KR102231483B1

KR102231483B1 - 바실러스 세레우스 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주

Info

Publication number: KR102231483B1
Application number: KR1020190146880A
Authority: KR
Inventors: 최인실; 박태순; 김진선; 김문석; 최용호; 이생재
Original assignee: 샘표식품 주식회사
Priority date: 2019-11-15
Filing date: 2019-11-15
Publication date: 2021-03-24

Abstract

본 명세서에는 바실러스 세레우스 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 대두 발효물이 개시된다. 일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 식중독균인 바실러스 세레우스 생육 저해력을 가진다. 일반적으로 장류 제품인 대두 발효물 등의 제조 중에 바실러스 세레우스의 밀도가 증가하는 바, 일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스를 대두 발효물 등의 제조 과정 중에 처리하여 보다 위생적이고 안전한 대두 발효물 등을 제조할 수 있다는 이점이 있다. 더욱이, 일 측면에서 상기 제조는 대량으로 이루어질 수 있다는 이점이 있다.

Description

바실러스 세레우스 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주{Leuconostoc mesenteroides with growth inhibition of bacillus cereus}

본 명세서에는 바실러스 세레우스 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주, 이를 포함하는 미생물 제제 및 이를 이용한 대두 발효물이 개시된다.

된장은 한식된장의 개량식 된장이라고도 하며 해방 후 일본 장류 공장을 접수 하여 상품용 장류를 제조하여 판매한 것에서부터 시작하여 전통적인 맛과 향을 지닌 한식된장 (전통 재래식 된장)에서 주로 밀가루나 밀쌀, 쌀, 보리와 같은 탄수 화물 원료에 종국 (mold starter)인 아스퍼질러스 오리재 (A. oryzae)를 접종하여 발효한 개량메주에 증자 한 콩을 첨가하여 제조하는 일본된장인 미소를 제조하는 방법을 기본으로 하고 있으며 한식과 일본식의 혼합형도 연구되고 있다.

최근에는 한식된장의 맛에 가깝도록 일본의 미소된장과 같이 밀가루나 쌀이 아닌 콩을 주원료로 하고 고초균 (Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis 등)을 증자한 콩알에 접종하여 발효한 콩알메주를 만들어 함께 사용하는 한식된장 제조방법을 접목한 방법의 개량식 콩된장이 우리나라 장류를 대표하는 회사인 샘표식품에서 개발되어 시판되고 있다.

된장은 주로 전분질원인 밀가루에 종국인 아스퍼질러스 오리재를 접종하여 소맥분 메주를 만들고 여기에 증자콩과 소금물을 일정비율로 첨가하여 숙성하여 제조하는 소맥분 된장과 단백질원인 콩에 종국인 아스퍼질러스 오리재를 접종하여 콩알메주를 만들고, 콩알메주와 소금물을 일정비율로 첨가한 뒤 숙성하여 보다 한식 된장에 가까운 향미를 가지는 콩된장으로 나뉠 수 있다.

이때, 증자콩은 50 %의 높은 수분을 갖고 성분적으로도 고초균, 바실러스 세레우스 (B. cereus) 등 바실러스 종의 균이 증식하기 좋은 조건으로 콩알 상태로 제국하면 바실러스 종 균의 침해가 심하여 국균 아스퍼질러스 오리재가 생육하지 못하며 pH 상승, 암모니아 발생, 메주의 점조성 증가 등으로 양질의 콩알메주 (콩코지)를 얻을 수 없다. 그래서 국균 아스퍼질러스 오리재를 이용한 콩알메주 발효 (제국)와 바실러스 종 균을 이용한 콩알메주 발효 (제국)는 분리되어 이루어지거나 아스퍼질러스 오리재를 이용한 콩알메주 제국시 제국 과정에 오염 식중독균 바실러스 세레우스를 비롯한 바실러스 종 균의 오염을 방지할 수 있는 방안의 연구 및 적용이 필요하다.

이와 관련하여, 우리나라 식품의약품안전처에서는 2006년과 2011년 '식품의 기준 및 규격' 개정을 통해 '장류'에서 각각 식중독균 '바실러스 세레우스' 와 '클로스트리듐 페르프린젠스 (Clostridium perfringens)' 에 대한 기준 규격을 정하고 있으며 특히 장류의 '바실러스 세레우스' 기준을 g당 10,000 이하 (메주 제외, 멸균 제품은 음성이어야 함.)로 정하고 이를 위반할 경우 높은 행정처분 (식중독균 또는 엔테로박터 사카자키균 검출기준을 위반한 것: 1차 위반시 품목류 제조 정지 및 해당 제품 폐기)을 통해 우리나라 국민 다소비 식품 장류의 위생적 제조 및 품질관리를 요구하고 있다.

미국 CFSAN (The Center for Food Safety and Applied Nutrition) 및 캐나다 (Government of Canada Laboratory Procedure)에서 10⁶ CFU/g 에서 바실러스 세레우스의 장독소 생성 위험성을, 미국 USDA (United States Department of Agriculture)는 10⁶ CFU/g 에서 식중독 위험을, 호주와 뉴질랜드의 Food standards는 1.2Ⅹ³~10⁶ CFU/g 수준에서 발병 가능성을 제시하고 있어 정부마다 위험 설정 기준에는 차이가 있지만 식품에서의 바실러스 세레우스 관리 필요성을 같이 하고 있다.

이러한 상황에서, 본 발명자들은 된장 내 바실러스 세레우스 균을 저감화하고자 다양한 연구를 진행하던 중, 신규하게 발견한 류코노스톡 메센테로이데스가 바실러스 세레우스 균을 억제함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

KR 등록특허공보 제10-0298490호 (2001.05.31.)

대한민국식품의약품안전처. 고시 2018-54. 식품의 기준 및 규격

일 측면에서, 본 개시의 목적은 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) 균주, 이를 포함하는 미생물 제제, 이를 이용한 대두 발효물 및 상기 대두 발효물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 과제를 달성하기 위하여, 일 측면에서 본 개시는 바실러스 세레우스의 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 제공한다.

일 측면에서 본 개시는 상기 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제를 제공한다.

일 측면에서 본 개시는 대두 발효물로서, 상기 대두 발효물은 대두 미생물 발효물이고, 상기 미생물은 상기 미생물 제제를 포함하는 것인, 대두 발효물을 제공한다.

일 측면에서 본 개시는 대두에 상기 미생물 제제를 처리하는 단계; 및 상기 대두에 처리한 미생물 제제를 배양하는 단계;를 포함하는, 상기 대두 발효물의 제조 방법을 제공한다.

일 측면에서 본 개시는 상기 대두 발효물; 물; 및 식염;을 포함하는 조성물의 발효물 및 이의 제조방법을 제공한다.

일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 식중독균인 바실러스 세레우스 생육 저해력을 가진다. 일반적으로 장류 제품인 대두 발효물 등의 제조 중에 바실러스 세레우스의 밀도가 증가하는 바, 일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스를 대두 발효물 등의 제조 과정 중에 처리하여 보다 위생적이고 안전한 대두 발효물 등을 제조할 수 있다는 이점이 있다. 더욱이, 일 측면에서 상기 제조는 대량으로 이루어질 수 있다는 이점이 있다.

도 1은 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주의 바실러스 세레우스 생육 저해력을 확인한 결과를 나타내는 도이다.
도 2는 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주의 16S rRNA 서열을 나타내는 도이다.
도 3은 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주의 유전학적 동정 결과로 작성한 계통도를 나타내는 도이다.
도 4는 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주의 생화학적 동정을 위하여 상기 균주에 50 CHL 키트를 수행한 결과를 나타내는 도이다.
도 5는 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 처리한 콩된장 제조(발효)를 진행한 과정을 도식화하여 나타낸 도이다.
도 6은 본 개시의 lab scale로 발효한 콩알메주의 외관을 관찰한 결과를 나타내는 도이다.
도 7은 본 개시의 pilot scale로 발효한 콩알메주의 외관을 관찰한 결과를 나타내는 도이다.
도 8은 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 처리한 콩된장 내 휘발성 화합물을 검출한 결과를 나타내는 도이다.
도 9는 콩알메주와 콩된장의 발효에 따른 균의 종 변화를 나타내는 도이다.

이하, 상세히 설명한다.

일 측면에서 본 개시는 바실러스 세레우스의 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 제공한다.

일 측면에서 배지에 상기 바실러스 세레우스를 도말한 다음, 상기 류코노스톡 메센테로이데스의 배양액을 20 μl로 분주한 후 30℃에서 24시간 동안 배양할 때 생성되는 생육저지원 (clear zone)의 지름이 16 mm 이상, 17 mm 이상, 18 mm 이상, 19 mm 이상, 20 mm 이상, 21 mm 이상, 22 mm 이하, 23 mm 이하, 24 mm 이하, 25 mm 이하, 26 mm 이하일 수 있다.

일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 pH 4 이상, 5 이상, 6 이상, 6.5 이상, 7 이하, 8 이하의 조건에서 생육이 가능한 균주일 수 있다.

일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 10 이상, 11 이상, 12 이상, 13 이상, 14 이상, 15 이상, 16 이상, 17 이상, 18 이상, 19 이상, 20 이상, 21 이상, 22 이상, 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 27 이상, 28 이상, 29 이상, 30 이상, 31 이하, 32 이하, 33 이하, 34 이하, 35 이하, 36 이하, 37 이하, 38 이하, 39 이하, 40 이하 ℃일 수 있고, 바람직하게는 25℃ 내지 35℃인 온도에서 생육이 가능한 균주일 수 있다.

일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 배지에 선조접종 (streaking)한 후 37℃에서 21시간 동안 배양될 때 생성되는 바이오제닉 아민의 함량은 0.5 미만, 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하, 0.1 이하 mg/kg일 수 있다. 일례로 상기 바이오제닉 아민은 히스타민 및 티라민 중 하나 이상일 수 있다.

일 측면에서 상기 균주는 류코노스톡 메센테로이데스 SMB 742일 수 있다.

일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 기탁번호가 KCCM12605P인 균주일 수 있다.

일 측면에서 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 그람 양성균일 수 있고, 바람직하게는 구균일 수 있다. 일례로 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주는 운동성이 없는 균일 수 있다.

일 측면에서 상기 발효물은 상기 균주, 이의 파쇄물 또는 이의 배양물을 발효한 물질일 수 있다.

일 측면에서, 상기 파쇄물, 배양물, 발효물 또는 추출물은, 제균된 것을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양물은, 배양물을 원심분리하여 얻은 상등액을 포함할 수 있다.

일 측면에서 본 개시는 대두 발효물로서, 상기 대두 발효물은 대두 미생물 발효물이고, 상기 미생물은 본 개시의 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 포함하는 것인, 대두 발효물을 제공한다. 일례로 상기 미생물은 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 더 포함할 수 있고, 바람직하게는 아스퍼질러스 오리재 RIB 40(Aspergillus oryzae RIB 40)을 더 포함할 수 있다.

일 측면에서 상기 대두 발효물은 대두에 상기 균주를 포함하는 미생물을 접종 발효하여 수득한 산물을 의미하는 것이다. 일례로 상기 대두는 증자대두일 수 있다. 일 측면에서 상기 증자대두는 50 %(v/v) 이상의 수분 함량을 가지는 대두이다.

일 측면에서 상기 대두 발효물은 메주이고, 바람직하게 콩알메주일 수 있다.

일 측면에서 상기 대두 발효물 내 바실러스 세레우스는 대두 발효물 전체 중량에 대하여 10⁴ 미만, 9Ⅹ10³이하, 8.5Ⅹ10³이하, 8Ⅹ10³이하, 7.5Ⅹ10³이하, 7Ⅹ10³이하, 6.5Ⅹ10³이하, 6Ⅹ10³이하, 5.5Ⅹ10³이하, 5Ⅹ10³이하, 4.5Ⅹ10³이하, 4Ⅹ10³이하, 3.5Ⅹ10³이하, 3Ⅹ10³이하, 2.5Ⅹ10³이하, 2Ⅹ10³이하, 1.5Ⅹ10³ 이하 CFU/g 밀도로 존재하는 것이다.

일 측면에서 상기 대두 발효물은 pH 값이 5.5 이상, 6 이상, 6.5 이하, 7 이하일 수 있다.

일 측면에서 상기 대두 발효물의 수분함량은 40 이상, 41 이상, 42 이상, 43 이상, 44 이하, 45 이하, 46 이하, 47 이하 중량%일 수 있다.

일 측면에서 상기 대두 발효물의 단백질 분해효소 분해 활성도는 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이하, 100 이하, 110 이하 unit일 수 있다. 일례로 상기 활성도 (unit)는 1분 동안 tyrosine 1 ㎍에 상당하는 비단백성 물질을 유리시키는 효소량를 의미한다.

일 측면에서 상기 대두 발효물 내 바이오제닉 아민 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 8 이하, 7 이하, 6 이하, 5 이하, 4 이하, 3 이하, 2 이하, 1 이하, 0.1 이하, 0.000000001 이하 mg/kg일 수 있다.

일 측면에서 상기 대두 발효물 내 젖산(lactic acid)의 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 200 이상, 300 이상, 400 이상, 500 이상, 600 이상, 700 이상, 800 이상, 900 이상, 1000 이하, 1100 이하, 1200 이하, 1300 이하, 1400 이하, 1500 이하, 1600 이하, 1700 이하, 1800 이하, 1900 이하, 2000 이하 mg/kg일 수 있다.

일 측면에서 상기 대두 발효물 내 p-글루타민산(p-glutamic acid)의 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 10 이상, 12 이상, 14 이상, 16 이상, 18 이상, 20 이상, 22 이상, 24 이상, 26 이상, 28 이상, 30 이상, 32 이하, 34 이하, 36 이하, 38 이하, 40 이하, 42 이하, 44 이하, 46 이하, 48 이하, 50 이하, 52 이하, 54 이하, 56 이하, 58 이하, 60 이하, 62 이하, 64 이하, 66 이하, 68 이하, 70 이하, 72 이하, 74 이하, 75 이하 mg/kg일 수 있다.

일 측면에서 본 개시는 상기 대두에 상기 미생물 제제를 처리하는 단계; 및 상기 대두에 처리한 미생물 제제를 배양하는 단계;를 포함하는 상기 대두 발효물의 제조방법을 제공한다.

일 측면에서 상기 방법은 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주 처리 후 상기 류코노스톡 메센테로이데스 균주를 배양하는 단계를 더 포함하고, 상기 배양하는 단계는 20시간 초과, 21시간 이상, 22시간 이상, 23시간 이상, 24시간 이상, 25시간 이상, 26시간 이상, 27시간 이상, 28시간 이상, 29시간 이상, 30시간 이상, 31시간 이상, 32시간 이상, 33시간 이상, 34시간 이상, 35시간 이상, 36시간 이상, 37시간 이상, 38시간 이상, 39시간 이상, 40시간 이상, 41시간 이상, 42시간 이상, 43시간 이상, 44시간 이상, 45시간 이상 또는 60시간 이하 동안, 바람직하게는 39 내지 41 시간 동안 수행하는 것일 수 있다. 더욱이, 일례로 배양은 23 이상, 24 이상, 25 이상, 26 이상, 27 이상, 28이상, 29 이하, 30 이하, 31 이하, 32 이하 ℃, 바람직하게는 25 내지 30 ℃ 하에서 수행될 수 있다.

일 측면에 있어서 상기 미생물 제제는 대두 전체 중량에 대하여 10~10³ CFU/g 양, 바람직하게는 10² CFU/g 양으로 처리할 수 있다.

일 측면에 있어서 상기 방법은 상기 배양하는 단계 전에 대두에 아스퍼질러스 오리재를 처리하는 단계;를 더 포함할 수 있다. 일례로 상기 아스퍼질러스 오리재는 대두 전체 중량에 대하여 10³~10⁴ CFU/g 양, 바람직하게는 10⁵ CFU/g 양으로 처리할 수 있다.

일 측면에서 본 개시는 상기 대두 발효물; 물; 및 식염;을 포함하는 조성물의 발효물을 제공한다.

일 측면에서 상기 조성물의 발효물은 된장일 수 있고, 바람직하게는 콩된장일 수 있다.

일 측면에서 상기 조성물의 발효물 내 바실러스 세레우스는 상기 발효물 전체 중량에 대하여 10⁴ 미만, 9Ⅹ10³이하, 8.5Ⅹ10³이하, 8Ⅹ10³이하, 7.5Ⅹ10³이하, 7Ⅹ10³이하, 6.5Ⅹ10³이하, 6Ⅹ10³이하, 5.5Ⅹ10³이하, 5Ⅹ10³이하, 4.5Ⅹ10³이하, 4Ⅹ10³이하, 3.5Ⅹ10³이하, 3Ⅹ10³이하, 2.5Ⅹ10³이하, 2Ⅹ10³이하, 1.5Ⅹ10³ 이하, 1.5Ⅹ10³ 이하, 1.4Ⅹ10³ 이하, 1.3Ⅹ10³ 이하, 1.2Ⅹ10³ 이하, 1.1Ⅹ10³ 이하 CFU/g 밀도로 존재하는 것이다.

일 측면에서 상기 대두 발효물 내 젖산(lactic acid)의 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 1 이하, 0.9 이하, 0.8 이하, 0.7 이하, 0.6 이하, 0.5 이하, 0.4 이하, 0.3 이하, 0.2 이하, 0.1 이하, 0.000000001 이하 mg/kg일 수 있다.

일 측면에서 상기 대두 발효물 내 p-글루타민산(p-glutamic acid)의 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 25 이상, 30 이상, 40 이상, 50 이상, 60 이상, 70 이상, 80 이상, 90 이상, 100 이상, 150 이상, 200 이하, 250 이하, 300 이하, 350 이하, 400 이하, 450 이하, 500 이하, 550 이하, 600 이하, 650 이하, 700 이하, 750 이하, 800 이하 mg/kg일 수 있다.

일 측면에서 상기 조성물의 발효물은 하기 휘발성 화합물 중 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다: 2-메틸-에틸에스터 프로피온산(Propanoic acid, 2-methyl, ethyl ester); (S)-2-메틸-1-부탄올(1-Butanol, 2-methyl-, (S)-); 1-옥텐-3-올(1-Octen-3-ol); 디히드록-5-펜틸-2(3H)-푸라논(2(3H)-Furanone, dihydro-5-pentyl-); 및 올레익산(Oleic acid).

일 측면에서 본 개시는 상기 대두 발효물; 물; 및 식염;을 포함하는 조성물을 발효하는 단계;를 포함하는, 상기 조성물의 발효물을 제조하는 방법을 제공할 수 있다.

일 측면에서 상기 조성물 내 수분(물) 함량은 47 이상, 48 이상, 49 이상, 50 이상, 51 이상, 52 이상, 53 이하, 54 이하, 55 이하, 56 이하, 57 이하, 58 이하 중량%일 수 있다.

일 측면에서 상기 조성물 내 염도는 전체 조성물 중량에 대하여 5 이상, 6 이상, 7 이상, 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 11.5 이상, 12 이하, 13 이하, 14 이하, 15 이하, 16 이하, 17 이하, 18 이하 중량%일 수 있다.

일 측면에서 상기 조성물은 대두를 고초균을 포함하는 미생물로 발효한 대두 발효물(이하, 대두 고초균 발효물로 지칭)을 더 포함할 수 있다. 일례로, 상기 고초균은 고초균 KCTC 3135 (Bacillus subtilis KCTC 3135)일 수 있다. 일 측면에서 상기 대두 발효물 1에 상기 대두 고초균 발효물을 0.8 이상, 0.9 이상, 1 이상, 1.1 이하, 1.2 이하, 1.3 이하의 중량 비율로 수행할 수 있고, 바람직하게는 상기 대두 발효물 대 대두 고초균 발효물의 비율은 1 : 0.9~1.1 비율로 혼합하는 것일 수 있다. 일 측면에서 상기 대두 고초균 발효물은 대두 전체 중량에 대하여 0.01 이상, 0.02 이상, 0.03 이상, 0.04 이상, 0.05 이하, 0.06 이하, 0.07 이하, 0.08 이하, 0.09 이하, 0.1 이하 중량%, 바람직하게는 0.03 내지 0.05 중량%로 고초균을 접종한 후 48℃에서 24시간 동안 발효한 발효물일 수 있다.

일 측면에서 상기 발효하는 단계는 25일 이상, 26일 이상, 27일 이상, 28일 이상, 29일 이상, 30일 이상, 31일 이하, 32일 이하, 33일 이하, 34일 이하, 35일 이하 동안, 바람직하게는 29일 내지 31일 동안 수행하는 것일 수 있다. 더욱이, 일례로 상기 발효는 28이상, 29 이하, 30 이하, 31 이하, 32 이하 ℃, 바람직하게는 29 내지 31 ℃ 하에서 수행될 수 있다.

중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생락하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 개시가 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다. 또한, 본 명세서 내에서 사용된 '또는'은 명확하게 반대하는 내용을 명시하고 있지 않는 한, '및'을 포함하는 개념이다.

이하, 본 개시의 이해를 돕기 위하여 실시예 및 실험예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 및 실험예는 본 개시의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 개시의 범위가 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다. 본 개시의 실시예 및 실험예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 개시를 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 바실러스 세레우스 ( Bacillus cereus ) 생육저해력을 가진 균의 분리 및 특성 조사

1-1. 바실러스 세레우스 생육저해력을 가진 균의 분리

대한민국 전역에서 무작위로 수집한 전통 사각메주 15개, 전통 수공된장 20개 각각을 준비하였다. 준비된 전통 사각메주의 정중앙 코어부 (혐기적 조건에서 일부 분리)와 전통 수공된장을 0.85 %(v/v) 멸균 생리식염수에 균질한 후 하기 표 1 구성의 BCP plate count agar에 도말하여 35~37 ℃에서 48~72±3 시간 동안 호기 또는 혐기 배양한 후 발생한 전형적인 유산균 집락, 즉 노란색으로 변색된 균의 집락을 분리하고, 이 후 이 집락을 하기 표 1 구성의 Lactobacilli MRS agar에 동일 배양 조건으로 순수 분리한 후 동일 배지에 도말하여 배양하였다. 충분히 배양한 다음 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 API 50CHL 배지를 통한 간이 동정으로 유산균을 구분하고 확인 하였다.

Lactobacilli MRS Broth	Proteose peptone No.3	10 g
	Beef extract	10 g
	Yeast extract	5 g
	Dextrose	20 g
	Polysorbate 80	1 g
	Ammonium citrate	12 g
	Sodium acetate	5 g
	Magnesium sulfate	5 g
	Manganese sulfate	0.1 g
	Dipotassium phosphate	2 g
	최종 pH 6.3~6.7

1-2. 분리된 균의 바실러스 세레우스 생육 저해 활성 확인

상기 실시예 1-1에서 분리한 균을 상기 표 1 구성의 Lactobacilli MRS broth에서 진탕 배양(shaking incubator, 30 ℃, 48 시간 동안 150 rpm 속도로 교반)한 다음, 그 배양액을 원심분리(0 ℃ 조건에서 2,500 g, 20 분 동안 수행)하여 상등액을 분리하고 1N NaOH로 pH를 7.0으로 조정하여 준비하였다. 그리고 나서 순수 분리하여 0.85 % 멸균 생리식염수로 현탁한 표준 균주인 바실러스 세레우스 (KCTC3624) 균주를 하기 표 2 구성의 Nutrient agar에 균일하게 도말한 다음 멸균된 항균 테스트용 페이퍼 디스크 (Φ 6 mm, 두께 1 mm/Advantec사)를 놓고 pH를 7.0으로 조정한 유산균 배양상등액 20 ㎕를 적신 다음 30 ℃에서 24시간 배양하여 바실러스 세레우스의 생육 저해환의 직경을 측정 하였다.

NA (Nutrient Agar)	Beef extract	3g
	Peptone	5g
	Agar	15g
	최종 pH 6.6~7.0

1-3. 분리된 균의 기타 생육 특성 확인

1) 외형 관찰

상기 실시예 1-1에서 분리한 균에 대하여 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방식으로 그람 염색 후 광학현미경 (1,000~1,500 배율)으로 관찰하여 해당 균의 형태를 구분하였다.

2) 생육 적온

상기 표 1의 Lactobacilli MRS broth에 실시예 1-1에서 분리한 균주를 접종하여 온도별 (10~45℃)로 배양한 후 배양액의 균수 변화를 조사 하였다.

3) 생육 적정 pH

제조시 pH 를 조절한 Lactobacilli MRS broth(상기 표 1 참조)에 실시예 1-1에서 분리한 균주를 1 %(vol/vol) 또는 2 %(vol/vol)으로 접종하여 35 ℃에서 72 시간 배양한 후 배양액의 균수 변화를 조사하였다.

4) 운동성

실시예 1-1에서 분리한 균주를 Motility test medium (하기 표 3 참조)을 이용하여 천자 배양한 후 육안으로 해당 균주의 운동성 여부를 조사 하였다.

Motility test medium	Beef extract	3g
	Pancreatic digest of gelatin	10g
	Sodium chloride	5g
	Agar	4g
	최종 pH 7.1~7.5

5) 바이오제닉 아민(Biogenic amine) 생성능 및 분해능

실시예 1-1에서 분리한 균주가 바이오제닉 아민을 합성하는지, 합성한다면 그 함량이 어느 정도인지를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다. 구체적으로 균주의 바이오제닉 아민 생산 유무를 확인하기 위하여 바이오제닉 아민의 전구물질인 아미노산 (티로신, 히스티딘)과 pH indicator인 크레졸 레드 (cresol red)가 함유된 BA 생성 배지(하기 표 1 참조)에 균을 선조접종 (streaking)한 후 37 ℃ 에서 21시간 동안 배양하고 색의 변화가 없는지 여부를 확인하였다. 그리고 나서, 균주의 바이오제닉 아민 분해 유무를 확인하기 위하여 분리된 균주를 다시 배지 안의 탄소원이 바이오제닉 아민 (히스타민, 티라민)으로 치환된 BA 분해배지(하기 표 1 참조)에 선조접종하고 37 ℃에서 21시간 동안 배양 후 증식활성을 갖는지 여부를 확인하였다.

1-3. 결과

바실러스 세레우스 생육저해력을 가진 균을 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 (Leuconostoc mesenteroides SMB742)라 명명하고, 이의 생육 특성을 확인한 결과는 다음의 표 1에 나타내었다. 그 중 해당 균의 바실러스 세레우스 생육 저해 활성을 확인한 결과는 도 1에 나타내었다.

유래	전통 장
전체 표본(분리체들)	20 (39)
바실러스 세레우스(KCTC3624)의 억제환 직경 (Φ mm)	21
그람 염색/모양	양성/Coccus
운동성	없음
성장 pH 범위 (최적 pH)	4.0~8.0 (6.5)
성장 온도 범위 (최적 ℃)	10~40 (30)
바이오제닉 아민 생산 (mg/kg)	< 0.5 (미비함)

실시예 2. 바실러스 세레우스 생육저해력을 가진 균의 유전학적 및 생화학적 동정

2-1. 유전학적 동정

상기 실시예 1을 통하여 분리한 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 균주를 유전학적으로 동정하기 위하여, 프라이머를 사용하여 16S rDNA(서열번호 4, 도 2)에 대하여 universal primer인 27F(5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3', 서열번호 5)와 1429R(5'-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3', 서열번호 6)로 PCR을 수행하여 해당 서열을 증폭시켰다. 그리고 나서, WizardDNA 정제 키트를 이용하여 상기 서열들을 정제하고, 솔젠트㈜(대전)에 염기서열의 분석을 의뢰하였다. 이를 토대로 NCBI Blast와 EzTaxon server 2.1(Jongsik Chun)에서 공지된 서열들과의 상동성 비교를 통해 동정한 결과, 상기 선별된 균주는 류코노스톡 메센테로이데스 subsp. Jonggajibkimchii DRC 1506과 높은 상동성을 보임을 확인하였다.

이후, EzTaxon server 2.1(Jongsik Chun)에서 선별 균주와 유사한 균주들의 16S rRNA 정보를 메가 프로그램(MEGA program)을 이용하여 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 보정한 후 Neighbor joining 방법을 사용하여 계통도를 작성하였다. 그 결과로 작성한 계통도는 도 3에 나타내었다.

2-2. 생화학적 동정

상기 실시예 1을 통하여 분리한 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 균주를 생화학적으로 동정하기 위하여, 상기 실시예 1-1을 통하여 분리한 미생물들에 대하여 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 방법으로 API kit(50 CHL)를 이용하여 30℃ 및 호기성 조건에서 24시간 동안 배양하여 당 분해 활성을 확인하였다. 이때, 당 분해 활성은 류코노스톡 메센테로이데스 KCCM 43249 및 KCTC 3505와 비교하여 수행하였다. 그 결과는 도 4에 나타내고, 양성은 +, 약하게 양성은 W(weak), 음성은 -로 나타내었다.

상기 일련의 과정을 통하여 동정한 균은 종래의 류코노스톡 메센테로이데스 균주와는 상이한 신규한 균주임을 확인하였다. 상기 균은 2019년 10월 11일자로 기탁기관인 한국미생물보존센터에 기탁번호 KCCM12605P로 기탁하였다.

실시예 3. 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리시 콩알메주 또는 콩된장 발효 중 바실러스 세레우스 저감화 효과 확인

3-1. 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742를 처리한 콩알메주 및 콩된장 발효

lab scale (1.5 kg)로 발효를 진행하고 이와 독립적으로 pilot scale (50 kg)로 발효량을 확대하여 콩알메주 발효를 실시하였다.

구체적으로, 이물, 이종 곡물 등을 정선한 수입산 대두 (2017.05~2018.10 미국산 대두, Soybeans(with yellow testa))를 지하수에 2.5시간 침지한 후 물기를 자연 여과방식으로 제거한 다음 500 mL 삼각플라스크에 대두원물 기준 100 g으로 중량을 동일하게 하여 약 3시간 동안 침지 대두를 담은 후 autoclave에서 멸균 (121 ℃, 15분, 0.6~1.0 kgf/cm²)한 후 냉각시킨 멸균 증자대두를 lab scale의 콩알메주 발효 배지로 사용하였다. lab scale 발효를 위한 발효기는 양산형 콩알메주 발효기의 구조를 단순화한 형태로 2.5 kg 용량의 뚜껑이 있고 용기 하단부에 채반이 있어 1.5~2.0 kg의 증자콩을 간단히 발효할 수 있는 용도의 스테인레스 재질 상자 발효기를 사용하였다.

국균인 아스퍼질러스 오리재 RIB 40(Aspergillus oryzae RIB 40, 당업자에게 잘 알려져 있는 균으로 RIB40 대신 KCTC 6964, KCTC 1699, ATCC 42149, BCRC 30434, NBRC 100959, NRRL 5590, JCM 13832로도 알려진 균임)는 사용 대두량의 0.38 %, 바실러스 세레우스 KCTC3624는 증자 대두량의 10² CFU/g으로, 유산균주인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742는 증자 대두량의 10⁵ CFU/g으로 콩알메주 발효시작 전에 접종하였다. 대조군 (무처리)에는 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742는 제외하고 아스퍼질러스 오리재 RIB 40과 바실러스 세레우스 KCTC3624만을 접종하였다. 이때 실험군과 대조군 각각에 바실러스 세레우스를 접종한 이유는 해당 균이 오염된 상황을 만들어주기 위함이다. 그리고 나서, 균주를 실험 조건별로 처리한 후 증자대두 중심부에 온도센서를 꽂아 품온 기준으로 40시간 동안 온도 조건을 조절(24시간 동안 30 ℃조건, 16시간 동안 25 ℃ 조건)하여 발효하여 콩알메주를 제조하였다.

이와 독립적으로 상기에서 기술한 조건과 동일한 조건 하에 pilot 발효기(송풍량, 송풍온도를 자동 조절하여 발효 품온을 조절할 수 있도록 양산형 메주 발효기(제국기)의 구조를 그대로 축소시킨 형태로 설계되어 150 kg의 증자콩을 콩알메주로 발효할 수 있는 발효기)를 이용하여 pilot scale 발효를 수행하였고, 대조군과 실험군 간 발효물이 혼재되지 않도록 분할 판을 설치하여 50 kg씩 분할 발효하여 콩알메주를 제조하였다.

그리고 나서 lab scale과 pilot scale로 발효하여 제조한 각 콩알메주를 콩된장으로 제조하기 위하여, 먼저 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 발효 콩알메주와 대두량의 0.04%(w/w)로 고초균 KCTC 3135 (Bacillus subtilis KCTC 3135)을 접종한 후 48℃에서 24시간 동안 발효한 발효 콩알메주를 고형분량 기준으로 5:5 로 혼합한 다음 수분 52 %, 염도 11.5 % 목표로 염수 (염도 24 %)와 천일염 (호주산), 정제수를 첨가하였다. 이후 lab scale은 각 3 kg씩, pilot scale은 각 10 kg씩 담금한 후 30 ℃30일간 발효, 숙성 하였다. 일련의 과정은 도 5에 도식화하여 나타내었다.

3-2. 발효된 콩알메주 및 콩된장의 발효 품질 확인

3-2-1. 미생물의 밀도 확인

우선, 바실러스 세레우스의 밀도 확인을 위하여, 상기 실시예 3-1에서 얻은 콩알메주 또는 콩된장을 멸균 생리식염수를 사용하여 10^-2 에서 10^-6까지 단계별 희석을 한 후, 각 단계별 희석용액 0.2 ml씩 MYP agar (하기 표 5 참조)에 5장으로 도말하여 총 접종액이 1 ml가 되게 한 후, 30 ℃에서 24시간 배양하고 집락 주변에 lecithinase를 생성하는 혼탁한 환이 있는 분홍색 집락을 계수 하였다. 계수한 평판에서 5개 이상의 전형적인 집락을 선별하여 Nutrient agar(하기 표 5 참조)에 접종하고 30 ℃에서 24시간 배양한 후 그람염색을 실시하여 포자를 갖는 그람양성 여부를 확인하고, 긴 형태의 간균으로 확인된 균은 API 50CHB/E (Biomerieux)를 사용하여 생화학 시험을 실시하여 확인시험을 하였다. 균수의 계산은 확인 동정된 균수에 희석 배수를 곱하여 계산 하였다.

MYP Agar (Mannitol Egg-yolk Polymyxin Agar)	Beef extract	1g
	Peptone	10g
	D-Mannitol	10g
	Sodium chloride	10g
	Phenol red	25mg
	Agar	15g
	최종 pH 7.0~7.4
NA (Nutrient Agar)	Beef extract	3g
	Peptone	5g
	Agar	15g
	최종 pH 6.6~7.0

그리고 나서, 각 시료 25 g을 0.85 % 멸균생리식염수로 10배 수로 희석한 후 균질화하고, 그 액을 탄산칼슘 첨가 Modifed Lactobacilli MRS agar (하기 표 6 구성)에 접종한 다음 35 ℃48~72시간 배양하며 집락 주변에 투명한 환을 형성하는 집락을 희석 배수를 곱하여 계수 하였다.

Lab scale 발효에 따른 콩알 메주 및 콩된장에 대한 결과는 표 7에 나타내었다.

	40시간 발효된 콩알 메주		콩알 메주를 30일 동안 발효, 숙성한 콩된장
시료	바실러스 세레우스 (log CFU/g)	유산균 (log CFU/g)	바실러스 세레우스 (log CFU/g)
대조군 ^a	6.02±5.96	7.52±7.08	4.20 ^c
시험예 ^b	3.34±3.20	9.38±9.13	ND ^d
a) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) 처리 b) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) + 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 (10⁵ CFU/g) 처리 c) 평균 값 (2회 실험) d) ND: 검출 안됨(Not Detected) (<2 log CFU/g).

콩알메주 발효 과정의 유산균 수 밀도는 무처리 대조군이 발효 시작시 1.0Ⅹ10² CFU/g, 40시간 발효 종료시 1.7Ⅹ10⁷ CFU/g 로 약 5 log CFU/g 의 유산균수 증가를 보였으며, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리시에는 발효 시작시 4.2Ⅹ10⁵ CFU/g, 40시간 발효 종료시 1.0Ⅹ10⁸ CFU/g 로 약 3 log CFU/g 의 유산균수 증가를 보였다.

또한, 콩알메주 발효 과정의 오염 처리균 바실러스 세레우스 KCTC3624 밀도는 무처리 대조군이 발효 시작시 6.0Ⅹ10² CFU/g, 40시간 발효 종료시 9.2Ⅹ10⁵ CFU/g 로 약 3 log CFU/g 의 균수 증가를 보였으며, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리군에서는 발효 시작시 3.0Ⅹ10² CFU/g, 40시간 발효 종료시 5.1Ⅹ10³ CFU/g 로 약 1 log CFU/g 의 균수 증가 만을 보였다.

더욱이, 콩된장을 30일 동안 발효, 숙성한 결과, 류코노스톡 메센테로이데스 처리 실험군에서는 바실러스 세레우스가 검출되지 않은 반면 무처리 대조군에서는 바실러스 세레우스가 4.2 log CFU/g로 검출되었다.

pilot scale 발효에 따른 콩알 메주 및 콩된장에 대한 결과는 표 8에 나타내었다.

	40시간 발효된 콩알 메주		콩알 메주를 30일 동안 발효, 숙성한 콩된장
시료	바실러스 세레우스 (log CFU/g)	유산균 (log CFU/g)	바실러스 세레우스 (log CFU/g)
대조군 ^a	3.5Ⅹ10⁷	3.8Ⅹ10⁷	2.5Ⅹ10⁴
시험예 ^b	1.5Ⅹ10³	3.6Ⅹ10⁹	1.1Ⅹ10³
a) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) 처리 b) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) + 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 (10⁵ CFU/g) 처리

콩알메주 발효 과정의 유산균 밀도는 무처리 대조군이 발효 시작시 1.3Ⅹ10⁴ CFU/g, 40시간 발효 종료시 3.8Ⅹ10⁷ CFU/g 로 약 3 log CFU/g 의 유산균수 증가를 보였으며, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리시에는 발효 시작시 8.3Ⅹ10⁵ CFU/g, 40시간 발효 종료시 3.6Ⅹ10⁹ CFU/g 로 약 3 log CFU/g 의 유산균수 증가를 보였다.

또한, 콩알메주 발효 과정의 오염 처리균 바실러스 세레우스 KCTC3624 밀도는 무처리 대조군이 발효 시작시 3.7Ⅹ10³ CFU/g, 발효 20시간 째 6.6Ⅹ10⁷ CFU/g 로 가장 높은 균수를 보였으며 40시간 발효 종료시 3.5Ⅹ10⁷ CFU/g 로 발효 시작시에 비해 약 4 log CFU/g 의 균수 증가를 보였으며, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리군에서는 발효 시작시 5.8Ⅹ10³ CFU/g, 발효 20시간 째 2.2Ⅹ10⁶ CFU/g 로 가장 높은 균수를 보였으며 40시간 발효 종료시 1.5Ⅹ10³ CFU/g 로 발효 시작시에 비해 약 1/4 로 균수 감소를 보였다.

더욱이 각 콩된장을 발효, 숙성한 결과, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리구에서는 바실러스 세레우스가 검출되지 않은 반면 무처리 대조군에서는 2.5Ⅹ10⁴ CFU/g의 농도로 검출되었고, 유산균 수는 무처리 대조군이 2.1Ⅹ10⁸ CFU/g, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리군에서는 1.6Ⅹ10⁸ CFU/g로 유의차가 없었다.

3-2-2. pH 확인

상기 실시예 3-1에서 얻은 콩알메주 또는 콩된장을 분쇄기를 사용하여 2분간 분쇄한 후 5 g를 취하고 증류수 45 mL 를 첨가한 다음 5분간 교반 후 pH meter(Metrohm(스위스))로 이의 pH를 측정 하였다.

그 결과, Lab scale 발효를 진행한 경우, 콩알메주 발효 과정의 pH 는 발효 시작시 pH 6.7 에서 무처리 대조군이 40시간 발효 종료시 6.3으로 pH 가 0.4만큼 저하되었으며, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리시에는 40시간 발효 종료시 pH 5.6으로 1.1만큼 저하되었다. 콩알메주로 담근 콩된장을 30일 동안 발효, 숙성한 이후 콩된장의 pH를 측정한 결과, 무처리 대조군은 pH 6.1, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 균주 처리 실험군은 pH 5.9이었다.

Pilot scale 발효를 진행한 경우, 콩알메주 발효 과정의 pH 는 무처리 대조군이 발효 시작시 pH 6.6 에서 발효 24~28시간 째 pH 6.4 로 약간 저하되었으나 40시간 발효 종료시 6.6으로 pH 의 차이가 없었으며, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리시에는 발효 시작시 pH 6.4 에서 발효 16~20시간 째 pH 5.0까지 지속적으로 저하되었다가 40시간 발효 종료시에는 pH 6.1 로 점차 상승되었다. 이후, 30일 동안 발효, 숙성한 콩된장의 pH를 측정한 결과, 무처리 대조군은 pH 6.3, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 균주 처리구는 pH 6.1로 유의차가 없었다.

3-2-3. 성상 확인

상기 실시예 3-1에서 얻은 콩알메주 또는 콩된장에 대하여 발효시간대별 콩알메주 또는 콩된장 표면의 포자발아, 균사체 성장 및 포자생성 상태를 육안으로 관찰하였다. Lab scale로 확인한 결과는 도 6에 나타내고, pilot scale로 확인한 결과는 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 콩알메주를 40시간 발효한 이후 대조군의 콩알메주 표면 균사체 생장 상태과 비교하여 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리군은 육안상 유의적 차이를 보이지 않았다.

또한, 식품의 기준 및 규격, 일반시험법에 따라 105 ℃에서 상압가열건조법으로 발효 완료된 콩알메주의 수분 함량을 확인한 결과, lab scale 발효시 수분 함량이 대조군과 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리군이 각각 44.9±0.8%, 43.6±3.2%이었고, pilot scale 발효시 수분 함량이 대조군과 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리군이 각각 42.5%, 42.7%로, 서로 유의한 차이를 나타내지 않았다.

3-2-4. 단백질 분해효소 활성 확인

상기 실시예 3-1에서 얻은 콩알메주를 분쇄기로 균일하게 잘 분쇄한 다음 10 g을 저울에 계량하여 250 ml baffle 삼각 플라스크에 옮기고 증류수 90 ml를 가하여 30 ℃150 rpm, 1시간 동안 shaking incubator에서 추출한 다음 100 mL 삼각 플라스크에 No 2. 여과지를 이용하여 여과하여 여과액을 조효소액으로 하였다. 이후 이의 효소기질 반응을 확인하기 위하여, test tube에 pH 7.0 buffer 2 mL, 2 % casein 2 mL 투입 후 볼텍스 믹서로 균질화 한 다음 항온 수조 (30 ℃에서 10분간 예열하여 시료의 10 % 조효소액 1 mL를 투입한 후, 30 ℃항온수조에서 20분간 효소기질 반응을 시키고 0.4M TCA 5 mL 투입하여 볼텍스 믹서로 균질화하여 반응을 중단시켰다(30 ℃항온수조에서 20분간 유지). 여과 test tube에 반응 여액 1 mL, 0.4M Na₂CO₃ 5 mL, 5배 희석 Folin 시약 1 mL 투입 후 항온 수조 (30 ℃에서 20분간 유지 후 분광광도계로 660 nm에서 흡광도를 측정하고 standard curve는 L-tyrosine 10, 20, 30, 40, 50 ㎍/mL 용액을 제조하여 측정 하였다. 이때, 효소 활성도 (unit)는 1분 동안 tyrosine 1 ㎍에 상당하는 비단백성 물질을 유리시키는 효소량으로 정의하고 아래 산식으로 계산 하였다.

[식 1]

효소 활성도 계산

= T × 10/1 (측정량) × 1/20 (분해 시간) × 10 (희석배수) = T × 5

(T = a × (sample O.D값-blank O.D값) - b,

이때, a와 b는 각각 standard curve 회귀방정식(y=ax+b)의 기울기 및 y 절편 값임)

lab scale 발효에 따른 콩알 메주에 대한 결과는 표 9에 나타내었다.

시료	단백질 분해효소 활성 (unit)
대조군 ^a	133±15
실험군 ^b	93±25
a) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g). b) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) + 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 (10⁵ CFU/g).

표 9에서 확인할 수 있는 바와 같이, 단백질 분해효소 활성은 무처리 대조군이 평균 133 unit이고, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리시는 93 unit로 무처리 대조군에 비해 30 % 낮은 활성을 나타내었다.

Pilot scale 발효에 따른 콩알 메주에 대한 결과는 표 10에 나타내었다.

시료	단백질 분해효소 활성 (unit)
대조군 ^a	141
실험군 ^b	98
a) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g). b) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) + 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 (10⁵ CFU/g).

표 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 단백질 분해효소 활성은 무처리 대조군이 평균 141 unit이고, 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리시는 98 unit으로 무처리 대조군에 비해 30 % 낮은 활성을 나타내었다.

3-2-5. 바이오제닉 아민의 함량 확인

바이오제닉 아민은 다양한 종류의 식품에서 과량 섭취 시 식중독 증상을 유발시키고 일부는 N-nitrosamine 과 같은 강력한 발암 물질로 전환될 수 있는 잠재성을 가지고 있어 식품의 유해 물질로 주목해야 할 물질이다. 이에, 실시예 3-1에서 얻은 발효된 콩알메주과 콩된장이 바이오제닉 아민을 포함하는지 여부를 확인하기 위하여 실험을 수행하였다.

구체적으로, 바이오제닉 아민인 히스타민 (histamine) 및 티라민 (tyramine)의 함량 분석은 검체인 상기 실시예 3-1에서 얻은 발효된 콩알메주 또는 콩된장을 5 g 정확하게 취하여 0.1N 염산 15 ml를 가한 후 균질화하고 이것을 원심분리 (4000gⅩ4 ℃, 15 min)한 후 상층액을 취하는 조작을 3회 반복하여 얻은 상층액을 합치고 0.1N 염산을 가하여 50 ml로 한 것을 시험용액으로 하였다. 표준용액 (티라민 (Aldrich/Cas No 5167-2), 히스타민 (Sigma/Cas No. 5145-6)) 및 시험용액 각각 1 ml를 마개 달린 유리 시험관에 취한 다음 내부 표준용액 10 ㎕를 가한 후 포화 탄산나트륨 용액 0.5 ml와 1 % 염화단실아세톤 용액 0.8 ml를 가하여 혼합한 후 마개를 하여 45 ℃에서 1시간 유도체화 한 다음 그 표준용액 및 시험용액에 10 % 프롤린 용액 0.5 ml 및 에테르 5 ml 를 가하여 약 10분 간 진탕하고 상층액을 취하여 질소 농축한 뒤 아세토니트릴 1 ml를 가하여 여과한 것을 하기 표 11의 조건으로 고속액체크로마토그래프 분석을 수행하였다.

검출기	UV spectrophotometer (254 nm), Waters 2415 Refraction index detector
HPLC	Waters 1525
칼럼	C18 (4.6 ⅹ 250 nm, 5 μm)
칼럼 온도	40 ℃
이동상	55 % acetonitrile + 45 % water 10분 -> 65 % acetonitrile + 35 % water 5분 -> 80 % acetonitrile + 20% water 10분 -> 90 % acetonitrile + 10 % water 15분
유속	1 ml/분

그리고 나서, 검량곡선 표준용액에서 얻어진 표준물질의 피크면적 (AS)과 내부 표준물질의 피크 면적 (AIS)에 대한 면적비 [AS/AIS]를 Y축으로 하고 검량곡선 표준용액의 히스타민 및 티라민의 농도 (μg/g)를 X축으로 하여 검량곡선을 작성하고 시험용액에서 얻어진 히스타민 또는 티라민 피크면적 (ASAM)과 내부표준 물질의 피크면적 (ASAMIS)에 대한 면적비 [ASAM/ASAMIS]를 Y축에 대입하여 히스타민 또는 티라민의 농도를 계산 하였다. Pilot scale 발효에 따른 콩알 메주 및 콩된장에 대한 결과는 표 12에 나타내었다.

	바이오제닉 아민 (mg/kg)
	발효된 콩알 메주		콩알 메주를 30일 동안 발효, 숙성한 콩된장
시료	히스타민	티라민	히스타민	티라민
대조군 ^a	9.9	3.4	5.8	9.4
실험군 ^b	2.8	3.7	2.9	2.7
a) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) b) 아스퍼질러스 오리재 RIB 40 (0.38 %) + 바실러스 세레우스 (KCTC3624, 10² CFU/g) + 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 (10⁵ CFU/g)

표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, 바이오제닉 아민 함량은 대조군이 히스타민 9.9 mg/kg, 티라민 3.4 mg/kg, 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리구가 히스타민 2.8 mg/kg, 티라민 3.7 mg/kg로 무처리 대조군, 유산균 처리 실험군 모두 함량이 낮고 유의차가 없었다. 또한, 콩알메주로 담근 콩된장을 발효, 숙성한 결과, 대조군이 히스타민 5.8 mg/kg, 티라민 9.4 mg/kg, 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리구가 히스타민 2.9 mg/kg, 티라민 2.7 mg/kg로 무처리 대조군, 실험군 모두 그 함량이 낮고 유의차가 없었으며, 이러한 수치는 우리나라 식약처 권고 기준 (히스타민 500mg/kg 이하)에 비해 아주 낮은 안전한 수준으로 조사되었다.

3-2-6. 유기산 함량 확인

상기 실시예 3-1에서 얻은 콩알메주 또는 콩된장 5 g을 50 mL 용량플라스크에 취한 다음 6 mM HClO₄로 약 100 mL까지 채운 후 10분간 vortexing 또는 shaking 하고 100 mL까지 정용한 후 0.22 μm filter 여과하여 HPLC 시험용액으로 하였다. 이후 HPLC의 분석은 하기 표 13을 따라 Beckman HPLC PDA+RI를 이용하여 수행하였다.

칼럼	Shodex KC-811
이동상	6 mM HClO4
검출기	PDA+RI
유속	0.8 ml/분
주입 부피	30 ㎕
칼럼 온도	40 ℃
작동 시간	30 분

Pilot scale 발효에 따른 콩알 메주에 대한 결과는 표 14에 나타내었다.

Pilot scale 발효에 따른 콩된장에 대한 결과는 표 15에 나타내었다.

표 14 및 15에서 확인할 수 있는 바와 같이, 유산균 처리시 콩알메주 발효과정에 다량 생성된 lactic acid는 콩된장의 발효, 숙성 과정에 모두 p-glutamic acid 로 전환된다. 또한, 콩된장 담금시 B. subtilis로 발효한 콩알메주 (pH 8.0 수준)를 50 % 혼용한 것이 무처리 대조군에 비해 유산균 처리 발효 콩알메주의 pH가 상대적으로 낮은 것을 masking함으로써 유산균 처리 발효 콩된장이 무처리 대조군에 비해 B. cereus 저감화 효과가 우수하며 품질 면에서는 유의차가 없는 좋은 결과를 나타냄을 확인하였다.

3-2-7. 아미노태 질소 함량 확인

상기 실시예 3-1에서 얻은 콩된장을 균질화한 후 5 g 채취하여 증류수에 풀어 250 ml 메스플라스크에 mess-up 한 다음 No. 2 여과지로 여과한다. 여액 50 ml를 0.1N NaOH와 0.1N HCl 용액을 사용하여 pH 8.4로 맞추고 포름알데히드 용액을 0.1N NaOH와 0.1N HCl 용액을 사용하여 pH 8.4로 조정한 액을 20 ml 첨가한 다음 pH가 8.4가 될 때까지 0.1N NaOH 용액으로 적정하며, 이때 0.1N NaOH 소비량을 기록하였다.

* 아미노태 질소 함량 계산

아미노태 질소 (mg %) = A×F×0.0014×D×100/S

A: 시료용액 중화에 소비된 0.1N NaOH 용액 mL수

F: 0.1N NaOH 농도계수

S: 시료무게 (g)

※ F = 0.1N NaOH의 factor로 1로 본다. 0.0014는 0.1N NaOH 1 ㎖에 해당하는 질소

그 결과, 발효, 숙성된 콩된장의 아미노태 질소 함량은 무처리 대조군이 864 mg/kg, 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 균주 처리구가 825 mg/kg로 서로 유의적 차이가 없었다.

3-2-8. 관능검사

상기 실시예 3-1에서 얻은 콩된장에 대하여 관능검사를 실시하였고, 이때 맛, 향, 색에 대하여 숙련된 전문 관능요원 10명이 관능평가를 진행하였다. 관능평가의 오차를 줄이기 위하여 일정한 시간에 15점 척도 특성강도 평가법(1점은 약함, 15점은 강함을 의미)을 실시하였고 각 시료별 유의차 검정은 이 기술 분야에서 일반적으로 사용되는 Duncan's multiple range test로 하였다. 관능검사를 수행한 결과는 표 16에 나타내었고, 그 중 외관 관찰을 수행한 결과는 도 3 및 4에 나타내었다.

표 16, 도 3 및 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 전문패널을 통한 관능검사 결과에서 외관상 색상이 무처리 대조군에 비해 실험군인 유산균 처리구가 밝은 것으로 조사되었고 향은 유산균 처리구가 무처리 대조군에 비해 밀가루취와 콩내가 적었으며 짠맛, 단맛, 신맛, 밀가루맛, 이미와 이취가 무처리 대조군과 유산균 처리구간 유의차가 없었으며 신내, 쿰쿰한향은 무처리 대조군에 비해 유산균 처리구가 높았다. 깔끔하지 못한 향미를 나타내던 전통재래된장과 비교하였을 때, 전통재래된장 대비 조화와 바람직한 정도는 무처리 대조군, 유산군 처리구 순으로 전통 재래된장에 가까운 것으로 조사되었으며 이를 통해 유산군 처리구가 가장 깔끔한 맛을 띄는 것으로 조사되었다.

3-2-8. 휘발성 화합물 확인

상기 실시예 3-1에서 얻은 콩된장 0.5 g에 NaCl 0.5 g, H₂O 4 mL을 첨가한 후 교반하여 전처리 하였다. 그리고 나서, 하기 표 17의 조건으로 SPME (Solid Phase Micro Extraction)를 수행하고, 하기 표 18의 조건으로 GC/MS 분석을 수행하여, 휘발성 화합물을 확인하였다.

교반기 온도	60 ℃
전-배양 시간	30 min
전-배양 RPM	300
추출 RPM	300
추출 시간	30 min
탈리 시간	5 min
베이크아웃(bakeout) 시간	10 min
베이크아웃 온도	260 ℃

GC	Bruker Scion-TQ GC/MS
인젝터	Temperature 250 ℃
칼럼	HP-Innowax (30 m Ⅹ 0.25 ㎛ Ⅹ 0.25 mm)
SPME fiber	CAR/ PDMS
운반기체	He (1.2 ml/min)
온도 프로그램	50 ℃ (10 min)-0 ℃/min -> 90 ℃ (0 min)-3 ℃/min -> 200℃ (5 min)-9 ℃/min -> 230 ℃ (5 min)- 20 ℃/min
MS	Ion source temp. 200 ℃ / transfer line temp. 230 ℃

상기 각 결과는 도 8 및 표 19에 나타내었다.

휘발성 화합물	CAS No.	영역 ^a		향	맛 (풍미)
휘발성 화합물	CAS No.	대조군	실험군	향	맛 (풍미)
Propanoic acid, 2-methyl-, ethyl ester	97-62-1	0.00 (0.00)	1.00 (1.17E+08)	sweet ethereal fruity, alcoholic fusel rummy	pungent, etherial and fruity with a rum and egg nog-like nuance
Hexanal	66-25-1	0.00(0.00)	0.00 (0.00)	fresh green fatty, aldehydic grass leafy, fruity, sweaty	green, woody, vegetative, apple, grassy, citrus and orange with a fresh, lingering aftertaste
Pentanoic acid, 4-methyl-, ethyl ester	25415-67-2	0.00(0.00)	0.00 (0.00)	fruity	-
1-Butanol, 2-methyl-, (S)-	1565-80-6	1.00(2.83E+08)	2.35 (6.63E+08)	ethereal fresh	-
2-Octenal, (E)-	2548-87-0	1.00(7.44E+07)	0.00 (0.00)	fresh cucumber fatty green herbal banana waxy green leaf	sweet green citrus peel spicy cucumber oily fatty brothy
1-Octen-3-ol	3391-86-4	1.00(1.85E+09)	3.47 (6.43E+09)	mushroom earthy green oily fungal raw chicken	mushroom, earthy, fungal, green, oily, vegetative, umami sensation and savory brothy
Phenol, 4-ethyl-2-methoxy-	2785-89-9	1.00(6.96E+07)	0.00 (0.00)	spicy smoky bacon phenolic clove	woody, smokey and spicy with a sweet vanilla background
2(3H)-Furanone, dihydro-5-pentyl-	104-61-0	0.00(0.00)	1.00 (8.07E+07)	coconut creamy waxy sweet buttery oily	coconut, creamy, waxy with fatty milky notes
Caprolactam	105-60-2	1.00(1.52E+07)	0.72 (1.09E+07)	amine spicy	-
n-Hexadecanoic acid	57-10-3	1.00(3.61E+07)	0.00 (0.00)	slightly waxy fatty	waxy, creamy fatty, soapy with a crisco like fatty, lard and tallow like mouth feel and a dairy nuance
Oleic acid	112-80-1	0.00(0.00)	1.00 (2.58E+07)	faint fatty waxy lard fried	fatty, vegetable oil with lard and tallow nuances of french fried potatoes
a) 대조군에 대한 상대적인 비율 (괄호 안은 절대적인 측정 값을 나타냄)

표 19에서 확인할 수 있는 바와 같이, 휘발성 화합물은 무처리 대조군에서 실험군인 유산균 처리구에서는 검출되지 않은 2-Octenal, (E)-, phenol, 4-ethyl-2-methoxy-, n-hexadecanoic acid 가 검출 되었고, 반면 실험군인 유산균 처리구에서는 무처리 대조군에서 검출되지 않는 (propanoic acid, 2-methyl-, ethyl ester), [2(3H)-furanone, dihydro-5-pentyl-], oleic acid 이 검출되었다. 무처리 대조군의 밀가루취가 유산균 처리구에 비해 상대적으로 높은 것이 이들 성분에 의한 것으로 추정된다. 1-butanol, 2-methyl-, (S)의 함량은 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리구가 무처리 대조군에 비해 2배 가량 높게 검출되었고, 감칠맛과 주로 관련된 1-octen-3-ol은 무처리 대조군에 비해 실험군인 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742 처리구가 약 3.5배 높게 검출되었다. caprolactam은 무처리 대조군에 비해 실험군인 유산균 처리구에서 0.3~0.5배 낮게 검출되고 무처리 대조군이 유산균 처리구에 비해 콩 비린내가 높은 것이 이 성분에 의한 것으로 추정된다.

3-3. Pyrosequencing을 이용한 발효된 콩알메주 및 콩된장의 세균 분포 확인

DNA 추출물을 위하여, 실시예 3-1에서 얻은 콩된장을 시료로 하여, 각 시료를 0.5g만을 얻어 토양, 바이오필름, 식품, fecal 용 DNA 추출 키트 (extraction kit, Cat. No.6560-200, MP BIO)를 사용하여 제공된 방법에 따라 genomic DNA (gDNA)를 추출하였고 그 gDNA 용액으로부터 DNA 정제키트 (purification kit)를 이용하여 gDNA에 있는 부식산 (humic acid)를 제거하였다.

그리고 나서, 추출한 DNA의 PCR 증폭을 위하여, 하기 표 20의 대장균 16S rRNA의 V1, V2, V3 다변 영역을 사용한 fusion forward primer 27F, Fusion Reverse 518R를 제작한 후(하기 표 20), DNA 증폭을 위해 20 μl tube에 1 μl template DNA, 1 μl 각 primer (50 pmol), 1 μl dNTP (각 100 mM), 2 μl 10x PCR buffer, 1 μl Taq polymerase (Roche, Germany), 14 μl H₂O 의 반응 시약을 넣고 thermal cycler (Bio-Rad, USA)에서 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 94℃ 5분; 94℃ 30초, 60℃ 45초, 72℃ 1분 30초로 10 cycle; 94℃ 30초, 55℃ 45초, 72℃ 1분 30초로 20 cycle의 조건에서 수행하였다. QIAquick gel extraction kit (Qiagen, Germany)를 통해 정제한 PCR 산물은 GS Junior Titanium system (Roche, Germany) 염기서열 분석기를 이용하여 pyrosequencing을 진행하였으며 pyrosequencing에 필요한 방법과 반응들은 제조회사 (Roche)의 메뉴얼에 따라 ㈜천랩 (Chunlab, Korea)에서 수행하였다.

		내용
fusion forward primer 27F		5′-CCTATCCCCTGTGTGCCTTGGCAGTC (adapter)-TCAG (key)-AC (linker)-GAGTTTGATCMTGGCTCAG (27F primer)-3′ (서열번호 1)
Fusion Reverse primer 518R	콩알메주	5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC (adapter)-TCAG (key)- AGATGCTAG (barcode)-AC (linker)-WTTACCGCGGCTGCTGG (518R primer)-3′ (서열번호 2)
	콩된장	5′-CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGAC (adapter)-TCAG (key)- TACGTAGACAG (barcode)-AC (linker)-WTTACCGCGGCTGCTGG (518R primer)-3′ (서열번호 3)

그리고 나서, Pyrosequencing 데이터 분석을 위하여, Barcode sorting에 따라 분리된 각 서열들에서, GL FLX software (Roche)를 사용 하여 barcode 서열, primer 및 linker 를 뺀 뒤 나머지 서열의 길이가 300 bp 이하 인 것들은 분석에서 제외했고, Hidden Markov Model (HMMER 3.0: http://hmmer.janelia.org/)과 BLASTN search 를 통해 chimera 염기 서열과 16S rRNA 가 아닌 서열들도 제거하였다. EzTaxon extended database를 이용하여 BLASTN 탐색 실행결과로 찾은 상위 다섯 개의 hits을 대상으로 pair-wise alignment를 실행한 뒤 얻은 similarity를 기준으로 분류학적 동정을 수행 하였다. 3 % 서열 불일치도를 기준으로 CD-HIT program(128)을 이용하여 시료 내에 존재하는 종의 수인 operational taxonomic unit (OTU) 수를 구하였다. 통계분석은 MOTHUR program을 사용해서 rarefaction curve, abundance -based coverage estimator (ACE) index, Chao1 richness index, Shannon 및 Simpson diversity indices들과 Good's coverage index를 구하였다. 그 결과는 표 21 및 도 9에 나타내었다.

콩알메주와 콩된장의 발효에 따른 균의 종 변화를 나타낸 표 21의 결과를 각 그룹별로 정리하여 표 22 및 23에 나타내었다. 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742를 처리하지 않은 대조군에 대한 결과는 표 22에 나타내고, 상기 균을 처리한 실험군에 대한 결과는 표 23에 나타내었다.

검출된 균 명칭	콩알메주		콩된장 (30일 숙성, 발효됨)
검출된 균 명칭	발효 전	40시간 발효 후	콩된장 (30일 숙성, 발효됨)
Phaseolus vulgaris (French bean)	87.453	0.43	0.02
Bacillus licheniformis group	0.13	0.14	44.84
Cicer arietinum (Chickpea)	2.593	0.01	0.00
Bacillus subtilis group	0.15	11.68	9.91
Bacillus cereus group	0.52	9.19	0.02
Weissella confusa group	0.2	50.06	6.38
Lactococcus lactis group	0.41	9.11	1.38
Tetragenococcus halophilus group	0.00	0.00	5.58
Bacillus sonorensis group	0.01	0.03	19.56

검출된 균 명칭	콩알메주		콩된장 (30일 숙성, 발효됨)
검출된 균 명칭	유산균 처리 직후 발효 전	40시간 발효 후	콩된장 (30일 숙성, 발효됨)
Leuconostoc mesensteroides group	91.13	96.31	47.39
Bacillus cereus group	0.00	0.25	0.00
Bacillus sonorensis group	0.00	0.00	17.53
Phaseolus vulgaris (French bean)	7.11	0.08	0.00
Bacillus licheniformis group	0.01	0.01	22.19
Bacillus subtilis group	0.00	0.00	5.32
Weissella confusa group	0.01	1.10	0.06
Tetragenococcus halophilus group	0.00	0.00	1.04

3-4. 류코노스톡 메센테로이데스 SMB742의 전체 게놈 서열 조사

류코노스톡 메센테로이데스 SMB742에 대하여 마크로젠 (MACROGEN INC.)에 의뢰하여 이의 전체 게놈 서열 분석을 의뢰하였다. 서열 분석은 크게 De novo assembly, annotation, error correction을 통해 실시되었고, API 키트로 간이동정된 L. mesenteroides SMB742에 대한 full genome sequencing 정보를 바탕으로 genome blasting (BLASTN 2.8.0)을 실시하여 L. mesenteroides SMB742의 종류를 동정하였다. 그 결과, Leuconostoc mesenteroides subsp. jonggajibkimchi strain DRC1506 균주의 sequence 정보와 88 % (Query coverage) 일치 (99 % identification) 하는 것으로 확인 되었다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12605P

20191011

<110> SEMPIO FOODS COMPANY <120> Leuconostoc mesenteroides with growth inhibition of bacillus cereus <130> 19p243ind <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion forward primer 27F <400> 1 cctatcccct gtgtgccttg gcagtctcag acgagtttga tcmtggctca g 51 <210> 2 <211> 58 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion reverse primer 518R for meju (fermented soybean lump) <400> 2 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag agatgctaga cwttaccgcg gctgctgg 58 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fusion reverse primer 518R for doenjang (fermented soybean paste) <400> 3 ccatctcatc cctgcgtgtc tccgactcag tacgtagaca gacwttaccg cggctgctgg 60 60 <210> 4 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA full sequence for Leuconostoc mesenteroides SMB 742 <400> 4 attttcaaat tttcaaattg agagtttgat cctggctcag gatgaacgct ggcggcgtgc 60 ctaatacatg caagtcgaac gcacagcgaa aggtgcttgc acctttcaag tgagtggcga 120 acgggtgagt aacacgtgga caacctgcct caaggctggg gataacattg gtgagtaaca 180 cgtggacaac ctgcctcaag gctggggata acatttggaa acagatgcta ataccgaata 240 aaacttagtg tcgcatgaca aaaagttaaa aggcgcttcg gcgtcaccta gagatggatc 300 cgcggtgcat tagttagttg gtggggtaaa ggcctaccaa gacaatgatg catagccgag 360 ttgagagact gatcggccac attgggactg agacacggcc caaactccta cgggaggctg 420 cagtagggaa tcttccacaa tgggcgaaag cctgatggag caacgccgcg tgtgtgatga 480 aggctttcgg gtcgtaaagc actgttgtat gggaagaaca gctagaatag gaaatgattt 540 tagtttgacg gtaccatacc agaaagggac ggctaaatac gtgccagcag ccgcggtaat 600 acgtatgtcc cgagcgttat ccggatttat tgggcgtaaa gcgagcgcag acggtttatt 660 aagtctgatg tgaaagcccg gagctcaact ccggaatggc attggaaact ggttaacttg 720 agtgcagtag aggtaagtgg aactccatgt gtagcggtga aatgcgtaga tatatggaag 780 aacaccagtg gcgaaggcgg cttactggac tgcaactgac gttgaggctc gaaagtgtgg 840 gtagcaaaca ggattagata ccctggtagt ccacaccgta aacgatgaac actaggtgtt 900 aggaggtttc cgcctcttag tgccgaagct aacgcattaa gtgttccgcc tggggagtac 960 gaccgcaagg ttgaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt ggagcatgtg 1020 gtttaattcg aagcaacgcg aagaacctta ccaggtcttg acatcctttg aagcttttag 1080 agatagaagt gttctcttcg gagacaaagt gacaggtggt gcatggtcgt cgtcagctcg 1140 tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttattgtt agttgccagc 1200 attcagatgg gcactctagc gagactgccg gtgacaaacc ggaggaaggc ggggacgacg 1260 tcagatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatggc gtatacaacg 1320 agttgccaac ccgcgagggt gagctaatct cttaaagtac gtctcagttc ggattgtagt 1380 ctgcaactcg actacatgaa gtcggaatcg ctagtaatcg cggatcagca cgccgcggtg 1440 aatacgttc 1449 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal forward primer 27F <400> 5 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> universal reverse primer 1429R <400> 6 tacggytacc ttgttacgac tt 22

Claims

바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 생육 저해력을 갖는 류코노스톡 메센테로이데스 (Leuconostoc mesenteroides) SMB 742 균주(기탁번호 KCCM12605P).
제1항에 있어서,
상기 균주는 하기 특징 (1) 내지 (3) 중 하나 이상을 포함하는, 균주:
(1) 배지에 상기 바실러스 세레우스를 도말한 다음, 상기 류코노스톡 메센테로이데스의 배양액을 20 μl로 분주한 후 30℃에서 24시간 동안 배양할 때 생성되는 생육저지원 (clear zone)의 지름이 16 내지 26 mm임,
(2) pH 4 내지 8의 조건에서 생육이 가능함, 및
(3) 10 내지 40℃ 온도 조건에서 생육이 가능함.
삭제
삭제
제1항 또는 제2항에 따른 균주; 이의 파쇄물; 이의 배양물; 이의 발효물; 및 상기 균주, 파쇄물, 배양액 또는 발효물의 추출물; 중 하나 이상을 포함하는 미생물 제제.
대두 발효물로서,
상기 대두 발효물은 대두 미생물 발효물이고,
상기 미생물은 제5항의 미생물 제제;를 포함하는 것인, 대두 발효물.
제6항에 있어서,
상기 대두 발효물은 메주인, 대두 발효물.
제6항에 있어서,
상기 대두 발효물은 하기 특징 (1) 내지 (7) 중 하나 이상을 포함하는, 대두 발효물:
(1) 바실러스 세레우스는 대두 발효물 전체 중량에 대하여 10⁴ CFU/g 미만 밀도로 존재함,
(2) 대두 발효물은 pH 값이 5.5 내지 7임,
(3) 대두 발효물의 수분함량은 40 내지 47 중량%임,
(4) 대두 발효물의 단백질 분해효소 분해 활성도는 60 내지 110 unit임,
(5) 대두 발효물 내 바이오제닉 아민 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 8 mg/kg 이하임,
(6) 대두 발효물 내 젖산(lactic acid)의 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 200 내지 2000 mg/kg임, 및
(7) 대두 발효물 내 p-글루타민산(p-glutamic acid)의 함량은 대두 발효물 전체 중량에 대하여 10 내지 75 mg/kg임.
대두에 제5항의 미생물 제제를 처리하는 단계; 및
상기 대두에 처리한 미생물 제제를 배양하는 단계;를 포함하는, 제6항의 대두 발효물의 제조 방법.
제9항에 있어서,
상기 배양하는 단계는 20 시간을 초과하는 시간 동안 수행하는, 방법.
제6항의 대두 발효물; 물; 및 식염;을 포함하는 조성물의 발효물.
제11항에 있어서,
상기 조성물은 대두 고초균 발효물을 더 포함하는 것인, 발효물.
제11항에 있어서,
상기 조성물의 발효물은 된장인, 발효물.
제11항에 있어서,
상기 조성물의 발효물은 하기 특징 (1) 내지 (4) 중 하나 이상을 포함하는, 발효물:
(1) 바실러스 세레우스는 상기 발효물 전체 중량에 대하여 10⁴ CFU/g 미만 밀도로 존재함,
(2) 발효물 내 바이오제닉 아민 함량은 발효물 전체 중량에 대하여 8 mg/kg 이하임,
(3) 발효물 내 젖산의 함량은 발효물 전체 중량에 대하여 1 mg/kg 이하임, 및
(4) 발효물 내 p-글루타민산의 함량은 발효물 전체 중량에 대하여 25 내지 800 mg/kg임.
제11항에 있어서,
상기 조성물의 발효물은 하기 휘발성 화합물 중 하나 이상을 포함하는 것인, 발효물:
2-메틸-에틸에스터 프로피온산(Propanoic acid, 2-methyl, ethyl ester);
(S)-2-메틸-1-부탄올(1-Butanol, 2-methyl-, (S)-);
1-옥텐-3-올(1-Octen-3-ol);
디히드록-5-펜틸-2(3H)-푸라논(2(3H)-Furanone, dihydro-5-pentyl-); 및
올레익산(Oleic acid).
제6항의 대두 발효물; 물; 및 식염;을 포함하는 조성물을 발효하는 단계;를 포함하는, 제11항의 발효물을 제조하는 방법.