KR20150088588A

KR20150088588A - 신규한 감마아미노부티르산 고생산성 균주 락토바실러스 브레비스 cfm11 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20150088588A
Application number: KR1020140009089A
Authority: KR
Inventors: 김광엽; 정지희
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-01-24
Filing date: 2014-01-24
Publication date: 2015-08-03

Abstract

본 발명은 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11 균주, 상기 균주 또는 상기 균주에 의한 발효물을 포함하는 식품조성물, 상기 균주 및 미강 추출물을 포함하는 감마아미노부티르산 생성을 위한 발효용 조성물, 및 상기 균주를 이용하여 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 균주는 GABA 생성효율이 매우 뛰어나 GABA 생산에 효과적으로 사용될 수 있으며, 특히 미강 추출물을 발효 기질로 사용할 수 있어 미강의 재활용성이 우수하고, GABA의 함유량이 증가된 기능성 식품의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 감마아미노부티르산 고생산성 균주 락토바실러스 브레비스 CFM11 및 이의 용도{Novel Gamma-Amino Butyric Acid Producing Strain of Lactobacillus Brevis CFM11 and Use of the Same}

본 발명은 신규한 감마아미노부티르산 고생산성 균주 락토바실러스 브레비스 CFM11 및 이의 용도에 관한 것이다.

감마-아미노부티르산(Gamma-Amino Butyric Acid, GABA)는 4개의 탄소로 구성되어 있고, GAD(glutamic acid decarboxylase)에 의해 L-글루타메이트(glutamate)가 비가역적으로 탈탄산화되어 CO₂와 함께 생성된다. 이 효소는 미생물에서부터 고등생물에 이르기까지 다양한 동식물에서 발견되며, 인간의 GAD는 PLP(prydoxal-5'-phosphate)를 필요로 하고 pyridoxal-5'-phosphate dependent 경로로 합성되는 것으로 알려져 있다. GABA는 체내에서 신경전달물질의 하나인 아세틸콜린(acetylcholine)을 증가시키고, 뇌의 산소공급을 증가시켜 뇌의 대사를 향상시키는 역할을 한다. 이 외에도 연수의 혈관중추에 작용하여 항이뇨호르몬인 바소프레신(vasopressin)의 분비를 억제하는가 하면 혈압 저하 효과 및 이뇨 효과 등 여러 생리작용이 보고되고 있다. 또한 뇌 혈류개선, 산소공습 증가, 뇌세포 대사기능을 촉진시켜 신경안정작용, 스트레스 해소, 기억력 증진, 혈압강하작용, 우울증 강화, 중풍과 치매 예방, 불면, 비만, 갱년기장애 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며, 최근 뇌졸중 및 결장암, 대장암 세포의 전이 및 증식 억제효과가 있는 것으로 밝혀졌다.

일반적으로 우리 몸은 GABA 요구량을 모두 생산하지만 에스트로겐, 살리실산염 및 식품첨가물의 과잉섭취, 저 단백 식단, 아연과 비타민 B의 부족이 GABA 생성을 방해하며 식품을 통하여 보충할 경우 필요량은 하루 500-3000 mg 정도이다. 곡류식품에 존재하는 GABA 함량은 일반미 1-4 mg/10 g, 현미 4-8 mg/g, 발아현미 10-100 mg/100 g, 녹차 35-205 mg/g, 뽕잎 56 mg/100 g(건조중량) 인데 반해, 유산균 발효제법을 이용한 경우 250-700 mg/100g의 함량이 증가가 보고되고 있으며 자연 상태에서의 식품체 GABA 함유량으로는 약리작용을 발휘하기에 부족하여, 자연적인 섭취로 GABA의 생리작용을 기대하기는 어려운 실정이다.

유산균은 발효식품의 주된 미생물로 특히 오랫동안 발효 유제품의 스타터로 이용되어 왔다. 유산균은 정장 작용, 면역 조절, 항암 및 항돌연변이 효과, 콜레스테롤 저하, 항알레르기 효과, 유당불내증 완화 등의 프로바이오틱 기능성이 알려지면서 산업적 이용분야가 식품에서 의약, 화장품 및 사료 분야까지 확대되었다. 최근 연구로 몇 가지 유산균은 GABA를 생성할 수 있는 것으로 나타났다. 유산균은 특별한 생리 활동을 소유하고 일반적으로 안전한 것으로 간주되며, 광범위하게 오랜 시간 동안 식품 산업에서 널리 사용되었다. 천연 GABA의 바이오 합성 생산 식품의 생산을 위해 유산균에 의핸 생성된 GABA 및 유산균 자체의 건강 증진 특성을 충분히 활용할 수 있을 것으로 보인다. 최근 몇 년 동안, 돌연변이 유산균을 사용하여 GABA 생산하는 것에 초점을 둔 연구가 진행 중 이다. GABA를 생산하는 유산균은 일부 발효 제품인 유제품에서 선발하거나 블랙 라즈베리 주스, 두유, 김치, 치즈 등에서 분리하였다. 예로 현재 일본에서는 김치에서 분리한 유산균이 생성한 GABA를 식품에 실제로 응용하고 있으며, 일본 전통 발효식품인 funasushi로부터 분리한 L. paracasei NFRI7415가 302mM의 GABA를 생산하였다고 하였고 국내 연구진들도 이와 관련된 연구를 진행하고 있으며, 김치로부터 분리한 유산균 Lactobacillus sakei OPK2-59의 GABA 생성능을 확인하였고 멸치 젓갈로부터 GABA를 생성하는 Lactobacillus 속을 분리 및 동정 하였고, 원유에서 1％ MSG를 포함한 배지에서 711.40 ㎍/g의 GABA를 생성하는 Lactobacillus acidophilus RMK567를 분리하는 등 전통발효 식품뿐만 아니라 다양한 발효식품에서 고농도의 GABA 생성하는 유산균을 분리하는 연구가 활발히 진행되고 있다.

미강은 벼의 도정과정 중 발생하는 부산물로 연간 10만 톤 정도 생산되는 것으로 추정되고, 극히 일부만 미강유로 제조되고 있으며 대부분은 산패하기 쉽고 저장이 어려워서 식품으로 소비되기 보다는 사료용이나 농산폐기물로 처리되고 있는 실정이다. 미강의 주성분은 수분 함량 14%를 기준으로 할 때 조단백질 11~15%, 조지방질 15~20%, 탄수화물 34~52% 정도 함유하고 있으며, 식이섬유, 비타민류, 미네랄 성분들 외에 phytic acid, γ-oryzanol, tocopherols, tocotriends 및 phenolic 성분 등과 같은 항산화 물질 등 다양한 생리활성 물질들이 존재하고 있다. 최근까지 핵산, 메탄올 및 에틸아세테이트 등 다양한 용매별 추출물의 phytochemical과 항산화 효과, 염증 반응 억제 활성, 미강층에 포함되어 있는 viramin E로 인한 혈중 콜레스테롤 저하, 쌀겨 추출물의 간암 세포주와 자궁경부암 세포주에 대한 항암 및 항알레르기 효과, 추출물의 변이원성 억제, 혈압 상승 억제 등 다양한 생리적 기능에 대한 연구가 보고되어 있다. 그러나 곡류의 도정 과정으로 인해 미강의 발생량의 15~20% 정도만이 미강유(rice bran oil) 제조에 사용되고 있으며, 나머지는 사료나 비료로 사용되거나 폐기물로 처리되고 있어 산업적인 가치가 매우 낮게 치부되고 있는 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

대한민국 공개특허 10-2013-0068864

본 발명자들은 다양한 생리활성 기능을 갖는 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid, GABA)를 생산할 수 있으며 동시에 미강 추출물을 발효시킬 수 있는 유산균을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 사람의 분변에서 분리된 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11 균주가 GABA의 생성능이 매우 우수하고 미강 추출물을 발효시켜 GABA를 생성할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11 균주를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 균주 또는 상기 균주에 의한 발효물을 포함하는 식품조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주 및 미강 추출물을 포함하는 감마아미노부티르산 생성을 위한 발효용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용하여 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물을 제조하는 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법에 의해 제조된 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물이 도포된 곡류를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주를 제공한다.

본 발명의 균주는 사람의 분변으로부터 분리되어 감마아미노부티르산의 생성능이 매우 우수한 것으로 확인되어 선별된 신규 균주이다.

본 발명의 균주는 생리학적, 생화학적 시험을 통해 그람(Gram) 양성이고 간균이며 산소유무와 관계없이 잘 생장하며, 카탈라아제 반응(catalase reaction)은 음성을 나타낸다는 것이 확인된 균주이며, 16s rDNA 분석 결과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 동정되어 최종적으로 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11로 명명하였다. 본 발명의 상기 균주는 2013년 12월 26일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 수탁번호 KACC91917P로 기탁하였다. 본 발명의 상기 균주는 서열번호 3에 개시한 16s rDNA의 부분 핵산 염기서열을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주를 발효용 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid)을 생산하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 균주를 배양하는 방법은 통상의 원핵세포 미생물의 배양방법이 사용된다. 본 발명의 균주를 배양하기 위한 발효용 배지는 균주 세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기질 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 에탄올, 프로판과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 육추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물, 트립톤(tryptone); 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기질은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.

균주의 배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 15 내지 45℃의 범위내에서 행하고, 배양시간은 특별하게 한정되지 않으나, 일반적으로 5시간 내지 7일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물을 제조하는 방법을 제공한다: (a) 미강 추출물을 포함하는 배지 조성물을 준비하는 단계; (b) 상기 준비된 배지 조성물에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주를 접종하는 단계; (c) 상기 단계 (b)의 결과물을 발효시키는 단계.

본 발명의 균주는 미강 추출물이 포함된 배지 조성물을 사용하여 감마아미노부티르산(GABA)를 생성시킬 수 있다.

상기 단계 (a)의 미강 추출물을 포함하는 배지 조성물에는 바람직하게는 덱스트로스, 수크로오스, 락토오스, 갈락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소원; 육추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 탈지유(skim milk) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 질소원; 및 소디엄 아세테이트(sodium acetate), 다이포타슘 설페이트(dipotassium sulfate), 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 암모늄 설페이트(ammonium citrate) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 무기질을 더 포함할 수 있으며, 가장 바람직하게는 상기 탄소원으로서 수크로오스, 상기 질소원으로서 탈지유, 상기 무기질로서 마그네슘 설페이트를 포함한다.

상기 단계 (a)의 배지 조성물에서 탄소원의 함유량은 0.1-10％(w/v)이며, 질소원의 함유량은 0.5-10％(w/v)이며, 무기질의 함유량은 0.05-1.0％(w/v)이고, 보다 바람직하게는 탄소원의 함유량은 0.5-3％(w/v), 질소원의 함유량은 0.5-4％(w/v), 무기질의 함유량은 0.05-0.4％(w/v)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 단계 (a)의 배지 조성물에서 0.5-3％(w/v)의 수크로오스, 0.5-4％(w/v)의 탈지유, 0.05-0.4％(w/v)의 마그네슘 설페이트가 포함된다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 단계 (a)의 배지 조성물은 감마아미노부티르산(GABA)의 생성량을 증대시키기 위해 MSG (monosodium L-glutamate)를 더 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주 및 미강 추출물을 포함하는 감마아미노부티르산 생성을 위한 발효용 조성물을 제공한다.

상기 감마아미노부티르산(GABA) 생성을 위한 발효용 조성물은 덱스트로스, 수크로오스, 락토오스, 갈락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소원; 육추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 탈지유(skim milk) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 질소원; 및 소디엄 아세테이트(sodium acetate), 다이포타슘 설페이트(dipotassium sulfate), 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 암모늄 설페이트(ammonium citrate) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 무기질을 더 포함하고, 가장 바람직하게는 탄소원으로서 수크로오스, 질소원으로서 탈지유, 무기질로서 마그네슘 설페이트를 포함한다.

본 발명의 감마아미노부티르산 생성을 위한 발효용 조성물에서 탄소원의 함유량은 0.1-10％(w/v)이며, 질소원의 함유량은 0.5-10％(w/v)이며, 무기질의 함유량은 0.05-1.0％(w/v)이고, 보다 바람직하게는 탄소원의 함유량은 0.5-3％(w/v), 질소원의 함유량은 0.5-4％(w/v), 무기질의 함유량은 0.05-0.4％(w/v)이다. 가장 바람직하게는 발효용 조성물에서 탄소원으로서 수크로오스는 0.5-3％(w/v), 질소원으로서 탈지유는 0.5-4％(w/v), 무기질로서 마그네슘 설페이트는 0.05-0.4％(w/v)의 함유량으로 포함된다. 본 발명의 발효용 조성물에는 GABA의 생성 증대를 위해 MSG (monosodium L-glutamate)가 더 포함될 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주 또는 상기 균주에 의한 발효물을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 균주 또는 이 균주의 발효물은 식품 조성물의 유효성분으로 포함될 수 있다. 이러한 식품 조성물은 본 발명의 균주 또는 균주의 발효물을 포함하고 있으므로, GABA를 고함량으로 포함하는 기능성 식품 조성물로 제조된다.

본 발명의 식품 조성물은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 감미제 또는 천연 탄수화물을 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 예를 들어, 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등); 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등); 올리고당; 폴리사카라이드 (예컨대, 덱스트린,시클로덱스트린 등); 및 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)을 포함한다. 감미제로서 천연 감미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등) 및 합성 감미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)을 이용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 설명된 방법에 의해 제조된 것으로서 감마아미노부티르산(GABA)가 고농도로 함유된 미강 추출물의 발효물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기한 감마아미노부티르산(GABA)이 함유된 미강 추출물의 발효물이 도포된 곡류를 제공한다. 상기 곡류는 바람직하게는 쌀, 현미, 찰현미 또는 노란차좁쌀이다. 본 발명의 발효물을 곡류에 안정하게 도포시킴으로써 GABA의 함량이 증가된 기능성 곡류를 제공할 수 있다.

도 1은 GABA의 표준곡선이다.
도 2는 분리한 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 16s rDNA 부분 서열(서열번호 3)을 락토바실러스 브레비스(L. brevis)와 비교한 것이다(Query means CFM11 isolated and sbjct means L. brevis ).
도 3은 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 계통수이다.
도 4는 다양한 온도에서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 성장을 측정한 결과이다.
도 5는 다양한 온도에서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 pH 변화를 측정한 결과이다.
도 6은 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11을 염산(HCl)용액에서 3분간 인큐베이션한 후 생존율을 측정한 결과이다.
도 7은 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생산량에 미치는 인큐베이션 온도 및 시간의 영향을 측정한 결과이다.
도 8은 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생산량에 미치는 MSG (monosodium L-glutamate)첨가량의 영향을 측정한 결과이다.
도 9는 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생산량에 미치는 탄소원(a), 질소원(b) 및 무기질(c)의 첨가량의 영향을 측정한 결과이다.
도 10은 미강 추출물 배지에서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생산량에 미치는 MSG 농도의 영향을 측정한 결과이다.
도 11은 쌀 입자의 공초점 레이저 스캐닝 현미경 이미지이다. (a) 통상적 스프레이법, (b) 정전 스프레이법.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

1. 사용균주 및 배지

본 연구에서는 직접 가정용 김치, 시중에 판매하는 막걸리, 성인 분변에서 분리한 균주를 사용하였다. 분리된 균주에서 GABA 생성능이 우수한 유산균을 선발하여 실험하였다. 유산균의 생육배지로는 Lactobacilli MRS broth(Difco.)를 사용하였으며, 미강추출물 배지에 사용된 미강은 ㈜천보내츄럴푸드에서 제공받아 사용하였다.

2. 정전 스프레이(electrostatic spray)와 적용 곡류

정전 스프레이(Electrostatic spray; SE-EB, ESS, Maxcharge™, electrostatic spraygun)를 이용하여 ㈜천보내츄럴푸드의 쌀, 노란차좁쌀, 현미, 찰현미에 분주하여 적용하였다. 정전 스프레이법과 비교하기 위해 통상적 스프레이(conventional spray; QIXINDAOJIN CO., STD., ㈜Tree)를 사용했다.

3. 유산균의 분리 및 균주 보관

본 실험에서 시료로 사용된 재료는 가정용 김치, 시중에 판매하는 막걸리, 성인 분변을 수거하여 사용하였다. 이를 0.85% NaCl 용액을 이용해 10⁷까지 십진법으로 희석 후 MRS 배지(Difco, Detroit, MI, USA)에 0.1㎖씩 평판도말법으로 접종하여 37℃에서 24시간 동안 호기/혐기 배양하였다. 배양 후 미색으로 변한 균락을 잠정적 유산균으로 선발하였고, 이를 MRS 배지를 이용해 순수분리 하였다. 이들 균주를 50%의 글리세롤(glycerol)이 함유된 배지에 접종하여 -85℃의 deep freezer(Ulter-low temperature freezer, MDF-192, Sanyo Electric Biomedical Co., Ltd., Osaka, Japan)에 보관하여 사용하였다.

4. 유산균의 동정 및 분석

(1) 생물학적 동정

GABA 생성능이 가장 우수한 균주를 선발하여 MRS broth(Difco, Detroit, MI, USA)에서 3회 이상 계대 배양하여 활성을 높인 후 실험에 사용하였다. 순수 분리된 유산균의 동정은 현미경 관찰, 그람 염색, 카탈라아제(catalase) 생성 여부, 호기적 및 혐기적 생장, 15℃ 및 45℃에서의 생장을 확인하였다.

(2) API 50 CHL kit 분석

생물학적 동정 결과 유산균으로 추정되는 균주를 API 50 CHL kit (API bioMerieux, France)를 이용하여 총 49종의 당 발효 실험을 실시하였고, 이를 ATB identification system (bioMerieux, France)에 입력하여 유산균의 속(genus)과 종(species)를 결정하였다(표 1 참조).

산 생성 테스트 물질
Glycerol	Salicin
Erythritol	Cellobiose
D-Arabinose	Maltose
L-Arabinose	Lactose
Ribose	Melibiose
D-Xylose	Saccharose
L-Xylose	Trehalose
Adonitol	Inulin
β-Methyl-D-Xyloside	Melezitose
Galactose	D-Raffinose
D-glucose	Starch
D-Fructose	Glycogen
D-Mannose	Xylitol
L-Sorbose	β Gentiobiose
Rhanmnose	D-turanose
Dulcitol	D-lyxose
Inositol	D-tagatose
Mannitol	D-fucose
Sorbitol	L-fucose
α-Methyl-D-Mannoside	D-arabitol
α-Methyl-D-Glucoside	L-arabitol
N acetyl glucosamine	Gluconate
Amygdalin	2-keto-gluconate
Arbutin	5-keto-gluconate
Esulin

(3) 16s rDNA 서열 분석

유산균의 DNA 서열분석은 유니버설 프라이머 27F (5'-AGACTTTGATCCTGGCTCAG-3': 서열번호 1)와 프라이머 1492R (5'-GGTTACCTTGTTAGCACTT-3': 서열번호 2)을 사용하였으며, Solgent EF-Taq을 사용하여 RT-PCR을 실시하였다. 증폭과정은 95℃에서 15분간 초기변성(initial denaturation) 처리 후, 변성(denaturation, 95℃, 20초), 어닐링(annealing, 50℃, 40초), 연장(extension, 72℃, 90초) 과정을 30회 반복하였다. 마지막으로 72℃에서 5분 간 최종 연장(final extension)을 시킨 후 그 결과물에 대한 염기서열 분석결과를 BLAST program을 통해 확인하였다.

5. 유산균의 생장

유산균의 생장은 MRS broth에 5%(v/v)의 유산균을 접종한 후 온도별 (25℃, 37℃ 및 45℃)에서 48시간 동안 배양하면서 3시간 간격으로 pH meter(720p, Istek Inc., Seoul, Korea)를 이용해 pH를 측정하였고, 분광기(spectrophotometer, Spectro Art200, Wealtec Corp., U.S.A.)을 이용하여 660nm에서 OD (optical density)를 측정하였다.

6. 분리 유산균의 pH 저항성

5M HCl 용액을 이용하여 MRS broth의 pH를 각각 2, 3, 4로 맞춘 후 분리균주를 5%(v/v) 접종하였다. 이를 37℃에서 0, 1, 2, 3시간 동안 배양 후 MRS 배지에 십진법으로 희석한 균배양액(10^-1~10^-7)을 0.1mL씩 분주한 다음 평판도말법을 이용해 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 나타난 콜로니 개수를 세어 생균수를 측정하였고, 대조군인 pH 6.5의 MRS broth에 배양한 생균수와 비교 및 분석하였다.

7. 감마아미노부티르산(GABA)의 정량 방법

(1) 시료의 전처리

분리된 유산균을 에펜도르프 튜브(eppendorf tube)에 배양액 100 ㎕와 메탄올 400 ㎕를 넣고 잘 섞은 다음 70℃로 예열된 수조(water bath)에서 30분 동안 완전 건조시켰다. 여기에 70 mM LaCl₃ 1 mL을 가하여 잘 섞고 10,000rpm, 4℃에서 5분 간 원심분리 후 상등액 700 ㎕와 0.1M KOH 160 ㎕을 에펜도르프 튜브에 가한 다음 5분 간 교반하였다. 이를 다시 10,000rpm, 4℃에서 5분 간 원심분리 한 후, 상등액 550 ㎕를 큐벳(cuvette)에 넣는 방법(Zhang, G. and Bown, A. W. 1997. The rapid determination of gamma aminobutyric acid. Phytochem. 44: 1007-1009)을 참고하여 1/5로 버퍼(buffer)로 희석 후, 96-웰에 스케일 다운(scale down)하여 상등액 110 ㎕를 넣었다.

(2) 표준곡선 준비 및 GABA의 정량

Ezymatic GABase assay법을 바탕으로 1 mM GABA(Sigma-Aldrich, A5835, U.S.A.), 0.5M K4P2O7, 4 mM NADP(Sigma-Aldrich, N5755, U.S.A.), 2.0 units Gabase/mL(Sigma-Aldrich, G7509, U.S.A.), 20 mM α-Ketoglutarate(KG)(Sigma-Aldrich, K1750, U.S.A.)를 제조하였다. 그리고 1 mM GABA, 0.5 M K4P2O7, 4 mM NADP, 2.0units Gabase/mL을 혼합하여 340 nm에서 흡광도를 측정(initial A)하고, α-KG를 가하여 1시간 동안 실온에서 방치한 후 ELISA Reader를 이용하여 340nm에서 흡광도를 측정(finial A)한 다음 검량선을 작성한 후 GABA량은 ㎍/mL로 나타냈었다(도 1). 모든 실험은 3회 반복 실험하였다.

(3) 온도와 시간에 따른 GABA 생성량 측정

MRS broth에 5%(v/v) 분리균주를 접종 후 25, 37 및 45℃에서 각각 24, 48, 및 72시간 동안 배양한 후 미리 구한 표준곡선을 이용하여 GABA량을 측정하였다.

(4) pH에 따른 GABA 생성량 측정

5M HCl 용액을 이용하여 MRS broth의 pH를 각각 2, 3 및 4로 맞춘 후 분리균주를 5%(v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양한 후 표준곡선을 이용하여 GABA량을 측정하였다.

(5) MSG (monosodium L-glutamate)에 따른 GABA 생성량 측정

MRS broth에 MSG를 각각 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 및 1.0(w/v)%씩 첨가하여 121℃에서 15분 간 습열 멸균 시킨 후 이에 분리균주를 5%(v/v) 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 미리 구한 표준곡선을 이용하여 GABA량을 측정하였다.

8. 미강 추출물 배지의 최적화

일반적으로 세포 배양의 경우, 배지 조성에 대한 최적 조건을 설정할 때 하나의 요인을 여러 수준으로 놓고 나머지 요인들을 고정시켜 실험하는 "one factor at a time method(OFAT)"를 이용한다. 이 방법은 주어진 조건에서 그 요소의 영향을 파악할 수 있다는 장점이 있어, 본 실험에서도 이 방법을 사용하였다.

(1) 미강 추출물 배지 제조

㈜천보내츄럴푸드에서 제공받은 미강에 10배의 증류수를 가한 후 55℃에서 24시간 온수 추출하였다. 이를 여과지(Whatman No. 3, Whatman)를 이용하여 감압여과 하고, pH 6.5로 조정하고 autoclave(121℃, 15분)로 멸균하여 배지로 사용하였다.

(2) 배지 최적화에 따른 GABA 생성량

유산균 배양배지인 MRS broth의 구성성분을 바탕으로 미강 추출물에 첨가할 탄소원(dextrose, sucrose, lactose, galactose), 질소원(beef extract, peptone, trytone, skim milk), 무기염류(sodium acetate, dipotassium sulfate, magnesium sulfate, ammonium citrate)를 선정하고, 이를 탄소원, 질소원은 2%(w/v)씩, 무기염류는 0.2%(w/v)씩 첨가 후, autoclave (121℃,15분)로 멸균하여 배지로 사용하였다(표 2).

탄소원(2% w/v)	질소원(2% w/v)	무기염류(0.2% w/v)
Dextose	Beef extract	Sodium acetate
Sucrose	Peptone	Dipotassium phosphate
Lactose	Tryptone	Magnesium sulfate
Galactose	Skim milk	Ammonium sulfate

이에 5%(v/v) 분리균주를 접종 후 37℃에서 24시간 동안 배양하면서 OD (optical density), pH 변화, GABA 생성량을 측정하였다. GABA 생성량 측정 결과 탄소원, 질소원, 무기염류에서 GABA량이 가장 높은 배지를 선정하고 OFAT법에 기초하여 한 요인을 다양한 수준으로 첨가하면서 다른 요인들을 고정시킨 값을 첨가한 미강 추출물 배지를 이용하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 GABA량을 측정하였다.

9. 정전 스프레이(electrostatic spray)

정전 스프레이의 도포성을 확인하기 위해 농축된 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균체를 pyronin Y(Sigma, U.S.A.)로 10분간 염색한 후 여러 차례 원심분리를 통하여 세척하고 쌀에 1m 떨어진 거리에서 통상적 스프레이법(conventional spray)와 정전 스프레이법(electrostatic spray)를 이용하여 분주한 후 염색된 쌀알을 광학적 절편(optical sectioning)으로 연속적 영상을 재구성하여 관찰하였다.

(1) 정전 스프레이 처리 후 GABA 함량

최적화된 미강추출물에 배양된 균주를 5%(v/v)를 접종하여 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 5 mL 배양액을 곡류로부터 1m 떨어진 거리에서 정전 스프레이를 이용하여 분주하고 37℃에서 24시간동안 건조시킨 후 GABA량을 측정하였다.

(2) 정전 스프레이 처리 후 온도 저항성

최적화된 미강추출물에 배양된 균주를 5%(v/v)를 접종하여 37℃에서 24시간동안 배양한 후, 5 mL 배양액을 곡류로부터 1m 떨어진 거리에서 정전 스프레이(electrostatic spray)를 이용하여 분주하고 37℃에서 24시간동안 건조시킨 후 50, 70 및 100℃에서 1, 2 및 3시간동안 열처리를 하고 GABA량을 측정하였다.

(3) 정전 스프레이 처리된 곡류 취반 후 GABA 함량

최적화된 미강추출물에 배양한 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11을 정전 스프레이를 이용해 곡류 100g에 분주한 후 24 hr 건조 후 시료 무게의 5배의 증류수를 가하여 1분간 10회 저어주며 세척한 후 GABA량 측정 실험에 사용하였다. 취반은 세척한 곡류 50g에 1.3배의 증류수를 가하여 전기밥솥(CW-8500P, MediHeim, KOREA)에서 약 40분간 가열 취반하였으며 취반 후 실험에 사용하여 GABA량을 측정하였다.

실험결과

1. 유산균의 분리 및 동정

(1) 유산균의 분리 및 API 50 CHL 키트

시료로 사용된 재료들은 가정용 김치, 시판용 막걸리, 성인 분변을 수거하여 사용하였다. 멸균된 0.85% NaCl 용액으로 단계 희석하고, MRS 분별배지를 사용하여 미색의 집락을 형성하는 50여개의 단일 균락을 분리하였다. 그리고 분리한 균주를 잠정적으로 유산균이라 추정하였다. 분리한 유산균의 속(genus)와 종(species)를 결정하기 위하여 생리적, 생화학적 시험을 하였으며, 그 결과는 표 3에 나타내었다. 선발된 유산균을 그람(Gram) 양성임이 확인되었고, 현미경 관찰 시 긴 막대 모양의 rod 형태이었으며, 운동성은 음성으로 나타났다. 산소의 유무와 관계없이 잘 생장하였다. 또한, 카탈라아제 반응(catalase reaction)은 음성을 나타내었고, 15℃와 45℃에서는 잘 자라지 못하였다.

그람(Gram) 반응	+
세포 형태	rod
운동능	-
호기 성장	+
혐기 성장	+
카탈라아제 반응(Catalase reaction)	-
15℃에서의 성장	-
45℃에서의 성장	-

종(species)을 정하기 위하여 API 50 CHL kit(Bio-Mereux, France)를 이용하여 49종의 당 발효 시험을 실시한 결과 리보오스(ribose)등 12종으로부터 산을 생성하였다(표 4). 그 결과를 ATB identification system에 입력한 결과 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis)로 판명되었다.

산 생성
Glycerol	-	Salicin	-
Erythritol	-	Cellobiose	-
D-Arabinose	-	Maltose	+
L-Arabinose	-	Lactose	-
Ribose	+	Melibiose	+
D-Xylose	+	Saccharose	-
L-Xylose	-	Trehalose	-
Adonitol	-	Inulin	-
β-Methyl-D-Xyloside	-	Melezitose	-
Galactose	+	D-Raffinose	-
D-glucose	+	Starch	-
D-Fructose	+	Glycogen	-
D-Mannose	-	Xylitol	-
L-Sorbose	-	β-Gentiobiose	-
Rhanmnose	-	D-turanose	-
Dulcitol	-	D-lyxose	-
Inositol	-	D-tagatose	-
Mannitol	-	D-fucose	-
Sorbitol	-	L-fucose	-
α-Methyl-D-Mannoside	-	D-arabitol	-
α-Methyl-D-Glucoside	+	L-arabitol	-
N acetyl glucosamine	+	Gluconate	+
Amygdalin	-	2-keto-gluconate	-
Arbutin	-	5-keto-gluconate	+
Esulin	+

(2) 16s rDNA 서열 분석

16s ribosomal RNA 코딩 DNA의 서열분석은 유니버설 프라이머 27F와 프라이머 1492R을 사용하여 RT-PCR을 실시하였고 증폭하여 분석하였다. 분석된 염기서열을 그대로 이용하여 BLAST program을 통해 확인해 본 결과 락토바실러스 브레비스(L. brevis; I.D. 99%)로 동정되어 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11로 명명하였다(도 2, 서열번호 3). 그리고 분리된 균주의 종과 종(species), 유전자와 유전자의 계도(genealogical)의 관계를 알아보기 위하여 계통수(phylogenetic tree)를 그려 작성했다(도 3). 상기 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균주를 2013년 12월 26일자로 국립농업과학원 농업유전자원센터(KACC)에 수탁번호 KACC91917P로 기탁하였다.

2. 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 생장 측정

(1) 락토바실러스 브레비스 CFM11의 생장곡선 및 pH 변화

도 4에서 보는 바와 같이 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 최적 생장온도를 알아보기 위하여 온도별(25, 37 및 45℃)로 48시간 동안 배양하면서 3시간 간격으로 OD (optical density)를 측정한 결과 최적 생장온도는 37℃로 나타났고, 25℃, 37℃에서 24시간까지는 OD (optical density)값이 계속 증가하다 25℃에서 1.277, 37℃에서 2.086로 나타났고 48시간에서 감소한 것을 볼 수 있었다. 45℃에서는 9시간에서 가장 높은 O.D.값이 측정되었으나 생육이 더디게 진행되었다. 도 5에서 보는 바와 같이 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 pH는 25℃에서 48시간 후 4.42, 37℃에서 48시간 4.35 까지 떨어졌다. 이를 통해 37℃에서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11이 가장 많은 유기산을 생성한 것으로 볼 수 있었다. 반면에 45℃에서는 48시간 동안 pH의 감소폭이 작게 나타나 유기산 생성이 다른 온도에 비해 적은 것을 알 수 있었다.

(2) 락토바실러스 브레비스 CFM11의 pH 저항성

산에 대한 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 내산성 결과는 도 6에서 보는 바와 같다. 분리균주의 내산성 측정을 위한 대조구인 pH 6.5의 균수는 6.77 log CFU/mL에서 3시간 경과 후 7.01 log CFU/mL로 증가하였다. 그러나 이에 반해 pH 3과 4에서 생균수가 감소하였다. 즉 pH 3.0은 배양시간이 경과함에 따라 서서히 감소하여 초기균수 6.67 log CFU/mL에서 배양 3시간 후에는 6.50 log CFU/mL 수준으로 0.17 log cycle./mL 정도의 생균수가 감소한 것으로 나타났다. 반면에 pH 2에서는 초기균수 6.63 log CFU/mL에서 1시간 후부터 균이 생존하지 않은 것으로 나타나 균이 99% 사멸하여 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11는 낮은 pH에 내성을 갖지 않는 것으로 보인다.

3. 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생성 측정

(1) 상업용 유산균과 분리한 유산균의 GABA 생성량 비교

본 실험에서 한국생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에서 분양받은 상업용 유산균과 본 발명에서 분리한 유산균을 MRS broth에 5%(v/v) 접종하여 24시간 배양 후 GABA량을 측정한 결과는 표 5와 같다. 상업용 유산균의 6~9 ㎍/mL GABA량에 비해 김치(L. brevis CFM20 378.18 ㎍/mL), 막걸리(L. acidophilus 37.34 ㎍/mL)에서 분리한 균주의 GABA량이 더 높게 측정되었고, 성인의 분변에서 분리한 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11가 623.84 ㎍/mL로 가장 높은 GABA량이 측정되었다.

균주	분리원	GABA(㎍/mL)
L. acidophilus	KCTC3164	6.42ㅁ0.21¹⁾
Streptococcus thermophilus	KCTC3658	9.97ㅁ0.04
Leuconostoc mesentreroids	KCTC8293	7.62ㅁ1.62
Lactococcus lactis	KCTC3926	8.78ㅁ0.73
L. plantarum	Kimchi	27.24ㅁ0.24
L. sakei strain M1-1	Kimchi	6.87ㅁ.012
L. brevis CFM20	Kimchi	378.18ㅁ1.59
L. bulgaricus	Kimchi	4.67ㅁ0.73
L. lactis	Kimchi	6.42ㅁ0.15
L. brevis	Makgeolli	35.39ㅁ0.22
L. acidophilus	Makgeolli	37.34ㅁ0.94
Lactococcus lactis	human feces	128.67ㅁ7.99
L. brevis CFM 11	human feces	623.84ㅁ16.67

(2) 락토바실러스 브레비스 CFM11의 GABA 생성량

① 온도, 시간에 따른 L. brevis CFM11의 GABA 생성량

온도와 시간에 따른 GABA 생성량은 25, 37 및 45℃ 각각 350.92 ㎍/mL, 611.98 ㎍/mL, 182.69 ㎍/mL로 24시간에 가장 높은 GABA량이 나타났다. 그리고 세 온도 모두 시간이 증가할수록 GABA량이 감소하는 것을 알 수 있었다. 특히, 72시간이 지난 후, 모든 온도에서 GABA량이 1/2배 이상씩 감소한 것을 볼 수 있었다(도 7). 따라서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11는 37℃, 24시간 배양했을 때, GABA량이 가장 높은 것을 알 수 있었다.

② pH에 따른 락토바실러스 브레비스 CFM11의 GABA 생성량

분변에서 분리한 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 pH에 따라 24시간 배양 후, GABA 생성량은 표 6과 같다. 대조구인 pH 6의 GABA량은 597.159 ㎍/mL로 나타났고, pH 5에서는 이와 비슷한 수치가 보였다. 그러나 pH 4는 310.23 ㎍/mL, pH 3은 46.02 ㎍/mL, pH 2는 17.61 ㎍/mL로 대조구보다 약 35배 감소한 것으로 나타났고, 이는 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11은 내산성이 약하여 GABA 생성량에도 영향을 미치는 것을 알 수 있었다. 따라서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 고농도 GABA 생성량을 얻기 위해서는 pH 6에서 배양하는 것이 가장 적절한 것으로 보인다.

pH	GABA(㎍/mL)
2	17.613±1.47^c1)
3	46.023±3.46^c
4	310.227±3.10^b
5	531.818±5.31^a
6	597.159±18.12^a

1) 측정값들은 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 상이한 문자로 표시한 평균값들은 다른 값들과 통계학적으로 유의한 차이(P 0.05)를 나타낸다.

③ MSG (monosodium L-glutamate) 첨가에 따른 락토바실러스 브레비스 CFM11의 GABA 생성량

MRS broth 배지에 MSG 농도별 첨가에 따른 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생성량은 도 8와 같다. 뇌에서는 글루탐산(glutamic acid)을 연료로 사용하는데 뇌의 혈관장법(BBB)를 통과하지 못하는 글루탐산은 대사를 통해 글루타민(glutamine)이 되어 BBB를 통과한 다음 다시 글루탐산으로 바뀌어 GABA의 전구물질로 활용된다. 따라서 MSG 첨가는 GABA 전환율을 증가시킬 것으로 보인다. 실험결과 MSG의 함량이 증가할수록 GABA량이 증가했으며, 0.8%(v/v)에서 2002.93 ㎍/mL 가장 높은 GABA량이 측정되었다. 그러나 통계처리 결과, 0.4-1.0% MSG 첨가 후 GABA 생성량이 실험적으로 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다. 따라서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생성량을 증가시키기 위해서는 0.4%의 MSG로도 충분할 것으로 보인다.

(3) 미강 추출물 배지의 최적화

① 탄소원, 질소원, 무기질 첨가에 따른 흡광도, pH 변화, GABA 생성량

미강 추출물에 탄소원 4종, 질소원 4종, 무기질 4종을 첨가하여 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 배지로 사용하여 37℃에서 24시간 배양하여 나타난 O.D.값, pH, GABA 생성량을 표 7에 나타내었다.

상기 표 7에서 1) 미강추출물에 2%(w/v)추가; 2) 미강추출물에 0.2%(w/v) 추가; 3),4) 측정값들은 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 상이한 문자로 표시한 평균값들은 다른 값들과 통계학적으로 유의한 차이(P 0.05)를 나타낸다.

MRS 배지와 pH 6.4로 조정한 미강추출물 배지에서 배양한 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11가 생성한 GABA량은 각각 600.124 ㎍/mL, 61.039 ㎍/mL로 약 1/10배 정도 차이가 보였지만 미강 추출물에서도 GABA 생성을 하는 것을 알 수 있었다. 이는 미강의 성분인 조단백질 15%, 조지방질 20%, 탄수화물 52%와 비타민류와 미네랄 성분들로 인해 균 성장에 기여한 것으로 보인다.

한편, 미강과 같은 다양한 곡류 추출물에 균이 고농도의 GABA 생성을 위해 탄소원과 질소원을 첨가하는데, 따라서 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11이 미강추출물에서 GABA 생성을 강화하기 위해 2%(v/v) 탄소원(dextrose, sucrose, lactose, galactose)과 2%(v/v) 질소원(beef extract, peptone, trytone, skim milk), 0.02%(v/v) 무기질(sodium acetate, dipotassium sulfate, magnesium sulfate, ammonium citrate)를 첨가하여 GABA량을 비교하였다. 탄소원은 lactose, 질소원은 trytone, 무기질에서는 dipotassium sulfate에서 O.D 값이 1.421, 1.589, 1.594로 균의 생장이 가장 높았으나, GABA 생성량은 탄소원 수크로오스 124.68 ㎍/mL, 질소원 탈지유(skim milk) 216.47 ㎍/mL, 무기질 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate) 105.19 ㎍/mL에서 GABA 생성량이 가장 높게 나타났다(도 9). 이 결과로 보아 균의 생장과 GABA 생성량은 큰 상관관계가 없는 것으로 보인다. 그리고 탄소원과 무기질은 종류에 따라 GABA 생성량의 차이가 크게 나타났지만, 이에 반해 질소원은 종류에 큰 영향을 받지 않고 GABA량이 비슷하게 측정되었다. 따라서 미강 추출물 배지를 최적화 하는데 있어서, 탄소원으로서 수크로오스(sucrose), 질소원으로서 탈지유(skim milk), 무기질로서 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate)를 첨가한 경우 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11의 GABA 생성 능력이 우수하게 나타날 것이다.

② 수크로오스(sucrose) 첨가에 따른 GABA 생성량

락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균주는 미강 추출물 배지에 첨가되는 탄소원의 종류에 따라 GABA량이 다르게 나타났다. 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균주의 GABA 생산에 대한 탄소원의 영향을 조사하기 위해 덱스트로스(dextrose), 수크로오스(sucrose), 락토오스(lactose), 갈락토오스(galactose)을 2% 씩 첨가하여 GABA량이 가장 높게 측정된 수크로오스(sucrose)를 선정하였다. 리고 배지에 첨가한 다른 요인인 탈지유(skim milk), 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate)를 각각 같은 양을 첨가하여 고정시킨 후, 수크로오스(sucrose)를 다양한 수준(0-2 g/20 mL)으로 첨가하여 배양한 결과, 0.4 g에서 195.17 ㎍/mL 가장 높은 GABA 생성량이 나타났다(표 8). 그리고 0 g에서 0.4 g까지를 첨가량에 따라 GABA량이 증가하였으나, 0.4 g 이상으로 수크로오스를 첨가하면 GABA량이 급격히 감소하는 것을 알 수 있었다. 따라서 2％ 수크로오스를 첨가했을 때, GABA량이 가장 높게 나타났고, 3％ 이상부터는 GABA량이 약 1/2배 감소한 것으로 나타났다.

수크로오스(g/20mL)	GABA 함유량(㎍/mL)
0	32.078±2.83^f1)
0.1	62.066±1.41^d
0.2	131.567±9.90^b
0.4	195.165±5.66^a
0.6	82.722±2.83^c
0.8	85.123±1.41^c
1.0	66.198±9.90^d
1.4	53.801±1.42^de
2.0	45.537±2.88^e

③ 탈지유(skim milk) 첨가에 따른 GABA 생성량

락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균주는 미강 추출물 배지에 첨가 되는 질소원의 종류에 따라 GABA량이 다르게 나타났다. 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균주의 GABA 생산에 대한 질소원의 영향을 조사하기 위해 beef extract, peptone, trytone, skim milk를 2％씩 첨가하여 GABA량이 가장 높게 측정된 탈지유(skim milk)를 선정하였다. 미강 추출물 배지에 첨가한 다른 요인인 수크로오스(sucrose), 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate)를 각각 같은 양을 첨가하여 고정한 후, 탈지유(skim milk)를 다양한 수준(0 - 2 g/20 mL)으로 첨가하여 배양한 결과 0.2 g에서 267.61 ㎍/mL 가장 높은 GABA 생성량이 나타났다(표 9).

그리고 0 g에서 0.2 g까지를 첨가량에 따라 GABA량이 증가하였으나, 0.2 g 이상으로 skim milk를 첨가하면 GABA량이 증가하다가 감소하는 것을 알 수 있었고, 1.4 g 일 때 다소 GABA량이 증가한 것을 볼 수 있었다. 따라서 1％ 탈지유(skim milk)를 첨가했을 때, GABA량이 가장 높게 나타났다.

탈지유(g)	GABA 함유량(㎍/mL)
0	49.669±1.41^f1)
0.1	158.977±11.31^e
0.2	267.613±2.83^a
0.4	216.477±14.57^c
0.6	240.250±7.07^b
0.8	233.520±3.53^bc
1.0	190.341±14.57^d
1.4	176.704±9.48^de
2.0	165.340±7.07^e

④ 마그네슘 설페이트 첨가에 따른 GABA 생성량

락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균주는 미강 추출물 배지에 첨가 되는 탄소원의 종류에 따라 GABA량이 다르게 나타났다. 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11 균주의 GABA 생산에 대한 무기질의 영향을 조사하기 위해 sodium acetate, dipotassium sulfate, magnesium sulfate, ammonium citrate 0.02% 씩 첨가하여 GABA량이 가장 높게 측정된 magnesium sulfate를 선정하였다. 미강 추출물 배지에 첨가하는 다른 요인인 sucrose, skim milk를 각각 같은 양을 첨가하여 고정한 후, magnesium sulfate를 다양한 수준(0~2 g/20 mL)으로 첨가하여 배양한 결과 0.04 g에서 103.388 ㎍/mL 가장 높은 GABA 생성량이 나타났다(표 10). 그리고 0 g에서 0.04 g까지를 첨가량에 따라 GABA량이 증가하였고, 0.06 g 이상으로 magnesium sulfate를 첨가하면 GABA량이 감소하였고, 0.06-0.2 g에서 비슷한 수치를 나타나는 것을 볼 수 있었다. 따라서 0.2％ 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate)를 첨가했을 때, GABA량이 가장 높게 나타났다.

마그네슘 설페이트(g)	GABA 함유량 (㎍/mL)
0	46.198±1.56^f1)
0.01	64.462±5.66^de
0.02	76.859±3.96^b
0.04	103.388±4.24^a
0.06	75.330±3.25^bc
0.08	68.595±2.12^d
0.10	60.198±1.41^e
0.14	60.331±0.42^e
0.20	56.801±0.39^e

상기 표 10에서 1) 측정값들은 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 상이한 문자로 표시한 평균값들은 다른 값들과 통계학적으로 유의한 차이(P 0.05)를 나타낸다.

⑤ 최적화된 미강 추출물 배지의 GABA 생성량

앞서 진행한 실험 결과를 토대로 탄소원은 2% sucrose, 질소원은 1% skim milk, 무기질은 0.2%를 첨가하여 미강 추출물 배지를 최적화했다. 최적화 전 미강 추출물 배지에서 배양한 L. brevis CFM11의 GABA 생성량은 61.04 ㎍/mL를 생성한 반면, 최적화 후 미강 추출물 배지에서는 284.65 ㎍/mL의 GABA를 생성하여 4배 이상 증가할 것을 확인 할 수 있었다. 반면에 MRS broth에서 배양한 L. brevis CFM11의 GABA 생성량 600.12 ㎍/mL과 비교 했을 때, 미강 추출물 배지에서 배양한 것은 이에 약 1/2 수준인 것으로 나타났다(표 11).

GABA(㎍/mL)
최적화 이전	최적화 후			MRS broth
	수크로오스 2％	탈지유 1％	마그네슘 설페이트 0.2％
61.039±1.77¹⁾	284.65±4.77			600.12±15.24

상기 표 11에서 1) 측정값들은 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다.

⑥ 최적화 미강 추출물 배지의 MSG 첨가에 따른 GABA 생성량

최적화된 미강 추출물 배지에 고농도 GABA 생성을 위해 MSG를 첨가한 결과는 표 12 및 도 10와 같다. 최적화된 미강 추출물 배지에 0.4%(w/v) MSG를 첨가했을 때 585.80 ㎍/mL으로 GABA량이 가장 높게 측정되었고 이는 MSG가 첨가 되지 않은 미강 추출물 배지보다 약 2배 정도 GABA 생성량이 증가한 것으로 볼 수 있다. 또한 MRS broth 배지에서는 0.8%일 때 GABA 전환이 가장 우수했으나, 미강 추출물 배지에서는 0.4%일 때가 전환이 가장 우수했지만 0.2-0.6% 일 때, GABA량과 실험적으로 유의적 차이가 없는 것으로 나타났다. 그러나 0.6% 이상 첨가 하면 GABA 전환이 더디어 지는 것을 알 수 있었다. 따라서 최적화된 미강 추출물 배지에 MSG를 0.4% 첨가하여 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11이 생성하는 GABA량이 더 증가할 것이다.

MSG(%)	GABA (㎍/mL)
MSG(%)	미강 추출물	MRS broth
0	284.656±20.08^b1)	611.98±8.13^c
0.2	540.340±48.38^a	1080.35±10.54^b
0.4	585.796±36.16^a	1651.02±20.47^a
0.6	506.250±40.17^a	1739.00±55.21^a
0.8	432.386±13.28^ab	2002.93±46.71^a
1.0	392.613±12.05^ab	1900.29±36.63^a

상기 표 12에서 1) 측정값들은 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 상이한 문자로 표시한 평균값들은 다른 값들과 통계학적으로 유의한 차이(P 0.05)를 나타낸다.

4. 정전 스프레이(Electrostatic spray)

(1) 정전 스프레이법에 의한 분주 정도 측정

곡류가 함유하고 있는 GABA량은 쌀 32.23 ㎍/g, 현미 17.53 ㎍/g, 찰현미 7.79 ㎍

정전 스프레이(electrostatic spray)의 분포정도는 도 11와 같다. 쌀알을 공초점 레이져 스캐닝(confocal laser scanning)을 X position : 257, Y position : 257. Z position : 10-24 층으로 왼쪽에서 오른쪽으로 갈수록 바깥층인 연속 광학적 절편으로 나타냈다. 통상적 스프레이법(conventional spray)에 비해 정전 스프레이법(electrostatic spray)로 분주한 것이 더 넓게 분주되었고, 흡수된 정도도 큰 것으로 나타났다.

(2) 정전 스프레이 처리 후 곡류의 GABA 함량

곡류가 함유하고 있는 GABA량은 쌀 32.23 ㎍/g, 현미 17.53 ㎍/g, 찰현미 7.79 ㎍/g, 노란차좁쌀이 46.75 ㎍/g로 노란차좁쌀이 가장 많이 함유하고 있었다. 통상적 스프레이법(conventional spray)으로 분주했을 때, 찰현미가 7.79 ㎍/g의 GABA 함유량에서 42.15 ㎍/g로 GABA량이 약 6배 증가하여 다른 곡류에 비해 증가량이 가장 높았다. 그리고, 정전 스프레이(electrostatic spray)법으로 분주했을 때는 쌀의 32.23 ㎍/g에서 228.10 ㎍/g로 GABA량 약 7배 증가했고, 통상적 스프레이법으로 분주했을 때 87.60 ㎍/g 보다도 약 3배 증가한 것으로 나타났다. 쌀 이외에도 다른 곡류에서도 마찬가지로 통상적 스프레이법으로 분주했을 때보다 정전스프레이법으로 분주했을 때, GABA 생성량이 증가하였다. 따라서 정전 스프레이법의 정전기력으로 인해 목표 물체에 미강 발효물이 잘 부착하여 분포성이나 흡수성이 통상적 스프레이법 보다 우수하고 GABA량을 향상시키는 데 효과적인 것을 알 수 있었다.

	GABA (㎍/g)
	처리전	통상적 스프레이법	정전 스프레이법
쌀	32.234±16.23¹⁾	87.603±0.04	228.099±10.78
현미	17.532±2.78	71.074±11.69	161.983±23.38
노란차좁쌀	46.753±1.71	58.678±11.69	79.339±5.84
찰현미	7.792±0.64	42.149±5.84	46.281±17.53

상기 표 13에서 1) 측정값들은 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다.

(3) 정전 스프레이 처리 후 GABA의 온도 저항성

GABA는 해충감염 등과 같은 외부자극 및 종자의 발아 시 함량이 급격히 증가됨으로써 식물체의 성장과 자기방어 기능에 중요한 역할을 하는 것으로 보고되어 있다. 또한 식물에서 GABA의 함성은 여러 외부 환경적 요인에 의해 영향을 받는 것으로 보고되고 있다. 이에 최적화한 미강 추출물 배지에 배양된 락토바실러스 브레비스(L. brevis) CFM11를 정전 스프레이법으로 곡류에 분주 한 후, 24시간 건조시킨 후 온도별(50, 70 및 100℃), 시간별(1, 2 및 3시간)에 따른 곡류의 GABA량의 변화를 비교·분석하여 표 14에 나타냈다.

상기 표 14에서 1) 측정값들은 3회 반복실험의 평균±표준편차로 나타내었다. 상이한 문자로 표시한 평균값들은 다른 값들과 통계학적으로 유의한 차이(P 0.05)를 나타낸다.

쌀(rice)은 정전 스프레이법으로 처리한 후 50℃에서는 GABA량이 비슷하게 유지되었고, 70℃에서는 2시간까지 조금 증가하다 3시간 후 조금 감소했고 100℃에서는 228.10 ㎍/g인 GABA량이 약 300 ㎍/g 정도로 증가한 것을 볼 수 있었다. 즉, 온도가 증가할수록 쌀은 GABA량이 증가하였고 시간이 지남에 따라 GABA량이 감소한 것을 알 수 있었다. 현미(brown rice)는 다른 온도에 비해 100℃에서 GABA량이 약 2배 이상 증가하였고, 쌀과는 다르게 50, 70℃에서 시간이 지남에 따라 GABA량이 증가한 것을 볼 수 있었다. 노란차좁쌀(yellow-glutinous foxtail millet rice)은 온도에 관계없이 GABA량이 비슷하게 유지되거나 감소하는 경향을 나타냈다. 찰현미(glutinous brown rice)는 온도에 관계없이 GABA량이 약 10~20 ㎍/g 정도 증가하다가 시간이 지남에 따라 감소하는 것으로 나타났다. 그리고 공통적으로 온도가 증가함에 따라 유의적으로 GABA량이 증가한 것으로 나타났다. 이는 곡류들이 물리적 충격을 받아 GABA 생성이 증가한 것으로 예상된다.

(4) 정전 스프레이 처리 된 곡류 취반 후 GABA 함량

정전 스프레이 처리된 곡류를 취반한 결과 모두 GABA량이 감소했다. 쌀은 228.099 ㎍/g에서 취반 후 57.61 ㎍/g로 1/4배 감소하여 네 가지 곡류 중 감소량이 가장 크게 나타났으며, 현미와 노란차좁쌀은 각각 161.98 ㎍/g에서 80.52 ㎍/g로, 79.34 ㎍/g에서 39.67 ㎍/g로 약 1/2배씩 감소된 GABA량이 측정되었다. 찰현미도 마찬가지로 46.28 ㎍/g에서 25.26 ㎍/g로 약 1/2배씩 감소하였다. 취반과정 중 수세하는 과정이 정전 스프레이로 인해 곡류에 부착된 GABA를 씻겨 증가된 GABA량에 영향을 미치는 것으로 보인다. 따라서, 정전 스프레이 처리된 곡류를 취반한 후에는 GABA량이 감소한 것을 알 수 있었다(표 15).

	GABA (㎍/g)
	취반 전	취반 후
쌀	228.099±10.78¹⁾	57.613±1.10
현미	161.983±23.38	80.525±0.44
노란 차 좁쌀	79.339±5.84	49.667±0.49
찰 현미	46.281±17.53	25.258±0.22

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC91917

20131226

<110> Chungbuk National University Industry Academic Cooperation Foundation <120> Novel Gamma-Amino Butyric Acid Producing Strain of Lactobacillus Brevis CFM11 and Use of the Same <130> PN130665 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Universal PCR primer <400> 1 agactttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 1492R <400> 2 ggttaccttg ttagcactt 19 <210> 3 <211> 841 <212> DNA <213> Lactobacillus brevis strain CFM11 16S ribosomal RNA coding Partial DNA sequence <400> 3 ccttcctccg gtttgtcacc ggcagtctac ccagagtgcc caactgaatg ctggcaactg 60 ataataaggg ttgcgctcgt tgcgggactt aacccaacat ctcacgacac gagctgacga 120 caaccatgca ccacctgtca ttctgtcccc gaagggaacg tcttatctct aagattggca 180 gaagatgtca agacctggta aggttcttcg cgtagcttcg aattaaacca catgctccac 240 cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcaacc ttgcggtcgt actccccagg 300 cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact gaagggcgga aaccctccaa cacttagcac 360 tcatcgttta cggcatggac taccagggta tctaatcctg ttcgctaccc atgctttcga 420 gcctcagcgt cagttacaga ctagacagcc gccttcgcca ctggtgttct tccatatatc 480 tacgcattcc accgctacac atggagttcc actgtcctct tctgcactca agtctcccag 540 tttccgatgc acttctccgg ttaagccgaa ggctttcaca tcagacttaa aaaaccgcct 600 gcgctcgctt tacgcccaat aaatccggac aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct 660 gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaaataccg tcaacccttg aacagttact 720 ctcaaaggtg ttcttcttta acaacagagt tttacgagcc gaaacccttc ttcactcacg 780 cggcattgct ccatcagact ttcgtccatt gtggaagatt ccctactgct gcctcccgta 840 g 841

Claims

감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주.
감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주 또는 상기 균주에 의한 발효물을 포함하는 식품 조성물.
감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid) 생성능이 우수한 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주 및 미강 추출물을 포함하는 감마아미노부티르산 생성을 위한 발효용 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 덱스트로스, 수크로오스, 락토오스, 갈락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소원; 육추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 탈지유(skim milk) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 질소원; 및 소디엄 아세테이트(sodium acetate), 다이포타슘 설페이트(dipotassium sulfate), 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 암모늄 설페이트(ammonium citrate) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 무기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 탄소원은 수크로오스, 상기 질소원은 탈지유, 상기무기질은 마그네슘 설페이트인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 5 항에 있어서, 상기 조성물에서 상기 수크로오스는 0.5-3％(w/v), 상기 탈지유는 0.5-4％(w/v), 상기 마그네슘 설페이트는 0.05-0.4％(w/v)의 함유량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 상기 조성물은 MSG (monosodium L-glutamate)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주를 발효용 배지에 접종하여 배양하는 단계를 포함하는 감마아미노부티르산(γ-aminobutyric acid)을 생산하는 방법.
다음의 단계를 포함하는 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물을 제조하는 방법:
(a) 미강 추출물을 포함하는 배지 조성물을 준비하는 단계;
(b) 상기 준비된 배지 조성물에 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) CFM11(수탁번호: KACC91917P) 균주를 접종하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)의 결과물을 발효시키는 단계.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 배지 조성물은 덱스트로스, 수크로오스, 락토오스, 갈락토오스 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 탄소원; 육추출물(beef extract), 펩톤(peptone), 트립톤(tryptone), 탈지유(skim milk) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 질소원; 및 소디엄 아세테이트(sodium acetate), 다이포타슘 설페이트(dipotassium sulfate), 마그네슘 설페이트(magnesium sulfate), 암모늄 설페이트(ammonium citrate) 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군에서 선택되는 무기질을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 탄소원은 수크로오스, 상기 질소원은 탈지유, 상기 무기질은 마그네슘 설페이트인 것을 특징으로 하는 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 배지 조성물에서 상기 수크로오스는 0.5-3％(w/v), 상기 탈지유는 0.5-4％(w/v), 상기 마그네슘 설페이트는 0.05-0.4％(w/v)의 함유량으로 포함되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 배지 조성물은 MSG (monosodium L-glutamate)를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물.
제 14 항 기재의 감마아미노부티르산이 함유된 미강 추출물의 발효물이 도포된 것을 특징으로 하는 곡류.
제 15 항에 있어서, 상기 곡류는 쌀, 현미, 찰현미 또는 노란차좁쌀인 것을 특징으로 하는 곡류.