 메주를 냉각시키지 않고 겉말림 공정을 거쳐 균주를 접종하지 않고 발효한 대조구의 한식 메주된장보다 발효 완료 단계의 메주에서와 같이 pH 가 상대적으로 낮았으며, 바실러스 세레우스도 일관성 있게 적게 나오는 결과를 보였다. 또한, 아미노태 질소의 함량은 단백질 분해효소 역가가 높았던 실시예 4의 한식 메주된장이 대조구에 비해서 약 1.6배 높은 것으로 분석되었다.
실험예 1 : 본 발명에 따른 한식 메주된장의 관능 검사
비교예 1에 따라 제조된 대조구와 실시예 4에 따라 제조된 한식 메주된장의 관능평가를 진행하였다. 대상은 서울 거주 만 25~39세 기혼여성으로 가정 내 식료품 주구입자 총 70명이었으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
표 5 발명 한식메주된장과 대조구 한식메주된장의 관능 검사 결과
특성 기존 한식메주된장 본 발명 한식메주된장 유의차
평균 상위 2% 평균 상위 2%
외관 기호도 3.78 69.0 3.79 69.0 0.864
전반적인 맛 기호도 3.47 56.9 3.88 70.7 0.011
향 기호도 3.40 48.3 3.59 51.7 0.247
뒷맛 기호도 3.26 41.4 3.59 62.1 0.053
구수함 기호도 3.29 44.8 3.90 74.1 0.000
짠맛 기호도 3.05 32.8 3.52 53.4 0.002
단맛 기호도 3.07 27.6 3.38 43.1 0.019
감칠맛 기호도 3.26 37.9 3.57 50.0 0.049
구수함 강도 3.21 43.1 3.76 63.8 0.002
짠맛 강도 3.52 51.7 3.48 51.7 0.827
단맛 강도 3.09 27.6 3.21 37.9 0.341
감칠맛 강도 3.12 32.8 3.50 46.6 0.026
쓴맛 강도 2.71 25.9 2.43 12.1 0.088
이미,이취 강도 1.45 3.4 1.38 3.4 0.438
최종 선호도 32.8% 67.2% 있음
그 결과, 본 발명에 따른 한식 메주된장이 전반적인 맛에서 더 높은 선호도를 나타냈다. 특히, 된장의 가장 중요한 맛 속성인 구수함 기호도와 감칠맛 기호도가 높은 것으로 나타났으며(p<0.05), 쓴맛 강도가 약한 경향을 보여(p<0.1), 전반적인 맛 품질에 긍정적으로 작용한 것으로 생각된다. 보다 상세하게는, 실시예 4에 따른 한식 메주된장은 대조구에 비하여 '뒷맛/구수함/짠맛/단맛/감칠맛 기호도'가 좋은 것으로 나타났으며(p<0.05), 특히 구수함 기호도는 3.9 수준으로 매우 높게 평가되었다. 대조구 제품의 경우 시큼한 냄새가 나서 좋지 않다는 응답이 나타났다.
오픈 응답에서도 실시예 4에 따른 한식 메주된장은 구수함과 감칠맛이 좋은 것으로 언급되었으며, 집된장 같다는 응답이 높게 나타나(20%이상), 집된장 특유의 맛이 잘 구현된 것으로 분석되었다.
또한, 각 된장의 세부 맛속성 및 강도를 도출하기 위해 훈련된 전문패널 20명을 대상으로 묘사분석을 진행하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
두 제품의 관능적 특성 강도를 측정한 결과, '탄 향' 특성을 제외한 나머지 특성에서 제품간 통계적으로 차이가 있는 것으로 나타났다(p<0.05).
대조구 제품의 경우는 미소된장 향, 단향 특성과 단맛, 쓴맛, 탄맛, MSG 느끼, 무청삶은 향미, 미소된장 향미와 떫은, 텁텁함, 가루끼 특성, 외관의 갈색 정도, 침전물, 탁한 정도의 특성이 강하였다. 실시예 4에 따른 제품의 경우는 재래된장 향, 간장향, 메주향, 짠향, 신향, 쓴향 특성과 짠맛, 신맛, 감칠맛, 간장 향미, 메주 향미, 재래된장 향미 특성이 강한 것으로 분석되었다.
상기 결과로부터, 신규한 균주 바실러스 아밀롤리쿼파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG를 접종하고 두 균주가 잘 증식할 수 있는 메주의 물리적 구조 공정 개선 및 발효온도 최적화로 단백질 분해 효소 역가가 개선이 되었으며, 숙성기간 중 아미노태 질소함량 증가됨에 따라 대조구 대비 된장의 가장 중요한 속성인 구수함과 감칠맛이 향상 되었으며 된장 전반의 맛이 향상됨을 알 수 있었다.
[수탁번호]
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11301P
수탁일자 : 20120927
기탁기관명 : 한국미생물보존센터(국외)
수탁번호 : KCCM11317P
수탁일자 : 20121022
[규칙 제26조에 의한 보정 07.01.2014]　
Figure WO-DOC-FIGURE-114
[규칙 제26조에 의한 보정 07.01.2014]　
Figure WO-DOC-FIGURE-115

Claims (10)

  1. 전통 메주에서 분리 동정한 항균활성이 우수한 것을 특징으로 하는 바실러스 아밀로리쿼페이션스(Bacillus amyloliquefaciens) CJ 3-27(기탁번호 KCCM 11317P).
  2. 전통 메주에서 분리 동정한 단백질 분해효소(protease) 활성이 우수한 균주인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) CJ KG(기탁번호 KCCM 11301P).
  3. 대두를 선별 및 세척하고 침지하는 단계;
    상기 대두를 증자한 후 냉각시키는 단계;
    제1항의 균주를 배양하여 배양액을 제조하는 단계;
    상기 냉각대두에 상기 제1항의 균주 배양액을 접종한 후 쵸핑하는 단계;
    상기 쵸핑된 냉각대두를 성형하는 단계;
    상기 성형된 메주를 겉말림하는 단계;
    상기 제2항의 균주를 배양하여 상기 균주의 종국을 제조하는 단계;
    상기 성형된 메주에 상기 종국을 분사 접종한 후 발효하는 단계;
    상기 발효된 메주를 염지하여 염수분리하는 단계; 및
    염수분리된 된장을 숙성시키는 단계
    를 포함하는 한식메주된장을 제조하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 냉각하는 단계는 50℃ 내지 65℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 한식메주된장을 제조하는 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 제1항의 균주 배양액은 대두 원곡중량대비 0.1-5%가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 한식메주된장을 제조하는 방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 겉말림하는 단계는 50℃ 내지 65℃의 온도에서 5 내지 24시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 한식메주된장을 제조하는 방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 제2항의 균주의 종국은 대두 원곡중량대비 0.01-5%가 되도록 분사 접종하는 것을 특징으로 하는 한식메주된장을 제조하는 방법.
  8. 제3항에 있어서,
    상기 발효는 10℃ 내지 45℃의 온도 범위에서 3 내지 30일간 수행되는 것을 특징으로 하는 한식메주된장을 제조하는 방법.
  9. 제3항에 있어서,
    상기 염지는 상기 발효된 메주에 18%-25%의 염농도를 갖는 염수를 메주 중량의 1.8-2.5배로 첨가하고 10 내지 50일간 침지함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 한식메주된장을 제조하는 방법.
  10. 제3 내지 제9항 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조된 한식메주된장을 함유하는 장류제품.
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