KR20230074400A - 바이오제닉 아민 분해 효과를 가지는 신규한 레비락토바실러스 브레비스 pk08 균주 및 이의 이용 - Google Patents

바이오제닉 아민 분해 효과를 가지는 신규한 레비락토바실러스 브레비스 pk08 균주 및 이의 이용 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바이오제닉 아민(BA) 분해 효과를 가지는 수탁번호 KCTC 15149BP의 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않거나 및/또는 분해하는 능력을 가지며, 안전한 발효식품을 생산할 수 있는 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

바이오제닉 아민 분해 효과를 가지는 신규한 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주 및 이의 이용{Novel Levilactobacillus brevis PK08 strain having Biogenic amine degradation effect, and uses thereof}
본 발명은 바이오제닉 아민 분해 효과를 가지는 신규한 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주(수탁번호 KCTC 15149BP), 이의 배양물, 및 이들을 유효성분으로 함유하는 식품 첨가용 미생물 제제에 관한 것이다.
바이오제닉 아민(Biogenic amine)은 단백질을 함유한 식품이 부패하거나, 발효·숙성 과정에서 유리아미노산이 미생물의 탈탄산작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소 화합물이다.
바이오제닉 아민은 발효식품, 어류제품, 육류제품, 낙농제품, 포도주, 맥주, 채소, 과일, 견과류 등 다양한 식품에 함유되어 있다. 이러한 바이오제닉 아민은 인체 및 동물 체내에서 신경전달물질로서 직·간접적으로 작용하고, 혈압조절, 혈류 등의 심혈관계에도 영향을 미치므로 바이오제닉 아민이 함유된 식품의 섭취로 여러 약리적인 현상이 나타날 수 있다.
식품에서 주로 발견되는 바이오제닉 아민은 티라민(Tyramine), 히스타민(Histamine), 카다베린(Cadaverine), 퓨트레신(Putrescine) 등이 있으며, 구조상 지방족 화합물(putrescine, cadaverine 등), 방향족 화합물(tyramine, β-phenylethylamine), 헤테로고리 화합물(histamine, tryptamine)로 나눌 수 있다. 지방족 화합물은 부패의 지표물질로서 흔히 이용되고 있고, 최근에 이들 폴리아민(polyamine)류는 세포의 성장과 증식에 관여하는 인자로 알려져 연구가 진행되고 있으며, N-니트로사민(N-nitrosamine)과 같은 발암물질로 전환될 수 있는 잠재성을 갖고 있는 것으로 알려져 있다.
바이오제닉 아민 중 가장 널리 알려진 물질은 히스타민으로, 고등어, 꽁치, 정어리, 참치 등의 어종이 비위생적 처리로 인해 부패가 발생하게 되면 발진, 국소적 피부염증, 구토 등을 증상으로 하는 '고등어 중독증(scombrotoxicosis)'을 유발하게 된다. 하지만 히스타민에 의한 식중독은 식품섭취를 통한 알레르기와 증상이 비슷해 그 발생빈도가 잘 알려져 있지 않다.
바이오제닉 아민의 독성 증세로는 오심, 호흡곤란, 발열 홍조, 발한, 두통, 구강 작열통, 설사, 경련, 홍반, 혈압상승, 두드러기 등이 발생할 수 있는데, 특히 티라민은 혈관수축 및 혈압상승작용에 관여하는 가장 강한 혈압증진 아민으로 고혈압을 유발할 수 있으며, 편두통을 유발하기도 한다.
한편, 김치는 배추 등의 야채류를 소금에 절인 후, 고추가루 및 젓갈 등을 포함하는 양념으로 버무려 저온에서 발효시켜 제조하는 우리나라의 대표적인 발효 식품이다. 김치 자체만으론 단백질이 거의 없어 바이오제닉 아민 생성이 적지만, 단백질이 풍부한 액젓 등을 사용한 김치에서는 이들 성분이 높게 나타나기도 한다.
따라서, 바이오제닉 아민 분해능이 우수한 스타터 균주를 탐색하여, 대표적인 발효식품인 김치뿐만 아니라 다양한 식품에 적용하여 식품의 안전성을 높일 필요가 있다.
US 2017-0251710 A1
본 발명자들은 바이오제닉 아민 분해능이 우수한 스타터 균주를 확립하고자 노력한 결과, 본 발명의 신규한 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주(수탁번호 KCTC 15149BP)가 식품의 발효 과정 동안 발생하는 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해할 수 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 바이오제닉 아민(Biogenic amine, BA) 분해 효과를 가지는 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주(수탁번호 KCTC 15149BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주를 유효성분으로 포함하는, 식품 첨가용 미생물 제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 미생물 제제를 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 식품 첨가물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 미생물 제제를 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 발효식품 유해 인자 제어 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주를 유효성분으로 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 미생물 스타터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주를 유효성분으로 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 바이오제닉 아민 분해능이 우수한 스타터 균주를 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과, 식품의 발효 과정 동안 발생하는 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해할 수 있는 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주를 구축하였다.
본 발명은 바이오제닉 아민(BA) 분해 효과를 가지는 수탁번호 KCTC 15149BP의 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 바이오제닉 아민(Biogenic amine, BA) 분해 효과를 가지는 수탁번호 KCTC 15149BP의 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08에 관한 것이다.
상기 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.본 발명의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 16s rRNA 유전자 서열 분석을 기반으로 종 수준까지 확인되었다.
상기 16s rRNA 유전자 증폭에는 범용 박테리아 프라이머인 518F(5'-CCAGCAGCCGCGGTAATACG-3', 서열번호 2) 및 805R(5'-GACTACCAGGGTATCTAAT-3', 서열번호 3)을 사용하였다.
상기 수득된 신규한 균주를 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주로 명명하고, 2021년 11월 15일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 15149BP을 부여받았다.
상기 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 김치시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있다.
상기 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않거나 및/또는 분해하는 능력을 가진다.
본 발명에서 상기 바이오제닉 아민은 식품에서 주로 발견되는 것으로 티라민(Tyramine), 히스타민(Histamine), 카다베린(Cadaverine), 퓨트레신(Putrescine), 스페르민(Spermine) 및 스페르미딘(Spermidine) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 히스타민 및/또는 티라민에 대하여 우수한 분해 활성을 갖는다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 바이오제닉 아민에 대한 높은 분해 활성을 갖는다.
상기 바이오제닉 아민 분해 활성을 확인하기 위해서, Leuschner 등에 의해 개발된 시험 방법(Leuschner, R.G. et al., Int. J. Food Microbiol. 1998, 39, 1-10)을 통해서 확인하였다(표 1).
본 발명의 다른 일 양태는 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식품 첨가용 미생물 제제에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 배양물은 균주를 배양한 보통 한천배지(또는 영양 한천배지; Nutrient agar), 또는 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe) 배지로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는 통상적인 방법으로 제형화할 수 있으며 건조분말 또는 액상 형태로 제조할 수 있다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화할 수도 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 미생물 제제는 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 또는 둘 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin) 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 식품은 김치류, 장류, 젓갈류, 주류, 발효 육가공류일 수 있다. 구체적으로, 상기 김치류는 배추김치, 물김치, 깍두기, 열무김치, 총각김치, 오이김치, 파김치, 갓김치 등일 수 있고, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장, 혼합간장 등일 수 있고, 상기 젓갈류는 새우젓, 창난젓, 전복젓, 어간장, 연어알젓, 오징어젓, 은어젓, 젓갈, 양념젓갈, 액젓 등일 수 있고, 상기 주류는 맥주, 청주, 약주, 노주, 탁주, 과실주, 와인 등일 수 있으며, 상기 발효 육가공류는 소시지, 햄, 건조육, 베이컨, 프레스햄 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 상기 균주를 식품 첨가용으로 사용하는 경우, 균주를 그대로 사용하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상술한 미생물 제제를 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 식품 첨가물에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없으나, 바람직하게는 상기 식품은 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다.
상기 균주를 첨가할 수 있는 식품의 예로는 김치류, 장류, 젓갈류, 주류, 발효 육가공류, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 또 다른 일 양태는 상술한 미생물 제제를 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 발효식품 유해 인자 제어 방법에 관한 것이다.
상기 발효식품 유해 인자 제어는 본 발명의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주를 발효식품에 처리함으로써 유해 인자의 생성을 지연시키거나 저해시켜 제어할 수 있다.
상기 발효식품 유해 인자는 바이오제닉 아민일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 상술한 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 미생물 스타터 및 조성물을 제공한다.
상기 균주, 및 이를 이용한 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 미생물 스타터 및 조성물의 중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략한다.
본 발명은 바이오제닉 아민(BA) 분해 효과를 가지는 수탁번호 KCTC 15149BP의 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않거나 및/또는 분해하는 능력을 가지며, 안전한 발효식품을 생산할 수 있는 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주에 의한 배추김치 발효 중 이화학적 성질의 변화를 측정한 것으로, 도 1a는 pH, 도 1b는 산도(acidity) 변화를 측정한 그래프이다. (●: 비접종 C 군(대조군), ○: L. brevis를 접종한 PC 군(양성 대조군), ■: L. brevis PK08을 접종한 LB 군, □: L. pentosus PK05를 접종한 LT 군, ▲: Leu. mesenteroides YM20을 접종한 LM 군, △: L. plantarum KD15를 접종한 LP 군, ◆: L. sakei YM21을 접종한 LS 군)
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주에 의한 배추김치 발효 중 미생물학적 성질의 변화를 측정한 것으로, 도 2a는 총 생존 중온성 균주 수(Total viable mesophilic bacterial counts), 도 2b는 LAB 균주 수(Lactic acid bacterial counts) 변화를 측정한 그래프이다. 도면 내 기호의 설명은 상기 도 1에서와 같다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주를 접종한 배추김치 내 BA(Tyramine) 함량의 변화를 측정한 그래프이다. (●: 비접종 C 군(대조군), ○: L. brevis를 접종한 PC 군(양성 대조군), ■: L. brevis PK08을 접종한 LB 군)
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주를 접종한 배추김치 내 BA(Histamine) 함량의 변화를 측정한 그래프이다. 도면 내 기호의 설명은 상기 도 3a에서와 같다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주를 접종한 배추김치 내 BA(Putrescine) 함량의 변화를 측정한 그래프이다. 도면 내 기호의 설명은 상기 도 3a에서와 같다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주를 접종한 배추김치 내 BA(Cadaverine) 함량의 변화를 측정한 그래프이다. 도면 내 기호의 설명은 상기 도 3a에서와 같다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주를 접종한 배추김치 내 BA(Spermidine) 함량의 변화를 측정한 그래프이다. 도면 내 기호의 설명은 상기 도 3a에서와 같다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따라 LAB 균주를 접종한 배추김치 내 BA(Spermine) 함량의 변화를 측정한 그래프이다. 도면 내 기호의 설명은 상기 도 3a에서와 같다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따라 L. brevis에서 MCO(390 bp)를 암호화하는 유전자에 대해 증폭된 PCR 산물의 전기영동 결과이다. (M: 1,000 bp DNA Ladder, 1: L. brevis JCM 1170, 2: L. brevis PK08, 3: L. brevis PK11)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[준비예]
젖산균(lactic acid bacteria, LAB) 분리
LAB 균주는 배추김치, 깍두기(깍둑썰기한 무를 주재료로 한 김치), 총각김치(알타리무를 주재료로 한 김치), 열무김치(어린 무를 주재료로 한 김치), 갓김치(겨자잎을 주재료로 한 김치) 파김치(파를 주재료로 한 김치)를 포함하는 6종의 김치로부터 총 1,448주를 분리하였다.
본 연구에 사용된 참조 LAB 균주인 Levilactobacillus brevis JCM 1170, L. helveticus KCCM 40989, L. plantarum KCTC 3108, L. sakei KCCM 43213, L. casei KCCM 12452, L. paracasei KCTC 3510, Limosilactobacillus fermentum KCTC 3112, Lentilactobacillus buchneri KCTC 5064, Leu. mesenteroides KCTC 3505, 및 Leu. citreum KCCM 12030은 한국미생물보존센터(KCCM; Seoul, South Korea), 일본 JCM (Japan Collection of Microorganisms; Saitama, Japan), 및 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC; Daejeon, South Korea)로부터 입수하였다.
모든 균주는 MRS(de Man, Rogosa, and Sharpe; Laboratorios Conda, Madrid, Spain) 배지에서 37℃, 48시간 동안 배양하였으며, 글리세롤(20%, v/v)에 -70℃ 냉동고에서 보관하였다.
[실시예]
실시예 1. LAB 균주에 의한 BA 분해능 확인
LAB 균주에 의한 바이오제닉 아민(biogenic amine, BA)의 분해는 Leuschner 등에 의해 개발된 방법을 이용하여 평가하였다(Leuschner, R.G. et al., Int. J. Food Microbiol. 1998, 39, 1-10).
상기 분리된 1,448개 균주에 대하여, 각 LAB 균주의 글리세롤 스톡 10 μL를 MRS 배지 5 mL에 접종하였다. 37℃에서 48시간 동안 호기성 배양 후, 동일한 조건에서 배양된 MRS 한천(agar)에 배양액의 루프풀(loopful)을 도말하고, 단일 콜로니를 5 mL의 MRS 배지에 접종하였다. 37℃에서 48시간 동안 호기성 배양 후, 배양된 배지 200 μL를 10 mL의 MRS 배지에 옮겼다. 37℃에서 48시간 동안 200 rpm으로 진탕 호기성 배양 후, 상기 배양액을 4℃에서 10분간 9000Хg으로 원심분리하였다. 상기 펠렛을 인산나트륨(sodium phosphate) 버퍼(0.05 M, pH 7.00; 증류수 1L에 4.0962 g의 Na2HPO4 및 2.537 g의 NaH2PO4가 용해됨, Sigma-Aldrich, USA)로 두 번 세척하였다. 상기 세포 펠렛을 0.5 mM 히스타민(histamine, Sigma-Aldrich, w/v) 및 0.5 mM 티라민(tyramine, Sigma-Aldrich, w/v)을 포함하는 동일한 버퍼 10 mL에 재현탁하였다. 상기 세포 현탁액을 아민 산화효소 활성을 위한 최적 온도인 30℃에서 24시간 동안 200 rpm으로 흔들어 반응시켰다. 그 다음, 상기 세포 현탁액을 주사기를 사용하여 0.2 μm 멤브레인 필터(Millipore Co., USA)를 통해 여과하고, HPLC를 이용하여 독성 BA 분해를 즉시 분석하였다.
그 결과, 테스트된 1,448개 균주 중 대부분의 LAB 균주들(1,373개 균주)은 10% 미만의 분해율을 나타내어 독성 BA 분해능력이 낮거나 전혀 없는 것으로 나타났다. 이와 대조적으로, 다른 75개 LAB 균주들은 독성 BA의 10% 이상을 분해하는 능력을 보여주었다.
이에, 분해 활성의 재현성을 신속하게 관찰하고 확인하기 위하여, 배양 배지에서만 추가 테스트를 진행하였다.
구체적으로, 상기와 동일한 배양 조건 하에 MRS 배지에서 LAB 균주를 활성화한 후, 상기 배양된 배지 200 μL를 히스타민 또는 티라민이 50 ppm(w/v) 첨가된 MRS 배지 10 mL에 접종하였다. 균주 세포를 처리하지 않은 히스타민 또는 티라민 함유 MRS 배지를 대조군으로 사용하였다. 모든 배지는 30℃에서 24시간 동안 정치 배양하였다. 그 다음, 0.2μm 멤브레인을 통해 상기 배지 배양물을 여과하고, 상기 여과된 배지 배양물 1 mL를 HPLC를 사용하여 즉시 분석하였다. 상기 방법을 사용하여 LAB 균주의 분해 활성을 평가한 후, 더 높은 분해 활성을 나타내는 선택된 LAB 균주에 대해 상술한 바와 같은 버퍼에서의 측정 방법을 사용하여 분해 활성을 재시험하였다.
그 결과, 75개 LAB 균주 중 5개의 LAB 균주가 10% 이상의 독성 BA 분해율에 대한 재현성을 나타냈다. 5개의 LAB 균주 각각에 의한 독성 BA의 최고 분해율 범위는 다음과 같다: 버퍼에서 히스타민의 경우 1.39 내지 10.81% 및 티라민의 경우 7.43 내지 14.97%, 배양 배지에서 히스타민의 경우 1.59 내지 8.56% 및 티라민의 경우 11.68 내지 14.88%(하기 표 1 참조).
[표1] LAB 균주들에 의한 버퍼 및 배지에서의 히스타민 및 티라민 분해율
Figure pat00001
1 PK: 파김치, YM: 열무김치, KD: 깍두기.
2 HIS: 히스타민, TYR: 티라민.
3 표기된 값은 2회 실험에 의해 측정된 최소값 및 최대값(평균 ± 표준편차)을 나타냄. 동일한 BA에 대한 동일한 행에서 상이한 문자(a-b)가 표시된 평균값은 유의미한 차이가 있음(p < 0.05), ND: 분해가 감지되지 않음.
실시예 2. BA 분해능이 있는 LAB 균주의 식별
상기 실시예 1의 BA 분해 결과를 기반으로, 선택된 5개의 LAB 균주에 대하여 이전 연구(Jin, Y.H. et al., Foods 2019, 8, 73)에서와 같이 범용 박테리아 프라이머 518F 및 805R을 사용하여 16S rRNA 유전자 시퀀싱을 통해 균주를 식별하였다.
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 5개의 LAB 균주 PK08, PK05, YM20, KD15 및 YM21은 각각 L. brevis(수탁번호 KCTC 15149BP), L. pentosus, Leu. mesenteroides, L. plantarum 및 L. sakei 인 것으로 식별되었다.
실시예 3. LAB 균주 발효 배추김치의 이화학적 특성 및 미생물학학적 특성 확인
3-1. LAB 균주를 이용한 배추김치 발효
Kim 등(Kim, S.-H. et al., LWT Food Sci. Technol. 2017, 84, 196-203)에 의해 설명된 레시피를 이용하여 배추김치를 준비하였다. 상기 배추는 대한민국 세종시에 있는 식료품점에서 구입하였다. 상기 배추를 4등분하여 10% 소금물(w/v)에 10시간 동안 담가 두었다. 그 다음, 소금에 절인 배추를 수돗물로 세 번 세척하였다. 그 다음, 상온에서 3시간 동안 물기를 뺀 다음, 상기 소금에 절인 배추 100.0g에 채 썬 무 13.0g, 고춧가루 3.5g, 멸치액젓 2.2g, 대파 2.0g, 마늘 1.4g, 설탕 1.0g 및 생강 0.6g을 넣고 혼합하였다. 김치의 염도는 탈이온수를 첨가하여 2.5%로 조절하였다.
상기 배추김치는 7개의 실험군(1개의 비-접종군(C 군) 및 6개의 접종군)으로 분류하였다. 상기 접종군은 독성 BA 분해능이 있고 독성 BA를 생성하지 않는 선택된 5종의 LAB 균주(L. brevis PK08, L. pentosus PK05, Leu. mesenteroides YM20, L. plantarum KD15, 및 L. sakei YM21)를 각각 접종한 LB, LT, LM, LP 및 LS 군으로 하였다. 상기 접종 없이 자연 발효시킨 C 군 및 티라민을 대량 생산(295.63 ± 12.44μg /mL)할 수 있는 L. brevis PK11을 접종한 PC 군을 각각 대조군과 양성대조군으로 하였다.
각 LAB 균주를 약 7 Log CFU/g 수준으로 배추김치(C 군 제외)에 접종한 후, 플라스틱 용기(250Х150Х200 mm3)에 넣고 김치 발효 실험에 일반적으로 사용되는 온도인 25℃에서 3일 동안 발효시켰다. 상기 7개의 실험군에 속하는 모든 김치 샘플은 두 개씩 준비하였다.
3-2. 이화학적(physicochemical) 특성 확인
각 실험군에 대한 이화학적 특성은 이전 연구에서의 방법(Jin, Y.H. et al., Foods 2019, 8, 73)에 따라 pH는 pH 미터(Orion 3-star Benchtop pH meter; Thermo Scientific, USA)를 이용하여 측정하였으며, 산도는 AOAC 방법에 따라 측정하였다.
그 결과, 도 1a에서 확인할 수 있듯이, 모든 실험군의 초기 pH 값은 5.19 ± 0.04 내지 5.37 ± 0.16 (5.24 ± 0.06, 모든 군으로부터 측정된 값의 평균 ± 표준편차)인 것으로 측정되었다. 구체적으로, C 군 및 LS 군의 pH는 발효 첫날에 약간 증가하였다가, 이후 각각 4.03 ± 0.04 및 3.99 ± 0.02로 꾸준히 감소하였다. 다른 군(PC, LB, LT, LM 및 LP 군)의 pH는 발효기간 동안 3.60 ± 0.01 내지 4.10 ± 0.04 범위로 점진적으로 감소하였다. C 군 및 1일째의 LS 군의 느린 미생물 성장은 유기산 생성을 지연시켜 pH(및 산성도)에 영향을 미치는 것으로 보인다.
또한, 도 1b에서 확인할 수 있듯이, 모든 실험군의 초기 적정산도는 0.42 ± 0.04 내지 0.52 ± 0.12% (0.48 ± 0.04%, 모든 군으로부터 측정된 값의 평균 ± 표준편차)인 것으로 측정되었다. 구체적으로, C 군 및 LS 군의 적정산도는 발효 첫날에 약간 감소하였다가, 이후 각각 1.20 ± 0.02% 및 1.12 ± 0.02%로 점차 증가하였다. 반면에, LP 군의 적정산도는 1일째에 초기 산도에 비해 통계적으로 변화가 없었고(단, 약간 감소) 그 이후에는 상승한 반면, PC, LB, LT 및 LM 군은 전체 발효기간 동안 증가하였다. 발효 3일째에 PC, LB, LT, LM 및 LP 군의 적정 산도는 1.18 ± 0.06 내지 1.64 ± 0.11% 범위에 도달하였다. 이러한 발효기간 동안의 산도 변화는 모든 군의 pH 변화와 일치하였다. 또한 1일째에 PC 및 LB 군에서 가장 큰 산도 증가가 나타난 반면, LP 군의 경우 그 이후 매일 가장 큰 산도 증가를 나타내었다. 발효 3일째에는 모든 군의 적정산도가 1.0% 이상에 도달하여 배추김치가 과숙성 되었음을 알 수 있었다.
한편, 김치 숙성은 일반적으로 pH와 산도를 기준으로 미숙성, 적숙성, 과숙성으로 나뉜다. 종래 연구에 따르면, 적숙성 김치의 pH 및 산도는 각각 4.2 내지 4.5 및 0.6 내지 1.0%로 제시된 바 있으며, 과숙성 김치의 산도는 1.0% 이상으로 제시된 바 있다. 이러한 기준에 따르면 PC 군은 이미 1일째 과숙성 단계에 도달한 상태로 확인되었다. LB, LT 및 LM 군의 최적 발효는 1일차에, LS 군의 경우 2일차에 관찰되었다. LP 군은 1일차에 덜 숙성되었으나, 적숙성이 관찰되지 않은 상태에서 2일차에 과숙성된 것으로 확인되었다. C 군은 LP 군과 유사한 패턴을 보였다. 종합해보면, 김치 산도에 특이적인 영향을 미치는 본 발명의 LAB 균주를 사용하여 김치 발효를 조절함으로써, 주어진 발효기간 동안 원하는 수준의 숙성을 갖는 최종 제품을 얻을 수 있을 것으로 기대된다.
3-3. 미생물학적 특성 확인
각 실험군에 대한 미생물학적 특성은 이전 연구에서의 방법(Jin, Y.H. et al., Foods 2019, 8, 73)에 따라 총 생존 중온성 균주 수(Total viable mesophilic bacterial counts) 및 LAB 균주 수(Lactic acid bacterial counts)를 각각 Plate Count Agar(PCA; Becton Dickinson, USA) 및 MRS 한천에서 측정하였다.
그 결과, 도 2에서 확인할 수 있듯이, 배추김치 제조 직후의 총 생존 중온성 균주(도 2a) 및 LAB 균주(도 2b)의 수는 군 간에 다소 차이가 있었다. 구체적으로, 초기 총 생존 중온성 균주 및 LAB 균주 수는 C 군의 경우 각각 6.67 ± 0.06 Log CFU/mL 및 6.59 ± 0.13 Log CFU/mL, LP 군의 경우 각각 6.38 ± 0.06 Log CFU/mL 및 6.56 ± 0.09 Log CFU/mL로 가장 낮은 반면, 다른 접종군(PC, LB, LT, LM 및 LS 군)은 C 군보다 각각 최대 0.53 Log CFU/mL 및 1.13 Log CFU/mL까지 더 높게 나타났다.
발효 첫날 C 군 및 LS 군의 총 생존 중온성 균주 수는 각각 7.44 ± 0.46 및 8.20 ± 0.38 Log CFU/mL, LAB 균주 수는 각각 7.46 ± 0.37 및 8.13 ± 0.35 Log CFU/mL이었던 반면, 발효 1일차와 2일차 사이에 다른 군보다 빠르게 증가하였다. 발효 2일차까지 총 생존 중온성 균주 및 LAB 균주 수는 각각 8.85 ± 0.07 내지 9.76 ± 0.07 Log CFU/mL 및 8.84 ± 0.05 내지 9.76 ± 0.06 Log CFU/mL에 도달하였으며, 이후 일정하게 유지되었다. 다른 군(PC, LB, LT, LM 및 LP 군)의 경우 발효 첫날 총 생존 중온성 균주 수는 8.85 ± 0.06 내지 9.51 ± 0.10 Log CFU/mL, LAB 균주 수는 8.84 ± 0.03 내지 9.47 ± 0.09 Log CFU/mL로 C 군 및 LS 군에 비해 더 높게 나타났다.
모든 군에서 발효기간 동안 총 생존 중온성 균주 수는 LAB 균주 수와 유사한 것으로 관찰되었으며, 이러한 결과는 LAB 균주가 배추김치에서 우세한 미생물임을 시사한다.
실시예 4. LAB 균주 발효 배추김치의 발효 중 BA 함량 변화 확인
4-1. 실험방법
상기 실시예 3의 결과를 기반으로, 독성 BA 분해능을 가진 LAB 균주들이 배추김치 내 BA[티라민(Tyramine, 도 3a), 히스타민(Histamine, 도 3b), 퓨트레신(Putrescine, 도 3c), 카다베린(Cadaverine, 도 3d), 스페르미딘(Spermidine, 도 3e) 및 스페르민(Spermine, 도 3f)] 함량을 실질적으로 감소시키는지 평가하였다. 시료 내 BA 분석 및 Assay Menstrua은 이전 연구에서 설명한 프로토콜에 따라 수행하였다(Lee, J.-H. et al., Foods 2019, 8, 109).
내부 표준(internal standard)으로 1,7-디아미노헵탄(1,7-Diaminoheptane)(1 mg/mL; Sigma)을 사용하였으며, 티라민 하이드로클로라이드(tyramine hydrochloride), 히스타민 디하이드로클로라이드(histamine dihydrochloride), 카다베린 디하이드로클로라이드(cadaverine dihydrochloride), 퓨트레신 디하이드로클로라이드(putrescine dihydrochloride), 스페르민 테트라하이드로클로라이드(spermine tetrahy drochloride), 스페르미딘 트리하이드로클로라이드(spermidine trihydrochloride), 트립타민(tryptamine) 및 β-페닐에틸아민 하이드로클로라이드(β-phenylethylamine hydrochloride)를 사용하여 표준 용액을 준비하였다(모두 Sigma 사). 분석 절차로 BA의 추출, BA 표준 용액의 준비, BA의 유도체화 및 BA의 크로마토그래피 분리를 포함하여 수행하였다. 모든 BA에 대한 검출 한계 및 정량 한계는 표준 용액에서 약 0.10 μg/mL, 식품 매트릭스에서 각각 0.01 ~ 0.10 mg/kg 및 0.02 ~ 0.31 mg/kg으로 하였다.
4-2. 실험결과
(LB 군) 티라민 및 히스티민 함량은 발효 중 점차 감소하였다. 카다베린 및 스페르민 함량 역시 약간 감소한 반면, 퓨트레신 및 스페르미딘 함량은 발효기간 동안 통계적으로 유의하게 약간 증가하였다. 발효기간 종료 시점의 6 가지 BA의 함량은 대부분 C 군 및 PC 군 보다 현저하게 낮게 나타났다. 특히, 티라민 함량은 C 군 및 PC 군과 비교하여 각각 66.65% 및 81.89% 감소하였다.
(C 군 및 PC 군) C 군의 경우 티라민, 퓨트레신, 카다베린, 스페르미딘 및 스페르민 함량은 발효 1일차에서 3일차 사이에 지속적으로 증가한 반면, 히스타민 함량은 발효기간 내내 꾸준히 감소하였다. 발효 3일차에 C 군 내 5개 BA의 함량 증가는 대부분의 실험군 중 가장 높았으나, 히스타민 함량의 감소는 접종군과 유사하였다. PC 군의 경우 티라민, 퓨트레신, 카다베린 및 스페르미딘 함량은 발효기간 동안 꾸준히 증가한 반면, 히스타민 및 스페르민 함량은 점차 감소하였다. 발효 3일차에 상기 증가된 4개의 BA 중 티라민 함량(104.74 ± 3.04 mg/kg)은 다른 군 보다 2배 이상 높았으며, 종래 보고된 티라민의 유해 수준(100 mg/kg)을 초과하였다.
실시예 5. MCO(multicopper oxidase)를 암호화하는 유전자 확인
MCO는 BA 분해를 담당하는 효소를 암호화하는 유전자로 알려져 있다. 이에, 상기 실시예 1의 BA 분해 결과를 기반으로, 가장 높은 BA 분해 활성을 나타낸 균주인 L. brevis PK08이 MCO 유전자를 보유하는지 여부를 확인하였다. 참조 균주로는 L. brevis JCM 1170, L. brevis PK11을 사용하였다.
구체적으로, L. brevis에 대한 MCO 유전자의 DNA 서열을 국립 생명공학 정보 센터(NCBI)에서 검색 후 NCBI Primer-BLAST를 사용하여 프라이머 세트, Lbre-F(5'-TGCCCGTTACGTGAGACTAC-3', 서열번호 4) 및 Lbre-R(5'-GACTTGTGCTGAACGTGCTG-3', 서열번호 5)를 설계하였다. PCR 증폭된 DNA 단편의 길이는 390 bp였다. 이후 G-spinTM genomic DNA 추출키트(Intron Biotechnology, Inc., Korea)를 이용하여 세균 배양액에서 게놈 DNA를 추출하였다. 50 μL PCR 반응 혼합물은 탈이온수 중 각 10 pM 프라이머 1.5 μL, Ex Taq DNA 중합효소 0.25 μL(5.0 units/μL; Takara Biotechnology Co. Ltd., Japan), 10X Ex Taq 버퍼 5 μL, dNTP(각 0.2 mM; Takara) 4 μL 및 200 ng 게놈 DNA 37.75 μL를 포함하였고, PCR 증폭은 thermal cycler(DNA Engine Peltier T100 thermal cycler, Bio-Rad Laboratories, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 1분 초기 변성 후 94℃에서 30초 변성, 54℃에서 40초 어닐링, 72℃에서 1분 확장, 72℃에서 5분간 최종 연장을 30회 반복하였다.
PCR 산물은 브롬화 에티듐(ethidium bromide)(0.5 g/mL, Sigma-Aldrich)이 포함된 0.5X Tris-borate-EDTA 완충액(TBE; Bio Basic, Canada) 중 아가로스 겔(1.2%, w/v; Duchefa Biochemie, Netherlands)에서 100V, 30분 동안 전기영동되었다. 1kb DNA Ladder(Elpis Biotech, Korea)를 사이즈 메이커(size marker)로 사용하였다. 겔을 자외선 하에서 투과조명기(SMU-01 Slider UV Imager; Maestrogen Inc., Taiwan)로 시각화하고 촬영하였다. 또한, 염기서열을 분석하고 기본 로컬 정렬 검색 도구를 사용하여 GenBank 데이터베이스에서 사용할 수 있는 L. brevis의 MCO 유전자와 비교하였다.
그 결과, 도 4에서 확인할 수 있듯이, L. brevis PK08 균주에서 MCO 유전자가 검출되었으며, 검출된 유전자의 서열은 L. brevis MCO 유전자(수탁번호 CP031208.1)와 높은 수준의 동일성(99% 이상)을 나타내었다.
[통계분석]
모든 이화학적 측정은 3회씩 수행하였으며, 미생물학적 측정은 2회씩 수행하였다. 김치 발효 실험은 독립적으로 2회씩 수행하였다. 데이터는 2회 또는 3회의 평균 및 표준 편차로 나타내었다. 모든 플롯의 오차 막대는 2회 발효 실험으로부터 측정된 표준 편차를 나타낸다. 유의미한 차이의 결정은 Minitab 통계 소프트웨어(Version 17.1.0. Minitab Inc., State College, PA, USA) 내 Fisher's pairwise 비교를 이용한 ANOVA를 통해 수행되었으며, 확률(p) 값 <0.05의 차이는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
[결과]
선별된 본 발명의 5개의 LAB(lactic acid bacteria) 균주 PK08, PK05, YM20, KD15 및 YM21은 우수한 BA 분해 활성을 나타내고(상기 실시예 1 참조), 이를 이용한 배추김치의 숙성 수준은 LAB 균주의 접종이 산도에 어떠한 영향을 미치는 지에 따라 달라지며(상기 실시예 3 참조), 특히 가장 우수한 BA 분해 활성을 나타낸 L. brevis PK08 균주에서는 MCO(multicopper oxidase) 유전자의 검출도 확인하였는 바, 본 발명의 LAB 균주를 스타터 및/또는 보호 배양물로 사용하여 김치 발효를 제어하는 경우 결과물의 BA 함량을 감소시킴으로써 김치의 BA 관련 안전성을 향상시킬 수 있을 뿐만 아니라 원하는 시간에 바람직한 수준의 숙성도 달성할 수 있을 것으로 기대된다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC: Korean Collection for Type Cultures) KCTC15149BP 20221021

Claims (8)

  1. 바이오제닉 아민(Biogenic amine, BA) 분해 효과를 가지는 레비락토바실러스 브레비스(Levilactobacillus brevis) PK08 균주(수탁번호 KCTC 15149BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 바이오제닉 아민은 티라민(Tyramine), 히스타민(Histamine), 카다베린(Cadaverine), 퓨트레신(Putrescine), 스페르민(Spermine), 및 스페르미딘(Spermidine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인, 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주.
  4. 제1항의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 식품 첨가용 미생물 제제.
  5. 제4항의 미생물 제제를 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 식품 첨가물.
  6. 제4항의 미생물 제제를 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 발효식품 유해 인자 제어 방법.
  7. 제1항의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 미생물 스타터.
  8. 제1항의 레비락토바실러스 브레비스 PK08 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 유효성분으로 포함하는, 바이오제닉 아민 분해 또는 저감용 조성물.
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US20170251710A1 (en) 2014-08-22 2017-09-07 Atogen Co., Ltd. Lactobacillus plantarum hac01 strain having anti-inflammatory efficacy and metabolic disease alleviating efficacy and use thereof

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