KR100661824B1 - 락토바실러스 브레비스 opy-1 균주 및 이 균주를함유한 발효유 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(Lactobacillus brevis OPY-1), 이 균주를 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 성분이 있는 발아현미 추출액에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유 스타터(starter)로 사용하도록 함으로써 감마-아미노부티르산(GABA)이 다량 함유된 발효유 및 발효유의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주, 이 균주를 감마-아미노부티르산(GABA) 성분이 있는 발아현미 추출액에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유 스타터로 사용하도록 함으로서 감마-아미노부티르산(GABA)이 다량 함유된 발효유 및 발효유의 제조방법 제공을 목적으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주, 이 균주를 감마-아미노부티르산(GABA) 성분이 있는 발아현미 추출액에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유 스타터(starter)로 사용하도록 함으로써 감마-아미노부티르산(GABA)이 다량 함유된 발효유는 정신집중, 기억력강화 등의 효과가 있는 GABA를 고함유로 함유하고 있어 한참 공부할 시기의 어린이 및 청소년들이 정신집중, 기억력강화 등의 능력을 유지할 수 있도록 하여 학습에 도움을 줄 수 있다.
Description
도 1은 본 발명은 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주를 나타낸 사진이다.
본 발명은 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(Lactobacillus brevis OPY-1), 이 균주를 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 성분이 있는 발아현미 추출액에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유 스타터(starter)로 사용하도록 함으로써 감마-아미노부티르산(GABA)이 다량 함유된 발효유 및 발효유의 제조방법에 관한 것이다.
감마-아미노부티르산(GABA)은 억제성 신경전달물질로서 흥분억제효과, 항경련작용, 정신집중, 기억력강화 등의 기능이 있음이 알려지면서 의약품 뿐만 아니라 기능성 식품소재로서 관심이 증가하고 있다.
알콜중독자들의 혈중 GABA 농도는 정상인과 비교시 유의적으로 낮은 값을 보 인다. 따라서 체내 GABA의 농도를 높여줄 수 있는 식품을 개발함으로써 이들 질환의 예방 및 치료에 도움을 줄 수 있다.
GABA 고함유 식품과 식물 탐색 및 이들의 기능성 연구에 대한 몇몇 연구결과도 발표된 바 있다. 이러한 연구결과의 일예로서 제주도 다원에서 생산된 녹차 생엽을 채취 시기별로 혐기적으로 처리하여 GABA 및 기타 주요성분의 함량변화를 측정한 결과 GABA의 함량이 증진되는 것을 확인하였다.
현미는 싹이 날 때 각종 비타민, 칼슘, 무기질, 아미노산, 효소, 아라비노키실란, GABA 등이 증가하는 것으로 알려져 있다. 이 중에서 아라비노키실란의 함량이 증가된 곡류의 발아식품 및 그 제조방법에 있어 아라비노키실란은 열에 약하여 아라비노키실란의 효과를 나타내기 위해서는 생식이 권장되고 있다. 하지만 GABA는 비단백태 아미노산의 일종이므로 230℃ 정도의 가열에 의한 누룽지를 제조할 때에도 변성의 우려가 없어 GABA 함량이 증진된 발아곡류 및 그 추출물을 이용하여 음료 및 식품제조에 있어서 열에 약한 아라비노키실란 보다 유용하다.
발효유의 하나인 요구르트는 터키의 아나톨리아 및 발칸반도 주변의 동유럽 여러 나라에서 오래 전부터 이용하던 음료의 일종으로 현재에는 그 유용성이 널리 알려져 전세계적으로 섭취하고 있다.
발효유의 하나인 요구르트는 우유를 락토바실러스 속 또는 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 젖산균으로 발효시켜 산미와 향미를 강화시키 것으로, 주재료인 우유성분 이외에 젖산균의 대사산물인 각종 유기산(organic acid), 펩톤(peptone), 펩타이드(peptide) 및 미량의 활성물질이 함유되어 있으며, 또한 젖산 균체 및 젖산균의 장내증식에 의한 정장작용으로 식품 영양학적으로 매우 우수한 식품이다. 따라서 발효유는 장이 좋지 않은 어린이, 여성, 노인들이 특히 자주 섭취하고 있는 음료이다.
발효유의 하나인 요구르트 중 유고형분 함량과 유산균수가 많은 호상요구르트는 카제인이 발효중에 젖산이 너무 묽거나 유청이 분리되는 것을 막기 위해 수년전부터 유고형분 함량을 14∼18%로 권장하고 있다.
우리나라 유가공 업체에서는 3∼4% 정도의 탈지분유를 첨가하거나, 전지분유나 탈지우유와 같은 유제품을 농축하여 유고형분 함량을 높이고 있다. 한편 유제품 이외에도 대두단백질, 곡류, 고구마, 호박, 구기자 등의 첨가와 펙틴이나 과육을 첨가하기도 하며, 발효기질로 우유 이외에도 맥아, 옥수수, 사탕수수 등을 이용하여 새로운 젖산음료를 개발하기 위한 시도가 있으나 아직까지 만족할만한 젖산음료의 개발이 이루어지지 않고 있다.
본 발명은 우수한 기능성을 지닌 GABA를 음료 및 식품제조에 이용하기 위해 안출된 것으로서 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주, 이 균주를 감마-아미노부티르산(GABA) 성분이 있는 발아현미 추출액에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유 스타터로 사용하도록 함으로서 감마-아미노부티르산(GABA)이 다량 함유된 발효유 및 발효유의 제조방법 제공을 목적으로 한다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주, 이 균주를 감마-아미노부티 르산(GABA) 성분이 있는 발아현미 추출액에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유 스타터로 사용하도록 함으로서 감마-아미노부티르산(GABA)이 다량 함유된 발효유는 정신집중, 기억력강화 등의 효과가 있는 GABA를 고함유로 함유하고 있어 한참 공부할 시기의 어린이 및 청소년들이 정신집중, 기억력강화 등의 능력을 유지할 수 있도록 하여 학습에 도움을 줄 수 있다.
상기에서 언급한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(Lactobacillus brevis OPY-1)를 제공하며, 이 균주는 발효유 제조시 스타터로 사용할 수 있다. 보다 상세하게는 본 발명은 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주를 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유의 스타터로 사용하여 발아현미에 다량 함유되어 있는 GABA를 발효유에 함유되도록 할 수 있다.
본 발명에서 발효유는 요구르트(yogurt)와, 종래의 요구르트에 당류, 향료, 과즙, 과일가공품 등을 첨가한 플레이버 요구르트, 아이스크림 상태로 얼린 프로즌 요구르트를 포함한다.
본 발명에서 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주를 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시 스트렙토코커스 속 미생물 또는 락토바실러스 속 미생물 중에서 선택된 어느 하나 이상의 균주를 추가로 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜 배양물을 얻을 수 있다. 본 발명에서 발아현미 추출액에 접종시킬 수 있는 스트렙 토코커스 속 미생물 또는 락토바실러스 속 미생물의 일예로서 스트렙토코커스 스머필러스(streptococcus thmerphilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 사용할 수 있다.
본 발명에서 GABA가 함유된 발아현미 추출액은 종래 발아현미 추출액을 얻을 수 있는 선행기술(한국 특허출원 제2002-0035147호)로부터 발아현미 추출액을 얻을 수 있다. 또한 직접 발아현미로부터 추출액을 얻을 수 있다. 이때 발아현미로부터 추출액은 정제수, 글루탐산이 함유된 수용액, 키토산이 함유된 수용액 중에서 선택된 어느 하나의 용액에 현미를 침지시켜 상온에서 1∼5일, 보다 바람직하게는 2∼3일 동안 0.5∼7mm의 싹, 보다 바람직하게는 1∼5mm의 싹이 나도록 발아시키는 단계와, 발아한 현미를 분말화하고 수용액에 용해한 후 살균하는 단계와, 살균 후 찌꺼기를 제거하고 여과한 후 건조하는 단계와, 건조 후 건조물을 용매에 용해하여 추출하는 단계를 포함하는 방법으로부터 발아현미 추출액을 얻을 수 있다.
발아현미 추출액을 함유한 배지에 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주를 단독으로 접종시키거나 또는 스트렙토코커스 스머필러스(streptococcus thmerphilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 균주를 추가로 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜 1회 내지 수회 계대배양 하여 배양물을 얻고 이 배양물을 발효유 제조시 스타터로 사용할 수 있다.
이때 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주를 단독으로 접종시키거나 또는 스트렙토코커스 스머필러스, 락토바실러스 플란타럼 중에서 선택된 어느 하나 이상의 균주를 추가로 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시킨 후 이들 미생물의 계대 배양은 미생물을 계대배양하는 통상의 조건을 이용하여 실시할 수 있다. 이러한 계대배양의 조건의 일예로서 상기의 균주를 발아현미 추출액이 함유된 락토바실러스 MRS 배지에 접종(4%, v/v)하고, 35∼38℃에서 24∼48시간 동안 3회 계대배양할 수 있다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주는 다음과 같은 방법으로 동정하여 얻고, 이를 2004년 10월 1일 한국미생물보존센터에 KFCC-11337의 번호로 기탁하였다.
락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주 분리 방법
시중에 판매되고 발효제품(김치, 피클, 젓갈류)을 구입하여 샘플을 멸균수로 희석하였다. 상기 희석액을 GABA 고생산 유산균의 분리 및 계수를 위해 1% 펩톤수를 사용하여 10-1∼10-8 농도로 희석하고, 그 희석액 1ml를 취하여 평판계수용 아가(PCA)로 37℃에서 48시간 평판 배양하여 나타난 콜로니를 총균수로 하였다. GABA 고생산 총균수의 측정과 동일한 방법으로 MRS 브로스에 0.002% 브롬페놀블루를 첨가한 배지에 25℃에서 72시간 상기 샘플희석액을 배양하여 나타난 콜로니를 관찰하고, 환이 없고 짙은 청색을 띄는 것을 류코노스톡(Leuconostoc)으로 계수하였고 환이 있거나 청색 또는 흰색을 띄는 콜로니를 락토바실러스로 구분하여 계수하였다. m-엔테로코커스 아가(Difco)를 사용하여 백색의 콜로니는 페지오코커스로, 적색은 스트렙토코커스로, 핑크색은 에어로코커스로 계수하였다. 이상의 작업은 3회 반복 하여 평균치를 구하였다. 효모는 효모-몰트 추출아가(YM)를 사용하여 락토바실러스와 동일한 방법으로 계수하였다. 한편 도 1에 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주의 사진을 나타내었다.
상기 선별된 균주들은 1차적으로 TLC를 이용하여 균주의 GABA 생산성 유무를 측정하였다. TLC 조건은 용매=부탄올:아세트산:물=4:1:1로 하여 용매를 준비하였으며, 닌히드린 염색법을 이용하여 염색하여 확인하였다. 표준시약은 시그마 표준품을 사용하였으며, TLC의 전개시간은 대략 30분 정도로 하였다. TLC를 이용한 1차 선별실험결과의 콜로니에서 GABA를 생성하는 것으로 확인된 샘플은 2차 선별용 샘플로서 준비하였다.
상기 과정을 통해 1차 선별된 균주를 다시 MSG를 각각 1%, 3%, 5% 처리하여 아미노산 자동분석기를 이용하여 GABA 함량을 측정하였다. GABA의 형광유도체화를 위해 AccQ Fluor 시약을 사용하였으며, 이들 유도체의 분리를 위해 AccQ Tag 칼럼을 사용하였다. GABA 분석에 있어서의 최종시료는 아미노산 자동분석에 필요한 시료의 순도를 감안하여 0.45㎛ PVDF 필터(Millipore)를 이용하여 여과한 후 분석에 사용하였다.
균주 동정방법
GABA 고생산성 균주의 동정을 위하여 형태학적, 생화학적 특성을 "Bergey's Manual of Determinative bacteriology"에 따라 조사하였다. 최적 생육온도, 그람 염색, 운동성, 카탈라아제 테스트, CO2 생성 유무 및 당을 발효하여 여러 가지 유기산들을 생성하는 것은 API 50-CHL 키트(BioMerieux, France)를 사용하여 조사하고 그 결과를 아래의 표 1에 나타내었다.
<표 1>
선발균주 | |
세포의 그람염색 | 그람양성균주 |
형태 | 간균 |
포자생성 | - |
포도당 배지에서의 가스생성능 | CO2 생성 |
카탈라아제 생성능 | + |
15℃에서 생장능력 | + |
45℃에서 생장능력 | - |
미생물 크기(㎛) | 1.0-1.5㎛ |
최종적인 동정을 위하여 분리균의 16s DNA 서열을 결정하여 알려진 균주들과 비교하였다. PCR용 프라이머들은 바오이넥스(Bionex)에서 제작한 것으로 27 F : 5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 1392 R : 5'-ACGGGCGGTGTGTRC-3'을 사용하였다.
균주 동정을 위한 16s rDNA 염기서열은 다음 과정을 통해 조사되었다. 배지는 MRS 브로스(Difco)를 사용하였고 락토바실러스와 웨이슬레나(Weissella) 속 균주는 37℃, 류코노스톡속 균주와 김치 젖산균 WL6는 30℃에서 배양하였으며, PCR용 Genomic DNA는 퓨어진 키트(Puregene kit, Gentra System, Inc.)를 사용하여 추출하였다.
PCR 기기는 바오오메트라(Biometra)제(tampa, Florida USA)를 사용하였고, Taq DNA 중합효소는 프로메가(Promega)(Madison, Wisconsin, USA)제를 사용하였고, 기타 시약은 특급의 제품을 구매하여 사용하였다.
PCR 방법은 Biometra제(tampa, Florida USA)를 사용하였고, 락토바실러스 브레비스 OPY-1 16S rDNA 세트(27 F, 1392 R)는 변성 단계를 95℃에서 5분 실시하였고, 증폭 단계를 35 사이클(95℃ 30초, 43℃ 30초, 72℃ 1분 30초)로 하였으며, 연장 단계를 72℃에서 10분으로 하였다. 증폭된 DNA는 1%(w/v) 아가로오즈 젤에 전개하였으며, 분자량 DNA 마커는 λDNA를 EcoRⅠ(Promega)으로 절단한 것을 사용하였다.
분자계통학적 염기서열 검색을 사용한 미생물 동정 결과 분리 균주의 16s rDNA 염기서열은 Lactobacillus brevis strain RO97 16S ribosomal RNA(Acess No. AF515219)와 99% 상동성을 보였으며, Lactobacillus brevis strain RO66 16S ribosomal RNA(Acess No. AF515220.)와 99% 상동성을 보였다. 따라서 상기 미생물 동정 결과 분리 균주는 락토바실러스 브레비스로 동정되어 이를 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주로 명명하였다(염기서열 참조).
락토바실러스 브레비스 OPY-1을 이용한 GABA 생산능 측정
GABA 함량측정 및 분석방법은 HPLC를 이용한 GABA분석에 준하여 실험을 실행하였으며, MSG 5% 처리하였을 때 본 발명에 따른 균주와 공지의 균주를 비교실험한 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
<표 2>
균주 | GABA함량(nmol/㎖) |
Lactobacillus OPY-1 | 8003.28 |
Lactobacillus plantarum kctc3103 | 30.09 |
Lactobacillus brevis kctc 41028 | 2.09 |
Lactobacillus brevis kctc 41029 | 5.15 |
한편 본 발명은 상기 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주를 스타터로 하는 발효유 제조방법을 포함한다.
본 발명의 발효유 제조방법은 발아현미 추출액을 포함하는 발효유 제조에 있어서, 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주를 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜 배양시킨 배양물을 스타터로 사용하는 단계를 포함한다. 이때 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주 이외에 스트렙토코커스 스머필러스, 락토바실러스 플란타럼 중에서 선택된 어느 하나 이상의 균주를 추가로 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜서 배양물을 얻고 이 배양물을 스타터로 사용할 수 있다.
이하 본 발명의 내용을 실시예 및 시험예를 통하여 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들은 본 발명을 보다 상세하게 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 발아현미 추출액 제조
현미를 5mM 글루탐산 수용액에 침지시켜 25℃에서 3일 동안 3∼3.5mm의 싹이 나도록 발아시켰다. 현미를 5mM 글루탐산 수용액에 침지시 12시간마다 5mM 글루탐산 수용액을 교환하였다.
발아한 현미를 분말화하고 수용액에 용해한 후 120℃ 및 1.5atm에서 고압살균한 다음 거즈로 1차 여과하여 찌꺼기를 제거하고 재차 여과지로 2차 여과하여 여 과액을 동결건조 후 증류수로 용해하여 발아현미 추출액을 얻었다.
<실시예 2> 스타터 제조
상기 실시예 1에서 제조한 발아현미 추출액(락토바실러스 MRS 배지 중량 대비 5%)을 락토바실러스 MRS 배지에 첨가하여 혼합하였다.
그런 다음 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(KFCC-11337), 스트렙토코커스 스머필러스 및 락토바실러스 플란타럼이 1:1:1의 비(v/v)로 혼합한 혼합균주를 발아현미 추출액이 함유된 락토바실러스 MRS 배지에 접종(4%, v/v)하고, 37℃에서 24시간 동안 3회 계대배양하여 발효유 제조시 사용하는 스타터를 제조하였다.
<실시예 3> 요구르트 제조
기질로서 전지우유 18%, 탈지분유 2%와 발아현미 추출액 1리터(L)을 첨가하고 혼합기(Waring blender)로 5분간 균질화 시킨 후 121℃에서 20분간 살균하였다.
살균한 기질을 37℃로 방냉한 후 기질에 젖산균주로서 상기 실시예 2에서 제조한 스타터를 접종(4%, v/v)하고 37℃에서 24동안 발효시켜 요구르트를 제조하였다.
<시험예>
상기 실시예 3에서 얻은 요구르트와 대조구로서 시중에 시판중인 요구르트에 대해 GABA 함량을 측정하고 그 결과를 아래의 표 1에 정리하여 나타내었다.
표 1. GABA 함량 측정
항목 | 실시예 3 | 대조구 1 | 대조구 2 | 대조구 3 |
GABA 함량 (ug/g F.W) | 137.17 | 1.29 | 1.33 | 0 |
*대조구1: GUT, 대조구2: 불가리스, 대조구3: 닥터캡슐,
상기에서 실시예 및 대조구의 GABA 함량은 다음과 같은 방법을 이용하여 측정하였다.
GABA의 형광 유도체화를 위해 AccQ Fluor Reagent를 사용하였으며, 이들 유도체 분리를 위하여 AccQ Tag column을 사용하였다.
GABA 분석에 있어서의 민감한(sensitve) 점을 감안하여 사용되는 모든 샘플(sample)은 0.45㎛ PVDF 필터(Millipore)를 이용하여 여과 분석하였다.
GABA 측정 방법은 샘플 중의 GABA 함량을 측정하기 위해 저온(-70℃) 보관된 샘플로부터 유기용매 혼합액을(메탄올:클로로포름:3차증류수=12:5:3) 가하여 섞어준 다음 GABA을 포함하는 수용액 층은 4℃에서 12000 ×g, 15분 동안 원심분리하여 얻었다. 원림분리하여 얻은 액을 재차 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 그 준비한 상등액을 동결건조한 후 물로 녹여준 후 0.45㎛ PVDF 필터로 여과하여 분석에 사용하였다.
GABA의 형광 유도체화를 위하여 AccQ Tag Reagent를 사용하였으며, 이들 유도체 분리를 위해 3.9mm ×150mm AccQ Tag TM(Nova-PakTM C18,Waters) 칼럼(column)을 사용하였다. GABA 함량은 표준 아미노산의 결과와 비교하여 산출하였다.
본 발명의 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(Lactobacillus brevis OPY-1), 이 균주를 감마-아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 성분이 있는 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜 배양시킨 배양물을 발효유 스타터(starter)로 사용하도록 함으로서 감마-아미노부티르산(GABA)이 다량 함유된 발효유는 정신집중, 기억력강화 등의 효과가 있는 GABA를 고함유로 함유하고 있어 한참 공부할 시기의 어린이 및 청소년들이 정신집중, 기억력강화 등의 능력을 강화할 수 있도록 하여 학습에 도움을 줄 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술 분야의 숙련된 당업자라면 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
서열목록 전자파일 첨부
Claims (6)
- 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(KFCC-11337).
- 락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(KFCC-11337)를 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜 배양시킨 배양물을 함유한 발효유.
- 제2항에 있어서, 스트렙토코커스 스머필러스(streptococcus thmerphilus), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) 중에서 선택된 어느 하나 이상의 균주를 추가로 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시킴을 특징으로 하는 발효유.
- 발효유 제조에 있어서,락토바실러스 브레비스 OPY-1 균주(KFCC-11337)를 발아현미 추출액이 함유된 배지에 접종시켜 배양시킨 배양물을 스타터로 사용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 발효유의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 스트렙토코커스 스머필러스, 락토바실러스 플란타럼 중에서 선택된 어느 하나 이상의 균주를 추가로 발아현미 추출액에 접종시킴을 특징으로 하는 발효유의 제조방법.
- 제4항에 있어서, 발아현미 추출액이 발효유의 원료에 포함됨을 특징으로 하는 발효유의 제조방법.
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