KR101867952B1 - 바실러스 세레우스에 대한 항균활성 및 바이오제닉 아민 저감화 효과가 우수한 저영양성 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 hj5-2 및 이를 포함한 조성물 - Google Patents

바실러스 세레우스에 대한 항균활성 및 바이오제닉 아민 저감화 효과가 우수한 저영양성 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 hj5-2 및 이를 포함한 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 전통장류 유래 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주 또는 이의 배양액은 전통 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 분해활성이 우수하므로, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주 및 이의 배양액은 발효식품 제조용 미생물 제제, 발효 식품의 스타터, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 세레우스에 대한 항균활성 및 바이오제닉 아민 저감화 효과가 우수한 저영양성 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 및 이를 포함한 조성물{Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2 oligotrophic strain with anti Bacillus cereus activity and reduction of biogenic amine and compositions thereof}
본 발명은 장류 유래 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 항균활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 저감화 효과가 우수한 저영양성 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주 및 이를 이용한 발효소재에 관한 것이다.
한국의 장류 식품인 청국장, 된장 및 간장은 우리 조상으로부터 수백 년 동안 섭취해온 음식으로서 특별한 부작용이 없는 식품이며, 항산화 효과, 혈전 용해 효과, 혈압강하 효과 등을 유발하는 각종 유익한 생리활성 물질들이 포함된 것으로 알려져 있다. 장류는 한국인의 식탁에 필수적인 부식으로서 식품으로 안전성 확보는 무엇보다도 중요한 과제이다. 장류의 발효과정에서 식품 안전을 좌우하는 3가지 주요 인자는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 그룹이 생산하는 장 및 구토 독소, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)나 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)가 생산하는 아플라톡신(aflatoxin), 발효 미생물들에 의해 생산되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)이 있다(Shalaby, A. R., 1996 Food Research Int. 29, 675-690).
전통 방식에 의해 제조하는 장류는 필연적으로 자연환경에 노출되는 상태로 발효가 이루어지기 때문에 발효나 숙성과정 동안 토양이나 대기의 유해 미생물들에 의해 독소가 생성될 가능성이 높다. 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup)에 속하는 바실러스 마이코이드(Bacillus mycoides), 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 중온성, 그람양성, 호기성, 내염성 및 내열성 균으로, HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 및 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한 식품에 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 균이 오염 및 증식하여 독소(cereulide)를 생산하며, 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.
바실러스(Bacillus)의 감염량은 환자의 면역상태에 따라 다르나 다른 식중독균에 비해 매우 높기 때문에 정성보다는 정량이 우선시 되어 세계 각국은 바실러스(Bacillus)에 대한 정량 기준을 가지고있다. 한국에서도 바실러스(Bacillus)의 정량기준이 있어서 분유나 유아용 식품 등에서는 100 CFU(colony forming unit)/g이하, 무순이나 샐러드 등에서는 1000 CFU(colony forming unit)/g 이하, 된장 및 고춧가루 등의 조미식품에서는 10000 CFU(colony forming unit)/g 이하의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 기준을 가지고 있다.
바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다. 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 유리아미노산에 미생물의 아미노산 디카복실라제(amino acid decarboxylase)가 작용하여 아민(amine) 형태로 변형되면서 생성되며 세균에서는 아크로모나스(Acromonas), 바실러스(Bacillus), 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 크렙시엘라(Klebsiela), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 프로테우스(Proteus) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속 등이 아미노산 디카복실라제(amino acid decarboxylase)를 가지는 것으로 알려져있다(Taylor et al., 1983 Mar. Fish. Rev. 45, 35-39).
대표적인 바이오제닉 아민(biogenic amine)으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 인체의 생리 기능을 유지하기 위한 필수 물질로, 체내에서 신경전달 물질로 직·간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 상기와 같은 효과를 가지는 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 체내에서 미량이 대사 과정을 통해 균형을 이루고 있지만 식품에서 과량 섭취시에는 독성을 나타낸다. 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine)의 과잉 섭취는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등을 유발하며, 티라민(tyramine)은 혈압 상승, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비 촉진, 타액의 과다분비 및 편두통을 유발하고, 카다베린(cadaverine)과 퓨트레신(putrescine)은 장에서 강력한 발암물질인 니트로사민(nitrosamines), 니트로소피페리딘(nitrosopiperidine) 및 니트로소피롤리딘(nitrosopyrrolidine)을 생성할 수 있다. 이런 바이오제닉 아민의 위해성 때문에 유럽연합(EU)은 2008년부터 2011년까지 치즈, 포도주, 소시지 등의 유럽 전통 발효 식품들을 대상으로 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 감소시키기 위한 프로젝트를 수행하였다.
단백질 함량이 높은 콩, 프로테아제(proteases) 활성이 높은 바실러스(Bacillus) 및 아스퍼질러스(Aspergillus)속에 의한 발효, 미혐기적 환경 및 적당한 발효 온도를 고려할 때, 장류는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하기 적당한 환경이라고 할 수 있다. 실제로 2006년 국내 유통 발효 식품 중에 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분포를 조사한 결과에 따르면 전통 된장의 퓨트레신(putrescine) 함량은 99.6~1453.7(평균 462.6)mg/kg, 히스타민(histamine)은 260.1~952(평균 569.4)mg/kg, 티라민(tyramine)은 284.7~1430.7(평균 669.5)mg/kg으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았고, 그 다음으로 멸치 젓갈, 현대식 간장, 재래식 간장, 현대식 된장 순이었다. 한국인 식단 중 바이오제닉 아민(biogenic amine) 함량이 가장 높은 식품 7종 중 4종이 장류이고, 식단 특성상 장류 사용량이 젓갈보다 더 많다는 것을 고려하면, 장류는 식품 섭취 시 바이오제닉 아민(biogenic amine)의 주 공급원으로 건강에 위해를 줄 수 있는 수준임을 나타낸다. 앞으로 전통 장류는 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들에 대한 항균활성이 있으며, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 저감화를 통한 식품 안전성을 동시에 확보할 수 있는 균주의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 KFDA에 GRAS (generally recognized as safe) 균주로서, 장류의 제조에 허용될 수 있는 저영양성 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 전통 장류로부터 분리하고, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주가 전통 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 분해활성이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 전통 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 분해활성이 우수한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 분해활성이 우수한 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 발효 식품의 스타터(starter)를 제공한다.
아울러, 본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 식품조성물을 제공한다.
본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주 또는 이의 배양액은 전통 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 분해활성이 우수하므로, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주 및 이의 배양액은 발효 식품의 스타터, 식품 조성물 등의 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 주사전자현미경(SEM)으로 관찰한 도이다.
도 2는 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866(Bacillus amyloliquefaciens KACC 15866) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주 배양엑에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 생존율을 나타낸 도이다.
도 3은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 바실러스 세레우스 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC의 전사량을 나타낸 도이다.
도 4는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 바실러스 세레우스 생육 관련 단백질인 AtpB 단백질 발현량을 나타낸 도이다.
도 5는 콩발효물에 균주를 접종하여 콩발효물의 외관을 비교한 도이다:
NT: 균주를 접종하지 않은 콩발효물;
B.cereus: 바실러스 세레우스 KACC10004 균주를 접종한 콩발효물; 및
B.amyloliquefaciens HJ5-2: 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 접종한 콩발효물.
도 6은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 접종한 콩발효물에서 바실러스 세레우스의 생존율을 나타낸 도이다.
도 7은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 접종한 콩발효물에서 바실러스 세레우스 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC의 전사량을 나타낸 도이다.
도 8은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 접종한 콩발효물에서 바실러스 세레우스 생육 관련 단백질인 AtpB 단백질 발현량을 나타낸 도이다.
도 9는 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 바이오제닉 아민 생성 관련 유전자인 hdc, tdc, yobN 유전자의 전사량을 나타낸 도이다.
도 10은 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 히스타민 H3 수용체(histamine H3 receptor)와 히스티딘 탈탄산효소(histidine decarboxylase)의 발현량을 나타낸 도이다.
도 11은 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine) 생성량을 ELISA 어세이를 수행하여 나타낸 도이다.
도 12는 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine) 생성량을 UPLC 분석을 수행하여 나타낸 도이다. 세번 반복 실험하고, 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test, p<0.05)으로 검정하여, 각각의 값을 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 같은 열에 있는 a부터 d는 일원분산분석(one-way ANOVA) 및 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)으로 검정하였을 때, p<0.05 이하를 나타내어 유의성 있는 차이를 나타냄을 의미한다.
도 13은 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine) 분해율을 UPLC 분석을 수행하여 나타낸 도이다. 분해율은 바이오제닉 아민 생성균주인 대조구 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주와 비교하여 나타내었다. 세번 반복 실험하고, 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test, p<0.05)으로 검정하여, 각각의 값을 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었고, 같은 열에 있는 a부터 d는 일원분산분석(one-way ANOVA) 및 던컨의 다중검정(Duncan's multiple range test)으로 검정하였을 때, p<0.05 이하를 나타내어 유의성 있는 차이를 나타냄을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) HJ5-2 균주를 제공한다.
상기 균주는 수탁번호(81027BP)로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주인 것이 바람직하다.
본 발명의 구체적인 실시 예에서, 본 발명자들은 콩과메밀을 주재료로 자연발효로 제조된 장류로부터 시료를 채취하고, 다양한 저영양 세균들을 R2A 평판배지에서 배양하였다. 자라나는 균주 중 서로 다른 콜로니를 분리하여 3회 계대배양 한 한 후, 16S rRNA의 유니버설 프라이머(universal primer)인 서열번호 1의 염기서열을 갖는 27F 프라이머(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 1492R 프라이머(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 분석하였다(SolGent co., LTD, Daejeon, Korea). 그 결과를 NCBI 젠뱅크(Genebank) 데이터베이스 (database)의 염기서열과 비교하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(99.9% 일치)임을 확인하었고, 주사전자현미경(SEM)을 통해 상기 균주는 전형적인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스의 모습을 가지고 있음을 확인하였다(도 1 참조). 또한, 상기 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 속 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2로 명명하고 2016년 10월 7일 농업유전자원정보센터에 기탁하였다(수탁번호 81027BP).
상기, 수탁번호(81027BP)로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 가지는 것을 특징으로 하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2와 바실러스 세레우스를 혼합배양한 실험군에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2에 농도의존적으로 바실러스 세레우스가 저해되는 것을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 있음을 확인하였다(도 2 참조).
또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주가 농도 의존적으로 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC의 전사량을 더 많이 감소시킴을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 3 참조).
또한, 본 발명자들은 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866에 비해 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주가 농도 의존적으로 바실러스 세레우스 생육 관련 단백질인 AtpB 단백질의 발현량을 더 많이 감소시킴을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 접종한 콩발효물에서 균주를 접종하지 않은 콩발효물보다 인체에 유효한 점진물(polyglutamate; PGA)이 많이 생성됨을 확인하였다(도 5 참조).
또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2를 단독 또는 바실러스 세레우스 균주와 혼합배양하여 접종한 콩발효물에서 바실러스 세레우스가 검출되지 않음을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 있음을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 단독 또는 바실러스 세레우스 균주와 혼합배양하여 접종한 콩발효물에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC 유전자가 전사되지 않음을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 7 참조).
또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 단독 또는 바실러스 세레우스 균주와 혼합배양하여 접종한 콩발효물에서 바실러스 세레우스 생육 관련 단백질인 AtpB 단백질이 발현되지 않음을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 8 참조).
상기, 수탁번호(81027BP)로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해활성을 가지는 것을 특징으로 한다. 상기 바이오제닉 아민은 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 세로토닌(serotonin)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 바이오제닉 아민인 것이 바람직하며, 히스타민 또는 티라민인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 배양한 실험군에서 탈탄산효소(decarboxylase) 유전자인 tdc 및 hdc 유전자가 전사되지 않으며, 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주를 배양한 실험군에 비해 아민 산화효소(amine oxidase) 유전자인 yobN가 더 많이 전사됨을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민 생성 저해효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 9 참조).
또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 배양한 실험군에서 히스티딘 탈탄산효소(histidine decarboxylase) 단백질이 발현되지 않으며, 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주를 배양한 실험군에 비해 히스타민 H3 수용체(histamine H3 receptor) 단백질이 더 낮게 발현됨을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민인 히스타민의 생성 저해효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 10 참조).
또한, 본 발명자들은 ELISA 어세이를 통해 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주가 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주에 비해 바이오제닉 아민인 히스타민 및 티라민 생성량이 적음을 확인하였다(도 11 참조).
또한, 본 발명자들은 UPLC(Ultra performance liquid chromatography) 분석을 통해 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주가 히스타민을 생성하지 않으며, 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주에 비해 히스타민 및 티라민 생성량이 적음을 확인하였다(도 12 참조).
아울러, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주가 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주보다 바이오제닉 아민인 히스타민 및 티라민 분해능이 뛰어남을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민 저감화 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 13 참조).
따라서, 본 발명의 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주 또는 이의 배양액은 전통 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 분해활성이 우수하므로, 상기 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주 및 이의 배양액은 발효 식품의 스타터, 식품 조성물 등의 첨가제로 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 수탁번호(81027BP)로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 발효식품 제조용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 조성물은 통상적인 미생물 제제 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주, 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.
담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesiumstearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 수탁번호(81027BP)로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주, 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법을 제공한다.
참고로 본 발명에서 용어 “스타터(starter)"란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말한다.
상기 발효식품은 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식품인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 본 발명은 수탁번호(81027BP)로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주, 또는 이의 배양액을 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 제어방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 수탁번호(81027BP)로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주, 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
저영양 배지를 이용한 균주의 선별
균주를 분리하기 위해 콩과 메밀을 주재료로 자연발효로 제조된 장류 시료를 채취하고, 시료 10g을 멸균백에 넣고 0.85% 생리식염수 100㎖를 가하여 BAGMIXER (interscience, France)를 사용하여 10분 동안 균질화하여 검체를 준비하였다. 저영양 배지는 0.5g 효모 추출물, 0.5g 프로테오스 펩톤(proteose peptone), 0.5g 카사미노산(casamino acids), 0.5g 덱스트로스(dextrose), 0.5g 가용성 전분(soluble starch), 0.3g 피루빈산나트륨(sodium pyruvate), 0.3g 제2인산 칼륨(dipotassium phosphate), 0.05g 황산마그네슘(Magnesium sulfate), 1000㎖ 증류수를 포함하며 pH 7.0~7.2로 조정하여 준비하였다. 저영양세균분리 배지인 R2A에 10-1, 10-2, 10- 3및 10-4배로 증류수에 희석한 배지를 사용하여 분리한 다양한 저영양 세균들을 R2A 평판배지에서 배양한 후 자라나는 균주를 분리하였다. 자라나는 균주 중 서로 다른 콜로니를 분리하여 3회 계대배양 한 후, 단일 콜로니를 순수배양하여 전분분해력, 단백질분해력 등 발효관련 효소활성 및 식중독유발균에 대한 항균활성이 우수한 균주를 1차로 선별한 후, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 저해 및 바이오제닉 아민(biogenic amine) 저감 가능 보유 후보 균주로 사용하였다.
균주의 동정
상기 <실시예 1>에서 선별한 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자 염기서열 분석을 수행하였다.
구체적으로, 16S rRNA의 유니버설 프라이머(universal primer)인 서열번호 1의 염기서열을 갖는 27F 프라이머(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 1492R 프라이머(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 분리 균의 16S rDNA 유전자 단편을 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭시켰다. PCR 산물의 염기서열은 Solutions for Generic Technologies (Solgent)사에 의뢰하여 분석하였다. 계통수(Phylogenetic tree) 작성은 분석한 염기서열과 Lasergene사의 DNA STAR pro software (SeqMan Pro)와 The National Center for Biotechnology Information (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)에서 제공하는 Advanced blast search 프로그램을 통하여 젠뱅크(GenBank)에 보고된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866 균주와의 염기서열을 비교하여 계통분류학적 유연관계를 분석한 후, MEGA v4.0을 이용하여 Tamura-Nei distance model 과 neighbor-joining method(Saitou, N., and M. Nei. (1987) Mol.Biol.Evol4:406-425)에 의해 계통도를 작성하였다.
그 결과, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스와 99.9%의 16S rRNA 상동성을 나타내는 신규한 균주임을 확인하였다, 또한, 상기 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주로 명명하고 2016년 10월 7일자로 농업유전자원정보센터에 수탁번호(81027BP)로서 기탁하였다.
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 확인
상기 <실시예 2>에서 동정한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 확인하기 위하여, 주사전자현미경(SEM)으로 관찰하였다.
구체적으로, LB배지(Luria-Bertani broth)에서 24시간 동안 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 배양한 후, Karnovskt 고정용액으로 4℃에서 24시간 동안 고정시켜주었다. 24시간 후, pH 7.2인 0.05M의 카코딜산 버퍼(cacodylate buffer)로 10분씩 3회 반복하여 세척하고, 고정된 샘플을 1% 오스뮴산(osmic acid)으로 4℃에서 2시간 동안 고정시켜주었다. 2시간 후, 물로 10분씩 3회 반복하여 세척하고, 샘플을 50%, 75%, 90%, 95%, 100% 에탄올을 이용하여 각각 30분씩 탈수(dehydrate)시켜 주고, 샘플을 상온에서 100% 아세트산아밀(amyl acetate) 용액에 30분씩 2회 통과시켜주었다. 샘플을 건조하고 금으로 코팅시킨 후, 20kV의 전압을 가속하여 주사전자현미경((Hitachi S-2460N; Hitachi. Ltd., Tokyo, Japan)으로 관찰하였다.
그 결과 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 모양이 전형적인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스의 모습임을 확인하였다(도 1).
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균활성 측정
상기 <실시예 2>로부터 동정한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<4-1> 바실러스 세레우스의 생존율 측정
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 저해 효과를 확인하기 위하여, 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866(Bacillus amyloliquefaciens KACC 15866), 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004) 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2), 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004)를 혼합배양하여 하기와 같은 방법으로 바실러스 세레우스의 생존율을 측정하였다.
구체적으로, 바실러스 세레우스 균주 0.5%와 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주 0.125, 0.25, 0.5%를 LB배지(Luria-Bertani broth) 5㎖에 혼합 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후, 멸균 생리식염수(saline solution)에 상기 배양한 균주를 10진 희석법으로 10단계 희석한 다음, 희석액을 바실러스 세레우스 선택배지(CHROMagar)에 분주하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 바실러스 세레우스 균수를 계수하여 바실러스 세레우스의 생존율을 측정하였다.
그 결과, 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866을 혼합배양한 모든 실험군의 바실러스 세레우스 생존율은 높은 반면, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2를 혼합배양한 실험군에서는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2에 농도의존적으로 바실러스 세레우스가 저해되는 것을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 있음을 확인하였다(도 2).
<4-2> 바실러스 세레우스 타겟 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA , nheC의 전사량 확인
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC에 대한 전사량을 확인하기 위하여, 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866(Bacillus amyloliquefaciens KACC 15866), 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2)균주를 혼합배양하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, Qiagen의 RNeasy plus mini 키트를 이용하여 제조사의 방법에 따라 바실러스 세레우스 KACC10004와 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866을 혼합 배양한 배양액에서 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA 1㎍을 주형(template)으로 하여 GenDEPOT사의 amfiRivert Platinum cDNA synthesis Master Mix를 사용해 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 상기의 방법으로 합성한 cDNA와 GenDEPOT사의 amfiEco Taq DNA polymerase 및 하기 <표 1>에 있는 프라이머를 이용하여 하기 <표 2>의 조건으로 RT-PCR(reverse transcription-PCR)을 수행하여, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC의 전사량을 확인하였다. 또한 Bio-Rad사의 iQ™ SYBR® Green Supermix 5㎕, 하기 <표 1>에 있는 프라이머 200nM, cDNA 2㎕를 사용하여 총 10㎕가 되도록 각각의 샘플을 준비하고, 하기 <표 3>의 조건으로 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System을 이용해 qPCR(quantitative Real-time PCR)을 수행하고, 신호(signal)를 수치화하여 정량적으로 비교 분석하였다.
그 결과, 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866에 비해 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 농도 의존적으로 groEL, nheA, nheC 유전자의 전사량을 더 많이 감소시킴을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 3).
바실러스 세레우스(Bacillus cereus) groEL, nheA, nheC 유전자의 전사량을 확인하기 위한 RT-PCR 및 qPCR에 사용한 프라이머 서열목록
프라이머 서열(5'→3')
groEL-L(서열번호 3) 5'-TGCAACTGTATTAGCACAAGCT-3'
groEL-R(서열번호 4) 5'-TTACCAACGCGCTCCATTGCTT-3'
nheA-L(서열번호 5) 5'-GTTAGGATCACAATCACCGC-3'
nheA-R(서열번호 6) 5'-ACGAATGTAATTTGAGTCGC-3'
nheC-L(서열번호 7) 5'-TGGATTCCAAGATGTAACG-3'
nheC-R(서열번호 8) 5'-ATTACGACTTCTGCTTGTGC-3
16srRNA-L(서열번호 9) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16srRNA-R(서열번호 10) 5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'
바실러스 세레우스(Bacillus cereus) groEL, nheA, nheC 유전자의 전사량을 확인하기 위한 RT-PCR의 조건
단계 온도 시간 사이클수
초기변성(initial denaturation) 및 효소 활성(enzyme activation) 95℃ 3분 1
변성(denaturing) 95℃ 15초
33
결합(annealing) 55℃ 30초
증폭(extension) 72℃ 30초
바실러스 세레우스(Bacillus cereus) groEL, nheA, nheC 유전자의 전사량을 확인하기 위한 qPCR의 조건
단계 온도 시간 사이클수
초기변성(initial denaturation) 및 효소 활성(enzyme activation) 95℃ 3분 1
변성(denaturing) 95℃ 15초
40
결합(annealing) 55℃ 30초
증폭(extension) 72℃ 30초
melt curve 72℃ 30초 1
<4-3> 바실러스 세레우스 생육 관련 단백질인 AtpB의 발현량 확인
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 생육 관련 단백질인 AtpB의 발현량을 확인하기 위하여, 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866(Bacillus amyloliquefaciens KACC 15866), 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 혼합배양하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 바실러스 세레우스 KACC10004와 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866을 혼합 배양한 배양액을 10,000g로 5분간 원심분리하여 얻은 펠릿(pellet)에 30㎕의 SDS 샘플 버퍼(SDS sample buffer)를 넣고 10분간 100℃에서 변성(denaturation)시킨 후에 12% SDS 폴리아크릴아마이드겔(SDS polyacrylamide gel)에 전기영동 한 후, 겔(gel)을 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 막(membrane)을 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin)으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하고 1시간 후, 항-AtpB 1차 항체(affinity purified rabbit anti-AtpB first antibody; Agrisera, Vannas, Sweden)를 막(membrane)에 넣어 1시간 동안 반응시켜주었다. 1시간 후, TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 용액으로 10분 간격으로 3회 막(membrnae)을 세척한 후, HRP가 결합된 IgG 2차 항체(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated goat IgG secondary antibody; Bio-Rad, Berkeley, California, USA)를 막(membrane)에 넣어 1시간 동안 반응시켜주었다. 1시간 후, TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 용액으로 10분 간격으로 3회 막(membrane)을 세척한 후, BM 화학발광 블롯팅 기질(BM chemiluminescence blotting substrate(POD); Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 X-ray 필름에 감광 후, 현상하여 AtpB 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 참고(reference) 균주인 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866에 비해 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 농도 의존적으로 AtpB 단백질의 발현량을 더 많이 감소시킴을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 4).
콩발효물에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 바실러스 세레우스에 대한 항균활성 측정
콩발효물에서 상기 <실시예 2>로부터 동정한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균활성을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<5-1> 콩발효물의 외관 비교
균주를 접종하지 않은 콩발효물을 대조군으로 하여, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주와 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004) 균주를 콩발효물에 접종하여 콩발효물의 외관을 비교하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 접종한 콩발효물의 외관은 균주를 접종하지 않은 콩발효물보다 인체에 유효한 점진물(polyglutamate; PGA)이 많이 생겼으며, 바실러스 세레우스 균주를 접종한 콩발효물의 외관은 인체에 유효한 점진물(polyglutamate; PGA)이 전혀 생기지 않았고, 쾌쾌한 이취가 많이 생성됨을 확인하였다(도 5).
<5-2> 콩발효물에서 바실러스 세레우스의 생존율 측정
콩발효물에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 저해 효과를 확인하기 위하여, 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 콩에 접종하고 발효하여 하기와 같은 방법으로 바실러스 세레우스의 생존율을 측정하였다.
구체적으로, 500g의 콩을 씻어서 상온에서 16시간 물에 담궈 두었다. 16시간 후, 물에서 콩을 건져 100℃에서 3시간 동안 찌고, 40℃ 이하에서 식혀주었다. 콩을 식힌 후, 콩의 표면에 1%(v/w)(105CFU/g)의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주와 바실러스 세레우스 균주를 9:1의 비율로 섞은 접종원(inoculum)과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주와 바실러스 세레우스 균주를 5:5의 비율로 섞은 접종원(inoculum)을 접종시켜주었다. 균주가 접종된 콩을 35℃에서 36시간 동안 발효시킨 후, 50g의 발효된 콩을 450ml의 멸균 생리식염수(sterile saline)에 넣어 15분 동안 흔들어주고, No2. 와트만 필터 페이퍼(No. 2 whatman filter paper)를 통해 여과시켜 주었다. 여과된 추출물을 8000g로 10분 동안 원심분리시키고, 잔류물을 1ml의 멸균 생리식염수(sterile saline solution)에 녹여준 후, 멸균 생리식염수(saline solution)에 상기 잔류물을 10진 희석법으로 10단계 희석한 다음, 희석액을 바실러스 세레우스 선택배지(CHROMagar)에 분주하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 바실러스 세레우스 균수를 계수하여 바실러스 세레우스의 생존율을 측정하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2를 단독 또는 바실러스 세레우스 균주와 혼합배양한 실험군에서는 바실러스 세레우스가 검출되지 않음을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균활성이 있음을 확인하였다(도 6).
<5-3> 콩발효물에서 바실러스 세레우스 타겟 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA , nheC의 전사량 확인
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주가 접종된 콩발효물에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC에 대한 전사량을 확인하기 위하여, 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 콩에 접종하고 발효하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 500g의 콩을 씻어서 상온에서 16시간 물에 담궈 두었다. 16시간 후, 물에서 콩을 건져 100℃에서 3시간 동안 찌고, 40℃ 이하에서 식혀주었다. 콩을 식힌 후, 콩의 표면에 1%(v/w)(105CFU/g)의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주와 바실러스 세레우스 균주를 9:1의 비율로 섞은 접종원(inoculum)과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주와 바실러스 세레우스 균주를 5:5의 비율로 섞은 접종원(inoculum)을 접종시켜주었다. 균주가 접종된 콩을 35℃에서 36시간 동안 발효시킨 후, 50g의 발효된 콩을 450ml의 멸균 생리식염수(sterile saline)에 넣어 15분 동안 흔들어주고, No2. 와트만 필터 페이퍼(No. 2 whatman filter paper)를 통해 여과시켜 주었다. 여과된 추출물을 8000g로 10분 동안 원심분리시키고, 잔류물을 1ml의 멸균 생리식염수(sterile saline solution)에 녹여준 후, Qiagen의 RNeasy plus mini 키트를 이용하여 상기 잔류물에서 mRNA를 추출하였다. Qiagen의 RNeasy plus mini 키트를 이용하여 제조사의 방법에 따라 바실러스 세레우스 KACC10004와 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 KACC 15866을 혼합 배양한 배양액에서 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA 1㎍을 주형(template)으로 하여 GenDEPOT사의 amfiRivert Platinum cDNA synthesis Master Mix를 사용해 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 상기의 방법으로 합성한 cDNA와 GenDEPOT사의 amfiEco Taq DNA polymerase 및 상기 <표 1>에 있는 프라이머를 이용하여 상기 <표 2>의 조건으로 RT-PCR(reverse transcription-PCR)을 수행하여, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 타겟(target) 유전자인 groEL과 독소 관련 유전자인 nheA, nheC의 전사량을 확인하였다. 또한 Bio-Rad사의 iQ™ SYBR® Green Supermix 5㎕, 상기 <표 1>에 있는 프라이머 200nM, cDNA 2㎕를 사용하여 총 10㎕가 되도록 각각의 샘플을 준비하고, 상기 <표 3>의 조건으로 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System을 이용해 qPCR(quantitative Real-time PCR)을 수행하고, 신호(signal)를 수치화하여 정량적으로 비교 분석하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 단독 또는 바실러스 세레우스 균주와 혼합배양한 실험군에서 groEL, nheA, nheC 유전자가 전사되지 않음을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 7).
<5-4> 콩발효물에서 바실러스 세레우스 생육 관련 단백질인 AtpB의 발현량 확인
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주가 접종된 콩발효물에서 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 생육 관련 단백질인 AtpB의 발현량을 확인하기 위하여, 바실러스 세레우스 KACC10004(Bacillus cereus KACC10004) 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 콩에 접종하고 발효하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다.
구체적으로, 500g의 콩을 씻어서 상온에서 16시간 물에 담궈 두었다. 16시간 후, 물에서 콩을 건져 100℃에서 3시간 동안 찌고, 40℃ 이하에서 식혀주었다. 콩을 식힌 후, 콩의 표면에 1%(v/w)(105CFU/g)의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주와 바실러스 세레우스 균주를 9:1의 비율로 섞은 접종원(inoculum)과 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주와 바실러스 세레우스 균주를 5:5의 비율로 섞은 접종원(inoculum)을 접종시켜주었다. 균주가 접종된 콩을 35℃에서 36시간 동안 발효시킨 후, 50g의 발효된 콩을 450ml의 멸균 생리식염수(sterile saline)에 넣어 15분 동안 흔들어주고, No2. 와트만 필터 페이퍼(No. 2 whatman filter paper)를 통해 여과시켜 주었다. 여과된 추출물을 8000g로 10분 동안 원심분리시키고, 잔류물을 1ml의 멸균 생리식염수(sterile saline solution)에 녹여준 후, 상기 잔류물을 10,000g로 5분간 원심분리하여 얻은 펠릿(pellet)에 30㎕의 SDS 샘플 버퍼(SDS sample buffer)를 넣고 10분간 100℃에서 변성(denaturation)시킨 후에 12% SDS 폴리아크릴아마이드겔(SDS polyacrylamide gel)에 전기영동 한 후, 겔(gel)을 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 막(membrane)을 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin)으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하고 1시간 후, 항-AtpB 1차 항체(affinity purified rabbit anti-AtpB first antibody; Agrisera, Vannas, Sweden)를 막(membrane)에 넣어 1시간 동안 반응시켜주었다. 1시간 후, TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 용액으로 10분 간격으로 3회 막(membrnae)을 세척한 후, HRP가 결합된 IgG 2차 항체(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated goat IgG secondary antibody; Bio-Rad, Berkeley, California, USA)를 막(membrane)에 넣어 1시간 동안 반응시켜주었다. 1시간 후, TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 용액으로 10분 간격으로 3회 막(membrane)을 세척한 후, BM 화학발광 블롯팅 기질(BM chemiluminescence blotting substrate(POD); Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 X-ray 필름에 감광 후, 현상하여 AtpB 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 단독 또는 바실러스 세레우스 균주와 혼합배양한 실험군에서 AtpB 단백질이 발현되지 않음을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 저해 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 8).
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주의 바이오제닉 아민 생성 저해효과 확인
상기 <실시예 2>로부터 동정한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 바이오제닉 아민(biogenic amine) 생성 저해효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<6-1> 바이오제닉 아민 생성 관련 유전자인 hdc , tdc , yobN 유전자의 전사량 확인
바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주에서 아민 산화효소(amine oxidase) 유전자인 yobN과 탈탄산효소(decarboxylase) 유전자인 hdc, tdc에 대한 전사량을 확인하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 배양하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하는 균주로써, 양성대조군(positive control)으로 사용하였으며, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 균주로써, 음성대조군(negative control)으로 사용하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 0.005% 피리독살인산(pyridoxal-5-phosphate), 0.5% 히스티딘(histidine) 및 0.5% 티로신(tyrosine)이 첨가된 영양배지(nutrient broth)에서 배양한 후, Qiagen의 RNeasy plus mini 키트를 이용하여 제조사의 방법에 따라 상기 배양액에서 mRNA를 추출하였다. 추출한 mRNA 1㎍을 주형(template)으로 하여 GenDEPOT사의 amfiRivert Platinum cDNA synthesis Master Mix를 사용해 제조사의 방법에 따라 cDNA를 합성하였다. 상기의 방법으로 합성한 cDNA와 GenDEPOT사의 amfiEco Taq DNA polymerase 및 하기 <표 4>에 있는 프라이머를 이용하여 하기 <표 5>의 조건으로 RT-PCR(reverse transcription-PCR)을 수행하여, 바이오제닉 아민 생성 관련 유전자인 hdc, tdc, yobN의 전사량을 확인하였다. 또한 Bio-Rad사의 iQ™ SYBR® Green Supermix 5㎕, 하기 <표 4>에 있는 프라이머 200nM, cDNA 2㎕를 사용하여 총 10㎕가 되도록 각각의 샘플을 준비하고, 하기 <표 6>의 조건으로 CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System을 이용해 qPCR(quantitative Real-time PCR)을 수행하고, 신호(signal)를 수치화하여 정량적으로 비교 분석하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 배양한 실험군에서 탈탄산효소(decarboxylase) 유전자인 tdc 및 hdc 유전자가 전사되지 않았으며, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주를 배양한 실험군에 비해 아민 산화효소(amine oxidase) 유전자인 yobN이 더 많이 전사됨을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민 생성 저해효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 9).
바이오제닉 아민 생성 관련 유전자인 hdc, tdc, yobN의 전사량을 확인하기 위한 RT-PCR 및 qPCR에 사용한 프라이머 서열목록
프라이머 서열(5'→3')
tdc-L(서열번호 11) 5'-ACATAGTCAACCATRTTGAA-3'
tdc-R(서열번호 12) 5'-CAAATGGAAGAAGAAGTAGG-3'
hdc-L(서열번호 13) 5'-GATGGTATTGTTTCKTATGA-3'
hdc-R(서열번호 14) 5'-CAAACACCAGCATCTTC-3'
yobN-L(서열번호 15) 5'-CCGTGTCTGCACKTTGAGATC-3'
yobN-R(서열번호 16) 5'-ACATCCGCCAATTTCTTKCWGG-3'
16srRNA-L(서열번호 9) 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'
16srRNA-R(서열번호 10) 5'-GGCTACCTTGTTACGACTT-3'
바이오제닉 아민 생성 관련 유전자인 hdc, tdc, yobN의 전사량을 확인하기 위한 RT-PCR의 조건
단계 온도 시간 사이클수
초기변성(initial denaturation) 및 효소 활성(enzyme activation) 95℃ 5분 1
변성(denaturing) 95℃ 45초
35
결합(annealing) 48℃ 45초
증폭(extension) 72℃ 2분
바이오제닉 아민 생성 관련 유전자인 hdc, tdc, yobN의 전사량을 확인하기 위한 qPCR의 조건
단계 온도 시간 사이클수
초기변성(initial denaturation) 및 효소 활성(enzyme activation) 95℃ 5분 1
변성(denaturing) 95℃ 45초
35
결합(annealing) 48℃ 45초
증폭(extension) 72℃ 2분
<6-2> 히스타민 수용체와 히스타민 생성관여 효소의 발현량 확인
히스타민(histamine)은 대표적인 바이오제닉 아민(biogenic amine)으로 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 히스타민 수용체와 히스타민 생성관여 효소인 히스티딘 탈탄산효소(histidine decarboxylase)의 발현량을 확인하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 배양하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하는 균주로써, 양성대조군(positive control)으로 사용하였으며, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 균주로써, 음성대조군(negative control)으로 사용하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 0.005% 피리독살인산(pyridoxal-5-phosphate), 0.5% 히스티딘(histidine) 및 0.5% 티로신(tyrosine)이 첨가된 영양배지(nutrient broth)에서 배양한 후, 상기 배양액을 10,000g로 5분간 원심분리하여 얻은 펠릿(pellet)에 30㎕의 SDS 샘플 버퍼(SDS sample buffer)를 넣고 10분간 100℃에서 변성(denaturation)시킨 후에 12% SDS 폴리아크릴아마이드겔(SDS polyacrylamide gel)에 전기영동 한 후, 겔(gel)을 니트로셀룰로오스막(nitrocellulose membrane)으로 이동시켰다. 상기 막(membrane)을 3% 소혈청알부민(bovine serum albumin)으로 1시간 동안 블로킹(blocking)하고 1시간 후, 항-히스티딘 탈탄산효소 1차 항체(anti-histidine decarboxylase first antibody) 또는 항-히스타민 H3 수용체 1차 항체(anti-histamine H3 receptor first antibody)를 막(membrane)에 넣어 1시간 동안 반응시켜주었다. 1시간 후, TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 용액으로 10분 간격으로 3회 막(membrnae)을 세척한 후, HRP가 결합된 IgG 2차 항체(horseradish peroxidase(HRP)-conjugated goat IgG secondary antibody; Bio-Rad, Berkeley, California, USA)를 막(membrane)에 넣어 1시간 동안 반응시켜주었다. 1시간 후, TBST(Tris-buffered saline with 0.1% Tween-20) 용액으로 10분 간격으로 3회 막(membrane)을 세척한 후, BM 화학발광 블롯팅 기질(BM chemiluminescence blotting substrate(POD); Roche, Mannheim, Germany)을 사용하여 X-ray 필름에 감광 후, 현상하여 히스티딘 탈탄산효소 단백질 및 히스타민 H3 수용체 단백질의 발현량을 확인하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주를 배양한 실험군에서 히스티딘 탈탄산효소(histidine decarboxylase) 단백질이 발현되지 않았으며, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3 균주를 배양한 실험군에 비해 히스타민 H3 수용체(histamine H3 receptor) 단백질이 더 낮게 발현됨을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민인 히스타민의 생성 저해효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 10).
<6-3> 히스타민 및 티라민 생성 저해효과 확인
히스타민(histamine)과 티라민(tyramine)은 대표적인 바이오제닉 아민(biogenic amine)으로 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 히스타민과 티라민의 생성량을 확인하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 배양하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하는 균주로써, 양성대조군(positive control)으로 사용하였으며, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 균주로써, 음성대조군(negative control)으로 사용하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 0.005% 피리독살인산(pyridoxal-5-phosphate), 0.5% 히스티딘(histidine) 및 0.5% 티로신(tyrosine)이 첨가된 영양배지(nutrient broth)에서 배양한 후, 상기 배양액으로 ELISA 어세이를 수행하였다. 히스타민 농도는 히스타민 ELISA kit(Neogen, Lexington, USA)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였으며, 티라민 농도는 항-티라민 항체(anti-tyramine antibody, Abcam Inc.)를 이용하여, 통상적인 방법에 따라 ELISA를 수행하여 측정하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주에 비해 히스타민 및 티라민 생성량이 적음을 확인하였다(도 11).
또한, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 히스타민과 티라민의 생성량을 확인하기 위하여, 하기와 같은 방법으로 UPLC 분석을 수행하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 0.005% 피리독살인산(pyridoxal-5-phosphate), 0.5% 히스티딘(histidine) 및 0.5% 티로신(tyrosine)이 첨가된 영양배지(nutrient broth)에서 배양한 후, 상기 균주의 광학밀도(optical density; OD)값이 0.3이 되도록 배양액을 희석시켜주었다. 0.005% 피리독살인산(pyridoxal-5-phosphate), 0.5% 히스티딘(histidine) 및 0.5% 티로신(tyrosine)이 첨가된 영양배지(nutrient broth) 5㎖에 광학밀도(OD)값이 0.3인 균 배양액 2%를 접종하여, 30℃에서 하루 동안 배양하였다. 하루가 지난 후, 균주가 접종된 배양액 5㎖를 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하였고, 배양액에서 원심 분리한 상층액 4㎖에 2N 수산화나트륨(NaOH) 2mL와 염화벤조일(benzoyl) chloride) 50㎕를 넣고 3분간 혼합한 후, 30℃에서 40분간 유도체화 하였다. 유도체화 후, 포화 염화나트륨(NaCl) 3㎖를 넣어 반응을 멈추고, 다이에틸에티르(diethyl ether) 4mL를 넣어 3분간 진탕하여 추출하고, 3,500 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 샘플의 상층액 2㎖를 얻어 질소농축한 뒤, 아세토니트릴 (acetonitrile) 1㎖를 넣어준 후, 0.2㎛로 여과하여, 상기 여과된 용액을 시험용액으로 사용하였다. 유도체화한 상기 시험용액을 이용한 UPLC(Ultra performance liquid chromatography) 분석은 waters 시스템을 사용하였고 컬럼으로는 C18(2.1x75mm, waters)을 사용하였다. 유속은 0.4 ㎖/min으로 조절하였으며, 시료는 0.2㎕를 주입하였고, 하기 <표 7>의 용매 조건으로 이동상을 흘려주었으며, 검출파장은 UV detector를 이용하여 254nm에서 측정하여 분석하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 히스타민을 생성하지 않았으며, 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주에 비해 히스타민 및 티라민 생성량이 적음을 확인하였다(도 12).
이 모든 결과를 종합하여, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민인 히스타민 및 티라민 생성 저해효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다.
티라민 및 히스타민 생성량 확인을 위한 UPLC 분석 조건
컬럼(column) Acquity BEH C18 (2.1mm I.D.×100mm, 1.7㎛)
유속(flow rate) 0.4 mL/min
샘플 주입량(infection volume) 0.2㎕
파장(wave length) UV 254nm




이동상(mobile phase)




 A: 물에 0.1% 아세트산을 첨가한 용액
B: 아세토니트릴에 0.1% 아세트산을 첨가한 용액
시간(분) A(%) B(%)
0.00 50 50
0.20 60 40
1.00 50 50
2.00 50 50
3.00 45 55
4.00 40 60
5.00 35 65
6.00 40 60
<6-4> 히스타민 및 티라민 분해효과 확인
히스타민(histamine)과 티라민(tyramine)은 대표적인 바이오제닉 아민(biogenic amine)으로 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주의 히스타민과 티라민의 생성 저해효과를 확인하기 위하여, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 배양하여 하기와 같은 방법으로 실험을 수행하였다. 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하는 균주로써, 양성대조군(positive control)으로 사용하였으며, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생성하지 않는 균주로써, 음성대조군(negative control)으로 사용하였다.
구체적으로, 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주, 바실러스 서브틸리스 HJ0-6(Bacillus subillis HJ0-6) 균주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2(Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2) 균주를 0.005% 피리독살인산(pyridoxal-5-phosphate), 0.5% 히스티딘(histidine), 0.5% 티로신(tyrosine), 0.25% 히스타민(histamine) 및 0.25% 티라민(tyramine)이 첨가된 배지에서 배양한 후, 상기 균주의 광학밀도(optical density; OD)값이 0.3이 되도록 배양액을 희석시켜주었다. 0.005% 피리독살인산(pyridoxal-5-phosphate), 0.5% 히스티딘(histidine) 및 0.5% 티로신(tyrosine)이 첨가된 영양배지(nutrient broth) 5mL에 광학밀도(OD)값이 0.3인 균 배양액 2%를 접종하여, 30℃에서 하루 동안 배양하였다. 하루가 지난 후, 균주가 접종된 배양액 5㎖를 8,000rpm으로 10분 동안 원심분리하였고, 배양액에서 원심 분리한 상층액 4㎖에 2N 수산화나트륨(NaOH) 2㎖와 염화벤조일(benzoyl) chloride) 50㎕를 넣고 3분간 혼합한 후, 30℃에서 40분간 유도체화 하였다. 유도체화 후, 포화 염화나트륨(NaCl) 3㎖를 넣어 반응을 멈추고, 다이에틸에티르(diethyl ether) 4㎖를 넣어 3분간 진탕하여 추출하고, 3,500 rpm으로 10분 동안 원심분리하였다. 원심분리한 샘플의 상층액 2㎖를 얻어 질소농축한 뒤, 아세토니트릴 (acetonitrile) 1㎖를 넣어준 후, 0.2㎛로 여과하여, 상기 여과된 용액을 시험용액으로 사용하였다. 유도체화한 상기 시험용액을 이용한 UPLC(Ultra performance liquid chromatography) 분석은 waters 시스템을 사용하였고 컬럼으로는 C18(2.1x75mm, waters)을 사용하였다. 유속은 0.4㎖/min으로 조절하였으며, 시료는 0.2㎕를 주입하였고, 상기 <표 7>의 용매 조건으로 이동상을 흘려주었으며, 검출파장은 UV detector를 이용하여 254nm에서 측정하여 분석하였다.
그 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 히스타민 분해율이 28.02%, 티라민 분해율이 34.45%로 바이오제닉 아민 생성균주인 바실러스 서브틸리스 H'J53-3(Bacillus subillis H'J53-3) 균주보다 바이오제닉 아민인 히스타민 및 티라민 분해능이 뛰어남을 확인함으로써, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주는 바이오제닉 아민 저감화 효과가 뛰어난 균주임을 확인하였다(도 13).
<110> Rural Development Administration <120> Bacillus amyloliquefaciens HJ5-2 oligotrophic strain with anti Bacillus cereus activity and reduction of biogenic amine and compositions thereof <130> 2016P-09-007 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 1 agagtttgat catggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 2 ggataccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> groEL-L primer <400> 3 tgcaactgta ttagcacaag ct 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> groEL-R primer <400> 4 ttaccaacgc gctccattgc tt 22 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nheA-L primer <400> 5 gttaggatca caatcaccgc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nheA-R primer <400> 6 acgaatgtaa tttgagtcgc 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nheC-L primer <400> 7 tggattccaa gatgtaacg 19 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nheC-R primer <400> 8 attacgactt ctgcttgtgc 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16srRNA-L primer <400> 9 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16srRNA-R primer <400> 10 ggctaccttg ttacgactt 19 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tdc-L primer <400> 11 acatagtcaa ccatrttgaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tdc-R primer <400> 12 caaatggaag aagaagtagg 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hdc-L primer <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> G or T <400> 13 gatggtattg tttcktatga 20 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hdc-R primer <400> 14 caaacaccag catcttc 17 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yobN-L primer <220> <221> misc_feature <222> (13) <223> G or T <400> 15 ccgtgtctgc ackttgagat c 21 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> yobN-R primer <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> G or T <220> <221> misc_feature <222> (20) <223> A or T <400> 16 acatccgcca atttcttkcw gg 22

Claims (10)

  1. 농업유전자원정보센터에 수탁번호 KACC 81027BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) HJ5-2 균주를 0.25% 이상의 농도로 발효식품에 처리하여, groEL, nheA 및 nheC 유전자의 전사량을 감소시키고, AtpB 단백질의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 제어방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 발효식품은 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 식품인 것을 특징으로 하는 제어방법.
  3. 농업유전자원정보센터에 수탁번호 KACC 81027BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillusamyloliquefaciens) HJ5-2 균주를 유효성분으로 함유하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물로서,
    상기 조성물 내 유효성분인 농업유전자원정보센터에 수탁번호 KACC 81027BP로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 HJ5-2 균주가 0.25% 이상의 농도가 되도록 발효식품에 처리하고, 상기 조성물은 groEL, nheA 및 nheC 유전자의 전사량을 감소시키고, AtpB 단백질의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물.
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