KR101740532B1 - 바실러스 리케니포미스 kj-10 균주 및 이의 용도 - Google Patents

바실러스 리케니포미스 kj-10 균주 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101740532B1
KR101740532B1 KR1020150081016A KR20150081016A KR101740532B1 KR 101740532 B1 KR101740532 B1 KR 101740532B1 KR 1020150081016 A KR1020150081016 A KR 1020150081016A KR 20150081016 A KR20150081016 A KR 20150081016A KR 101740532 B1 KR101740532 B1 KR 101740532B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
strain
bacillus licheniformis
amine
kacc92035p
present
Prior art date
Application number
KR1020150081016A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160144630A (ko
Inventor
김수진
권순우
홍승범
석순자
문지영
Original Assignee
대한민국
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 대한민국 filed Critical 대한민국
Priority to KR1020150081016A priority Critical patent/KR101740532B1/ko
Publication of KR20160144630A publication Critical patent/KR20160144630A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101740532B1 publication Critical patent/KR101740532B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • A23L11/09—
    • A23L11/20—
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00—Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/50—Soya sauce
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • C12R1/10—

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 효소활성 및 혈전분해능이 우수하며, 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 청국장 제조시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적은 바실러스 리케니포미스 (Bacillus licheniformis) KJ-10 (KACC92035P)균주 및 이를 포함하는 발효 식품을 제공하는데 있다. 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법, 상기 균주를 포함하는 발효 식품을 제공한다.

Description

바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주 및 이의 용도{Bacillus licheniformis strain KJ-10 and uses thereof}
본 발명은 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 효소활성 및 혈전분해능이 있는 바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해능을 가지면서 효소활성 및 혈전분해능이 우수하며, 청국장 제조시 휘발성 암모니아와 아민의 생산이 적은 바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주(KACC 92035P), 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제, 상기 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법, 상기 균주를 포함하는 발효 식품에 관한 것이다.
청국장은 콩을 원료로 한 우리나라의 대표적인 발효 식품으로서 간장, 된장, 고추장 등과 함께 오늘날까지 상용되어온 전통장류 중의 하나로, 곡류를 주식으로 하는 우리민족이 결핍되기 쉬운 필수아미노산 및 지방산의 급원식품으로서 중요한 역할을 담당하여 왔다. 청국장과 같은 콩 발효식품의 영양학적 연구와 더불어 전 세계 각국의 콩 발효식품에서 혈전용해, 항산화, 혈압강하 그리고 동맥경화 저해 등 기능성 연구가 활발히 진행 되고 있다.
우리나라 고유의 다른 장들에 비해 발효기간이 짧다는 장점을 가지는 청국장은 발효과정을 통해서 미생물의 amylase, cellulase, protease 및 lipase 등 다양한 효소의 분비에 의해 콩에 함유된 단백질, 올리고다당류, 이소플라본, 지질 등이 소화되기 쉬운 형태의 아미노산, 유리당, 이소플라본 아글리콘, 지방산 등으로 분해되어 항산화 및 혈전용해 기능을 갖는 2차 산물이 생성된다. 이러한 청국장의 효능으로써 콜레스테롤 저하, 항산화, 고혈압저하, 항균, 항암 효과 등이 보고 된 바 있고, Bacillus의 정장작용으로 최근 기능성식품으로 재조명 받고 있다.
콩을 주원료로 한 장류식품은 1960년 이전에는 주로 자가 생산하여 이용(농수축산신문. 한국식품연감, 1995)되어 왔으나 식품산업의 발달로 대량생산된 제품을 시중에서 쉽게 찾아 볼 수 있다. 하지만 최근에는 공정을 통해 상품화된 청국장 보다, 인터넷을 통한 상품판매와 택배 서비스를 이용하여 구입이 편리해짐으로써 전통제조방법으로 발효시킨 청국장의 수요가 늘고 있다. 전통제조방식의 청국장은 지방마다 제조방법이나 이용 미생물이 동일하지 않아 균일한 품질을 가지는 제품의 수는 적다. 특히, 청국장 발효 시 이용되는 균주의 종류에 따라 품질이 달라지기 때문에 고품질의 청국장 생산을 위해서는 고기능의 미생물을 선별하여 사용하는 것이 무엇보다 중요하다.
청국장은 영양학적, 생리학적 면에서 우수한 기능을 갖지만 발효 시 생성되는 이취와 바이오제닉 아민의 함량으로 인하여 그 소비가 제한되어지고 있다. 청국장의 이취는 단백질 함량이 높은 식품에서 발효미생물과 같은 미생물의 작용에 의해 생성되는 휘발성아민에 의해 야기되고, 바이오제닉 아민은 염기성 질소화합물로 일반적으로 아미노산을 전구체로 하여 탈카르복실화 되어 형성된다. 식품에서의 바이오제닉 아민의 형성은 냄새 뿐 만 아니라 건강에 영향을 끼친다. 또한 혈압에 영향을 미치며 식품에 일정한도 이상이 있을 때 민간한 사람에게 알러지 반응을 일으키며, 편두통 및 장과 위에 문제를 일으킬 수 있다. 최근 식품의 미생물에 의해 생성되는 바이오제닉 아민에 대한 연구와 전통 장의 바이오제닉 아민의 저감화를 위한 연구등이 활발히 진행되고 있다.
따라서 본 발명은 전통발효청국장에서 균주를 분리하여 우수한 기능의 미생물을 선발 및 동정하고자 한다. 7종의 B. cereus 독소 유전자 유무 판별을 수행하여 전통발효방법으로 제조한 청국장에서 분리한 균주들의 안전성을 확보하고, 오염 균을 억제할 수 있는 물질을 분비하는지 확인, 균주의 효소활성, 혈전분해능, 바이오제닉 아민 분해능, 관능평가, 휘발성아민 테스트를 진행하였고, 청국장발효 스타터와 같은 식품산업에서 이용 시 청국장의 품질지표 설정을 위한 기초자료로 이용하기 위하여 최종적으로 선발된 우수균주를 제공하고자 한다.
관련 선행기술로는 한국등록특허 10-1379230(장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 리케니포미스 SCK B11 균주 및 이의 용도)와 한국공개특허 10-1300191(티라민과 히스타민 분해능을 갖는 바실러스 리케니포미스 균주 및 이의용도)가 있다.
본 발명의 목적은 혈전분해능 및 효소활성이 우수하며, 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 청국장 제조시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적은 바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주 및 이를 포함하는 미생물 제제 및 발효 식품을 제공하는데 있다.
본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제들은 이상에서 언급한 기술적 과제들로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 다른 기술적 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 염기서열을 포함하며 기탁번호 KACC 92036P로 기탁된 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) JP-5 균주를 제공한다.
상기 균주는 혈전 분해능과 효소활성이 있는 것이 특징이다.
상기 균주는 바이오제닉 아민 중 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)중 어느 하나 이상의 분해능이 있는 것이 특징이다.
상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase)중 어느 하나 이상인 것이 특징이다.
상기 균주는 독소 유전자를 함유하고 있지 않는 것이 특징이다.
상기 독소 유전자는 Non-hemolytic enterotoxin의 유전자인 nheA, nheB, nheC, Hemolytic enterotoxin 유전자인 hblA , hblC 및 Cytotoxin K 유전자인 cytK 중 어느 하나 이상인 것이 특징이다.
또한 본 발명은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC92035P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
또한 본 발명은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC92035P)를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC92035P)를 포함하는 발효 식품을 제공한다.
상기 발효 식품은 메주 또는 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 장류에서 선택된 어느 하나 이상인 것이 특징이다.
상기 발효 식품의 휘발성 암모니아와 아민의 함량은 상기 균주를 포함하지 않는 발효식품의 휘발성 암모니아 및 아민 함량 대비 더 낮게 나타나는 것이 특징이다.
본 발명에서는 전통 장류에서 분리한 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주가 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 효소활성 및 혈전 분해능이 우수하며 청국장 제조시 휘발성 암모니아, 아민의 생산이 적은 것을 확인하였다. 이에, 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 는 안전한 균주이므로 전통 장류 제조시 종균과 함께 활용하여 기능성 및 이취가 적은 우수한 품질의 제품을 제조할 수 있는 유용한 균주로 사용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 본 발명의 균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10균주의 아밀라아제(Amylase), 셀룰라아제(cellulase), 리파아제(lipase), 프로테아제(protease) 활성결과를 나타낸 도면이다.
(A) Amylase, (B)Cellulase, (C)Lipase, (D)Protease
도 2는 본 발명의 균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10균주의 혈전용해술(thrombolysis)의 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주의 B. cereus 독소 유전자의 유,무를 나타낸 도면이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명하며, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 상세한 설명은 생략한다.
본 발명은 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 효소활성 및 혈전분해능이 우수하며, 청국장 발효시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적은 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC 92035P)를 제공한다.
상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC 92035P)는 전통 장류에서 분리하였으며, 독소 유전자가 없고, 바이오제닉 아민 분해능과 혈전 분해 활성 및 효소 활성이 있는 균주이다. 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주를 국립농업과학원에 2015년 02월 11일자로 기탁하였다.(기탁번호:KACC 92035P)
본 발명의 일 실시예에 따른 균주에서 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 또는 티라민(tyramine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 미생물의 아미노산 디카복실라제 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며, 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 균주에서 상기 효소는 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 균주에서 상기 독소 유전자는 장류에서 발생하는 유해 미생물인 바실러스 세레우스에서 생산하는 독소 유전자로 nheA, nheB, nheC, hblA, hblC, cytK, plcRpapR 일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법을 제공한다. 상기 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주를 배양하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주를 포함하는 발효 식품을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 식품은 발효 식품 일 수 있으며, 상기 발효 식품은 메주 또는 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에 따른 식품에서, 상기 장류는 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
<실시예 1> 본 발명의 바실러스 리케니포미스( Bacillus licheniformis) KJ-10 (KACC 92035P)균주의 분리 및 동정, 선발
전통발효방식으로 유명한 청국장 판매업체의 생 청국장을 수집한 후, 생 청국장에 0.85% 살린 버퍼(saline buffer)에 단계희석한 다음, R2A agar과 Raka-Ray agar에 도말하여 분리한 다양한 균주들을 R2A agar 평판배지에서 28℃에서 1~2일간 배양하였다.
순수 분리된 균주들에 대하여 효소활성(amylase, cellulase, protease, lipase)실험과 효소 분해능, 독성유전자 유무, 바이오제닉 아민 분해능, 청국장 발효시 휘발성 암모니아와 아민의 생성 실험을 통하여, KJ-10 균주를 선발하였다.
본 발명의 KJ-10균주를 분류하기 위하여 다음과 같이 PCR을 이용하여 16S rRNA를 증폭하여 염기서열 ;(서열번호 1)을 결정하였다.
분리한 균주를 분류하기 위하여 다음과 같이 PCR을 이용하여 16S rRNA를 증폭하여 염기서열을 결정하였다. 16S rRNA 염기서열을 증폭하기 위하여 genomic DNA를 추출(DNA purification kit, Promega, USA)하여 Geno Tech Corp.(Genotech, Deajeon, Korea)사 에 의뢰하여 일반 세균용 프라이머(Universal PCR primer) 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3';서열번호 2) 와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT -3';서열번호 3)을 이용하여 염기서열을 분석하였다. 상기 실험을 통하여 얻은 16S rRNA seqeunce를 이용하여 Chunlab, Inc.에서 제공하는 Ezbiocloud(http://www.ezbiocloud.net/eztaxon)의 Blast Search 프로그램을 이용하여 분리균주와 등록균주의 상동성을 비교하였다. 또한 분리균주의 계통분류학적 위치를 알아보기 위하여 The National Center for Biotechnology Information(NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)의 Advenced Blast Search프로그램을 통해 GeneBank에 등록된 유사균주의 염기서열을 이용해서 MegAlign 프로그램(DNA STAR Lagergene, version 8)과 Mega 6.0 프로그램의 근연접합법 (neighbor-joining method)을 사용하여 분석하였다.
KJ-10 균주의 16S rRNA 시퀀스의 상동성을 비교한 결과 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)에 유사성을 보였다. 본 발명의 균주를 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10로 명명하고 국립농업과학원(농업유전자원센터;KACC)에 2015년 02월 11일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 92035P를 부여받았다.
<실시예 2> 효소활성(enzyme activity) 분석
본 발명의 바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주의 효소활성을 알아보기 위하여 선발배지에서 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase)의 효소 활성과 혈전 분해능을 확인 하였다.
- 아밀라아제 활성
R2A(Difco)에 아밀라아제(amylase) 생성 유도물질인 0.5% 가용성 전분(soluble starch)을 첨가한 평판배지를 제조하였다. 평판배지에 균주를 대치배양법으로 두 균주씩 접종한 다음 28℃에서 24시간 동안 배양 후, Gram's iodine 용액 (iodine crystal 1.0g, potassium iodine 0.2g, Distilled water 30ml)으로 배지를 염색 한 다음 starch 분해정도를 저지환(clear zone)을 통해 확인 하였다.
- 셀룰라아제 활성
0.4% CMC(carboxymethyl cellulose)를 첨가한 R2A배지를 제조하여 균을 대치배양법으로 접종시킨 후 28℃에서 24시간 배양 후, 0.1% congo red용액으로 염색하고 1M NaCl로 세척 후 저지환(clear zone)을 확인하였다.
- 프로테아제 활성
2% skim milk 와 3% agar를 멸균 후 섞어 배지를 제조 한 후, 균주를 대치 배양법으로 두 균주씩 접종하여 28℃에서 24시간동안 배양 후 저지환(clear zone)을 확인하였다.
- 리파아제 활성
R2A 아가(agar) 450 ml에 50 ml 혼합물[5 ml TBN(glycerol tributyrate), 1 ml 0.5 M CaCl2 ,2 ml 5 M NaCl, 2.5 g gum arabic(from acacia tree)]을 믹서를 이용하여 섞어 준 후 121℃에 15분간 고압증기멸균기를 이용하여 멸균 후 섞어 고체배지를 만들고 균을 대치배양법으로 접종하여 저지환(clear zone)을 확인하였다.
- 혈전 분해능
Fibrin plate method법을 변형하여 측정하였다. 0.5% 피브리노겐(fibrinogen; 0.067M sodium phosphaste buffer포함)을 만든 후 37℃에서 30분간 완전히 녹인 후 트롬빈(thrombin)을 1%로 첨가하여 분주하였다. 굳은 배지에 균주를 접종하여 8시간 후 배지의 피브린(fibrin)의 용해성을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10균주의 아밀라아제(Amylase)(도 1(A)), 셀룰라아제(cellulase)(도 1(B)), 리파아제(lipase)(도 1(C)), 프로테아제(protease)(도 1(D)) 활성결과를 나타낸 사진이다. 도 2는 Fibrin plate method법에 의한 본 발명의 균주인 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10균주의 혈전용해술(thrombolysis)의 결과를 나타낸 사진이다.
상기의 실험 결과, 도 1과 표 1에서 보는 바와 같이 본 발명의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10균주는 발효 관련효소인 아밀라아제, 셀룰라아제, 프로테아제, 리파아제 모두에서 높은 활성을 보였고, 대조 균주인 바실러스 서브틸리스 KACC16479와 바실러스 서브틸리스 A에 비해 높은 혈전 분해능을 보였다.
KJ-10의 효소 활성

Strain
Blast 		Enzyme activity
Amy. Cell. Pro. Lip. Fibrin.
KJ-10 B. licheniformis + + + + +
KACC16749 B. subtilis subsp. subtilis + + + + -
A B. subtilis subsp. subtilis + + + + (+)
Symbols : -; negative activity, (+); weak activity, +; positive activity, Amy.; amylase, Cell; cellulase, Pro.; protease, Lip.; lipase. KACC 16749, A : 대조 균주
<실시예 2> 바실러스 세레우스 ( B.cereus )독소 유전자 유무 확인
본 발명의 바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주의 안전성을 확보하기 위하여 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 의 설사독소 유전자 6개와 설사독소발현 전사조절 유전자 1개, 총 7개의 유전자의 유무를 PCR을 이용하여 확인하였다. 대조균주는 KACC에서 분양 받은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 표준균주(KACC 11204)를 이용하였다.
본 실험에 사용한 바실러스 세레우스 (Bacillus cereus)의 독소유전자는 하기 표 2에 언급되어 있듯이, Non-hemolytic enterotoxin의 유전자 3종(nheA; nheB; nheC), Hemolytic enterotoxin 유전자 2종(hblA; hblC), Cytotoxin K 유전자(cytK), 설사독소발현 전사조절 단백질인 phospholipase C regulatory protein 의 유전자(plcRpapR)이며, PCR의 조건은 94℃에서 2분간 초기변성 후, 94℃ 1분간 변성, 56℃,58℃,62℃(프라이머 별로 상이, 표 2 참고) 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭과정을 30회 반복 하고 마지막으로 72℃에서 5분간 증폭을 실시하였다.
바실러스 세레우스 독성유전자 sequence 및 결합온도.
Primer pair Sequence Target sequence
(GeneBank accession no.)		 Size
(bp)		 Annealing temp.
nheAF ATATGCGCAAAATGTAATTGCTCCA
(서열번호 4)		 Non-hemolytic enterotoxin,
nheA(AY835995) 		935
 56℃
nheAR TGCCTTCTTCAACATTTGTTTGAATTT
(서열번호 5)
nheBF GACCAGCAGGATTCCCAGATGTAAT
(서열번호 6)		 Non-hemolytic enterotoin,
nheB(AY835995) 		972
 62℃
nheBR CCACGCCTTCATGTAATTTTTCTGT
(서열번호 7)
nheCF ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA
(서열번호 8)		 Non-hemolytic enterotoxin,
nheC(AY835995)
930
 62℃
nheCR TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC
(서열번호 9)
hblAF ACCAGTAGCGACTTTTGCAAGTGAA
(서열번호 10)		 Hemolytic enterotoxin,
hblA(AY822584)
909
 56℃
hblAF TTTTGAGCTGCATTCTCAATATGCC
(서열번호 11)
hblCF ATCAATACTCTCGCAACACCAACTG
(서열번호 12)		 Hemolytic enterotoxin,
hblC(AY822584)
957
 62℃
hblCR ATGTGCTCGTTGCTCTGCTGTTAAT
(서열번호 13)
cytKF CCGCTGTTTTTGCTAGTAGTGCTGT
(서열번호 14)		 Cytotoxin K,
cytK (DQ019311)

 901
 58℃
cytKR ACGTCTTTTACGTTGTTTCCAACCC
(서열번호 15)
plcRF CRGGYGCRGTATACCCAAGT
(서열번호 16)		 Phospholipase C regulatory protein, (plcRpapR(58) 888
 58℃
plcRR TGAAATACCCCATGYCATYG
(서열번호 17)
바실러스 리케니포미스 KJ-10은 바실러스 세레우스 와 계통학적으로 가까울 뿐 만 아니라 균주를 접종하는 방법이 아닌 전통발효방법으로 제조한 청국장에서 분리된 균주이므로, 바실러스 세레우스 독소유전자의 유무를 확인함으로서 실험균주의 안전성을 확보하고자 하였다. 실험결과 도 3에서 보는 바와 같이, 바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주는 바실러스 세레우스의 설사독소 유전자 6개와 설사독소발현 전사조절 유전자 1개의 유전자를 가지고 있지 않았다.
<실시예 3> 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해능 정량분석
본 발명의 바실러스 리케니포미스 KJ-10의 바이오제닉 아민 분해능을 검정하기 위하여 히스타민(histamine)과 티라민(tyramine) 분해능을 HPLC로 정량분석 하였다.
1% 히스타민(histamine)과 티라민(tyramine)이 포함된 nutrient Broth에 균주를 접종한 다음 38℃에서 20일간 배양하였다. 배양 후, 1300rpm에서 5분동안 원심분리(centrifugation) 하였다. 상층액 200㎕에 내부표준용액 2M Diaminooctane을 2㎕ 첨가하였다.
300㎕ Na2CO3 solution(100mg/ml in water)와 800㎕ dansyl chloride solution (7.5mg/ml in acetone)을 첨가해준 후 60℃에서 20분 동안 단실화 반응(dansylation)처리 하였다.
100㎕ proline solution(50mg/ml in water)을 첨가한 후 60℃에서 10분간 둔 후 5℃에서 냉각(cooling)하였다. 마지막으로 100㎕ 톨루엔(toluene)을 첨가하여 혼합(shaking)한 후, 5분간 원심분리(centrifugation) 한 다음 상층액을 이용하여 HPLC분석을 수행하였다.
상기 실험을 위한 HPLC의 분석 조건은 다음과 같다.
Alliance e2695 HPLC system (Waters Co., Milford, MA, USA)과 474 fluorescence detector (Waters Co., Milford, MA, USA)를 사용하여 amine을 추출하였다.
C18 (Waters, X Bridge™ C18, 4.6 X 250 ㎜ 3.5㎛)칼럼을 이용하여 유속은 1ml/min , 이동상의 농도경사는 아래의 표 3과 같다.
본 발명에서 사용한 HPLC 이동상의 농도경사
min A(Water)% B(Acetontrile)%
0 60 40
5 60 40
35 15 85
40 15 85
54 0 100
55 60 40
60 60 40
KJ-10의 20일 후의 1%의 히스타민, 티라민의 분해능을 확인한 결과 표 4에 나타낸 바와 같이 77.5%의 히스타민 분해능과 23.8%의 티라민 분해능을 보였다.
KJ-10의 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해능

Strain
Blast 		Histamine Tyramine
before after 20days before after 20days
KJ-10 B. licheniformis 54402959 12235980 68760490 52370219
< 실시예 4> 휘발성 아민 및 암모니아 측정
바실러스 리케니포미스 KJ-10을 이용하여 발효한 청국장의 휘발성 암모니아와 아민을 측정하기 위하여, 먼저 바실러스 리케니포미스 KJ-10을 이용하여 발효한 청국장을 제조하였다. 바실러스 리케니포미스 KACC16749 와 바실러스 리케니포미스 A를 대조균주로 이용하였다. 수세한 국내산 대두에 1.5배의 물을 넣고 121℃에서 20분 동안 증자시켰다. 품온 40℃를 유지시킨 10 g의 삶은 콩에 250 ㎕ 각각의 균주 배양액(1x109CFU/ml)을 혼합하여 40℃에서 72시간 배양 하여 각 균주를 이용한 청국장을 제조하였다. 청국장을 실리콘 용기에 옮긴 후, 1분간 진탕, 5분 대기 후, 검지관식 기체 측정기(GASTEC, GV-100S, Japan)를 이용하여 실리콘 용기 내부 기체 50 ml 중 암모니아와 아민의 함량을 측정 하였다. 이때, 암모니아 검지관(Ammonia; NH3, No.3L,Japan)과 아민 검지관(Amines(Methylamine);RㅇNH2 No.180, Japan)을 이용하였다.
상기 측정 결과 표 5에 나타낸 바와 같이 50 ml의 기체 중 바실러스 리케니포미스 KJ-10은 21 ppm 암모니아 와 13 ppm 아민이 확인되었으며 이는 시판 청국장에서 분리한 균주보다 낮은 수치임이 확인되었다.

Strain
Blast 		ppm/50 ml
Ammonia Amines
KJ-10 B. licheniformis 21 13
KACC16749 B. subtilis subsp. subtilis 6.5 13
A B. subtilis subsp. subtilis >35 >120
Symbols : >; excess
이상, 상기 결과를 토대로 본 발명은 혈전분해능 및 효소활성이 우수하며, 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 청국장 제조 시 휘발성 암모니아와 아민 생성이 적은 바실러스 리케니포미스 KJ-10 균주 및 이를 포함하는 발효 식품을 제공할 수 있게 된다.
한국농업미생물자원센터 KACC92035P 20150311
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Bacillus licheniformis strain KJ-10 and uses thereof <130> P2015-0041 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1451 <212> RNA <213> Bacillus licheniformis KJ-10 <400> 1 gcagtcgagc ggaccgacgg gtagcttgct cccttaggtc agcggcggac gggtgagtaa 60 cacgtgggta acctgcctgt aagactggga taactccggg aaaccggggc taataccgga 120 tgcttgattg aaccgcatgg ttcaatcata aaaggtggct tttagctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaaactctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420 gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660 tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggcgcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttagag ggtttccgcc ctttagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960 ccctagagat agggcttccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080 ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atgggcagaa 1200 caaagggcag cgaagccgcg aggctaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260 gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380 cccgaagtcg gtgaggtaac cttttggagc cagccgccga aggtgggaca gatgattggg 1440 gtgaagtcgt a 1451

Claims (11)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하며 혈전 분해능과 아밀라아제(amylase), 셀룰라아제(cellulase), 프로테아제(protease), 리파아제(lipase) 중 어느 하나 이상의 효소활성이 있고,
    바이오제닉 아민 중 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)중 어느 하나 이상의 분해능이 있으며,
    Non-hemolytic enterotoxin의 유전자인 nheA, nheB, nheC, Hemolytic enterotoxin 유전자인 hblA, hblC 및 Cytotoxin K 유전자인 cytK 중 어느 하나 이상의 독소 유전자를 함유하고 있지 않는
    기탁번호 KACC92035P로 기탁된 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC92035P) 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 미생물 제제.
  8. 제 1항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC92035P)를 배양하는 단계를 포함하는 미생물 제제의 제조방법.
  9. 제 1항의 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) KJ-10 균주(KACC92035P)를 포함하는 발효 식품.
  10. 제 9항에 있어서,
    상기 발효 식품은 메주 또는 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 장류에서 선택된 어느 하나 이상인 발효 식품.
  11. 제 9항에 있어서,
    상기 발효 식품의 휘발성 암모니아와 아민의 함량은 상기 균주를 포함하지 않는 발효 식품의 휘발성 암모니아 및 아민 함량 대비 더 낮게 나타나는 발효 식품.
KR1020150081016A 2015-06-09 2015-06-09 바실러스 리케니포미스 kj-10 균주 및 이의 용도 KR101740532B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150081016A KR101740532B1 (ko) 2015-06-09 2015-06-09 바실러스 리케니포미스 kj-10 균주 및 이의 용도

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150081016A KR101740532B1 (ko) 2015-06-09 2015-06-09 바실러스 리케니포미스 kj-10 균주 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160144630A KR20160144630A (ko) 2016-12-19
KR101740532B1 true KR101740532B1 (ko) 2017-05-29

Family

ID=57735510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150081016A KR101740532B1 (ko) 2015-06-09 2015-06-09 바실러스 리케니포미스 kj-10 균주 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101740532B1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102277579B1 (ko) * 2019-12-18 2021-07-15 전라남도 신규한 바실러스 리체니포미스 균주 및 이의 용도
CN111718871B (zh) * 2020-06-17 2022-04-15 江南大学 一株产酸性蛋白酶的地衣芽孢杆菌
KR102530797B1 (ko) * 2021-02-08 2023-05-10 함양군 기능성 청국장 제조용 바실러스 리체니포미스 idck30와 바실러스 서브틸리스 idck40의 복합종균 조성물 및 이를 이용한 산양삼 청국장 제조방법
CN116656565B (zh) * 2023-06-16 2023-11-28 天典(广东)生物科技有限公司 一种地衣芽孢杆菌及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
J. Food Sci., Vol.79, pp.M2279-M2287(Epub.2014.10.30.)
Korean Journal of Microbiology, Vol.48, pp.298-304(2012.)
국립농업과학원, 국가RnD연구보고서, 별미장의 상품성 향상기술 연구 (2012.)

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160144630A (ko) 2016-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101516588B1 (ko) 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도
Jeon et al. Screening and characterization of potential Bacillus starter cultures for fermenting low-salt soybean paste (doenjang)
KR101898260B1 (ko) 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스 균주 및 이의 용도
KR101734367B1 (ko) 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 락토바실러스 브레비스 SCML67 균주 및 이의 용도
Gao et al. Garviecin LG34, a novel bacteriocin produced by Lactococcus garvieae isolated from traditional Chinese fermented cucumber
Valledor et al. Characterization and safety evaluation of two beneficial, enterocin-producing Enterococcus faecium strains isolated from kimchi, a Korean fermented cabbage
KR101734361B1 (ko) 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성 및 세포외 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 바실러스 서틸리스 scm146 균주 및 이의 용도
Khamna et al. L-asparaginase production by actinomycetes isolated from some Thai medicinal plant rhizosphere soils
KR101734368B1 (ko) 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항생제 내성, 항산화 활성, β-글루코시다제 및 세포외 효소 분비능이 우수하고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 락토바실러스 브레비스 SCML458 균주 및 이의 용도
KR101740532B1 (ko) 바실러스 리케니포미스 kj-10 균주 및 이의 용도
KR101374586B1 (ko) 감마 글루타밀트랜스펩티데이스 및 피브린 분해효소의 활성이 높은 바실러스 아밀로리큐파시엔스 ｋｃ41 및 이를 이용하여 제조한 청국장
KR101736324B1 (ko) 장류의 유해 미생물에 대한 항균 활성, 항산화 활성 및 세포외 효소 분비능이 있고, 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 전통장류 유래의 바실러스 서틸리스 scm121 균주 및 이의 용도
KR20160141267A (ko) 항균 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefacience) 균주 및 이의 용도
KR101498272B1 (ko) 김치에서 분리되고 항균물질생성 및 면역활성 효능을 가진 바실러스 서브틸리스 균주 및 이를 이용한 생균제 조성물
KR102000475B1 (ko) 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 생성 저해 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ny12-2 균주 및 이를 포함한 조성물
KR101680640B1 (ko) 청국장에서 분리한 바이오제닉 아민 분해능을 가지면서 혈전용해 및 효소 활성이 있는 바실러스 서브틸리스 2rl2-1 균주 및 이의 용도
KR101740545B1 (ko) 바실러스 서브틸리스 yd-6 균주 및 이의 용도
Gaaloul et al. Evaluation of Antimicrobial Activity and Safety Aspect of E nterococcus Italicus GGN 10 Strain Isolated from T unisian Bovine Raw Milk
KR101867952B1 (ko) 바실러스 세레우스에 대한 항균활성 및 바이오제닉 아민 저감화 효과가 우수한 저영양성 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 hj5-2 및 이를 포함한 조성물
Pongsetkul et al. Bacillus subtilis K‐C3 isolated from Thai salted shrimp paste (Kapi): Its extracellular enzymes and use as a starter culture in Kapi production
KR101730063B1 (ko) 바실러스 메틸로트로피쿠스 mh-2 균주 및 이의 용도
Mo et al. Isolation and characterization of Bacillus polyfermenticus isolated from Meju, Korean soybean fermentation starter
KR101740540B1 (ko) 바실러스 서브틸리스 jp-5 균주 및 이의 용도
Tenea et al. Microbiota of wild fruits from the amazon region of Ecuador: Linking diversity and functional potential of lactic acid bacteria with their origin
KR101740543B1 (ko) 바실러스 서브틸리스 kj-21 균주 및 이의 용도

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant