KR102242535B1 - 저염맛내기 된장 제조용 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm104466 균주 및 아스퍼질러스 오리재 srcm102487 균주의 특성 - Google Patents

저염맛내기 된장 제조용 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm104466 균주 및 아스퍼질러스 오리재 srcm102487 균주의 특성 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아밀라아제, 프로테아제, β-글루코시다아제 및 셀룰라아제의 효소 분비능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 항산화 활성, 유해미생물에 대한 항균활성이 있고, 유해물질, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P), 상기 균주 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주를 유효성분으로 함유하는 된장 제조용 미생물 제제, 상기 2종의 균주를 이용한 된장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 된장에 관한 것이다.

Description

저염맛내기 된장 제조용 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM104466 균주 및 아스퍼질러스 오리재 SRCM102487 균주의 특성{Properties of Bacillus amyloliquefaciens SRCM104466 and Aspergillus oryzae SRCM102487 for producing low-salted flavouring soybean paste}
본 발명은 아밀라아제, 프로테아제, β-글루코시다아제 및 셀룰라아제의 효소 분비능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 항산화 활성, 유해미생물에 대한 항균활성이 있고, 유해물질, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P), 상기 균주 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주를 유효성분으로 함유하는 된장 제조용 미생물 제제, 상기 2종의 균주를 이용한 된장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 된장에 관한 것이다.
된장은 콩을 주원료로 하는 우리 고유의 발효식품이고, 소금에서 오는 짠맛, 단백질 가수분해산물인 아미노산에서 오는 구수한 맛, 발효에 의한 향 등이 조화를 이루어 독특한 향미와 색이 생성된 전통식품이다. 또한 미생물 효소에 의해 원료의 단백질과 탄수화물을 분해하여 이용하는 식품으로 단백질과 아미노산 함량이 높아 영양학적으로 중요시되는 우리나라의 대표적인 전통발효식품이며, 곡류위주의 식생활에서 부족되기 쉬운 필수 아미노산 및 지방산, 유기산, 미네랄, 비타민류 등의 영양소를 보충해 주는 중요한 기능을 가진 식품이다.
또한, 최근에 된장의 항암효과, 항돌연변이 효과, 면역기능 강화 효과, 항고혈압 효과, 혈전용해 효과, 콜레스테롤 저하 효과, 항산화 효과 등 다양한 기능성이 밝혀져 새롭게 관심을 끌고 있는 식품이다. 그러나 된장은 발효 숙성 시 부패를 방지하고 상온에서 장기간의 저장과 유통을 위하여 10~14%의 소금이 첨가되며, 전통 한식 된장의 경우는 식염이 20%까지 첨가되기도 한다.
우리나라 음식별 나트륨 함량을 살펴보면 된장찌개가 20위권 안에 선정되어 있으며, 모든 음식들의 조미료로 쓰이는 장류를 사용한 음식들이 나트륨 함량이 높다는 것을 알 수 있다. 하루 성인 나트륨 권장규격 2,000 mg을 훨씬 넘는 수치이다.
저염 된장을 제조하기 위한 방법으로는 국내에서는 에탄올 첨가, 감마선 조사 및 니신(nisin) 생성 유산균을 이용하는 시도가 있었다. 완성된 저염 된장의 만족할만한 풍미와 품질을 전제로 하고 있어서 미생물의 역할이나 우량 균주의 역할이 중요하다.
한국공개특허 제2016-0066517호에는 혼합 균주를 이용한 저염 된장의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1455473호에는 전통 메주에서 분리한 아스퍼질러스 오리재 CJKY 균주를 이용한 된장이 개시되어 있으나, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM104466 균주 및 아스퍼질러스 오리재 SRCM102487 균주를 이용한 된장의 제조방법과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 저염으로 제조된 맛내기 된장 제조에 적합한 균주를 선정하고, 상기 선정된 균주를 이용하여 영양성분이 강화되고 기호도가 우수한 저염 된장의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 아밀라아제, 프로테아제, β-글루코시다아제 및 셀룰라아제의 효소 분비능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 항산화 활성, 유해미생물에 대한 항균활성이 있고, 유해물질, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P)를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 대두 발효용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주(KCCM12804P)를 유효성분으로 함유하는 된장 제조용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) 대두에 물을 첨가하여 침지하고 물을 뺀 후 증자하고, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주를 접종한 후 발효한 발효물에 소금을 첨가하고 숙성시켜 대두 고초균 발효물을 제조하는 단계; (2) 쌀에 물을 첨가하여 침지하고 물을 뺀 후 증자하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주를 접종한 후 발효한 발효물에 소금 및 물을 첨가하고 숙성시켜 쌀 황국균 발효물을 제조하는 단계; 및 (3) 상기 (1)단계의 제조한 대두 고초균 발효물 및 상기 (2)단계의 제조한 쌀 황국균 발효물을 혼합한 혼합물을 숙성시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 된장의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 된장을 제공한다.
본 발명에서는 전통발효식품에서 분리한 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P)가 아밀라아제, 프로테아제, β-글루코시다아제 및 셀룰라아제의 효소 분비능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 항산화 활성, 유해미생물에 대한 항균활성이 있고, 유해물질, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않음을 확인하였다. 본 발명에서는 상기 균주와 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주를 이용하여 된장을 제조할 경우 고품질의 된장을 제조할 수 있어, 전통식품산업에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 본 발명의 아스퍼질러스 오리재 SRCM102487 균주의 계통수(phylogenetic tree)이다.
도 2는 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴페시언스 SRCM104466 균주의 계통수(phylogenetic tree)이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 아밀라아제, 프로테아제, β-글루코시다아제 및 셀룰라아제의 효소 분비능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성, 항산화 활성, 유해미생물에 대한 항균활성이 있고, 유해물질, 유해효소 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P)를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 유해미생물은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)이며, 상기 유해물질은 페닐알라닌(phenylalanine)이며, 상기 유해효소는 우레아제(urease) 및 β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase)이며, 상기 바이오제닉 아민은 티라민 및 히스타민일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 대두 발효용 미생물 제제를 제공한다.
본 발명에 따른 대두 발효용 미생물 제제는 용액, 분말, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 유성 분산액, 페이스트, 분진, 흩뿌림 물질 또는 과립제로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주(KCCM12804P)를 유효성분으로 함유하는 된장 제조용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
상기 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주는, 전분 및 단백질분해효소 활성이 뛰어나, 된장 발효과정에서 중요한 효소인 프로테아제 및 아밀라아제의 생산 능력이 높고, 발암물질인 아플라톡신을 생산하지 않는 균주로, 한국미생물보존센터에 2020년 10월 15일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM12804P).
본 발명은 또한,
(1) 대두에 물을 첨가하여 침지하고 물을 뺀 후 증자하고, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주를 접종한 후 발효한 발효물에 소금을 첨가하고 숙성시켜 대두 고초균 발효물을 제조하는 단계;
(2) 쌀에 물을 첨가하여 침지하고 물을 뺀 후 증자하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주를 접종한 후 발효한 발효물에 소금 및 물을 첨가하고 숙성시켜 쌀 황국균 발효물을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 (1)단계의 제조한 대두 고초균 발효물 및 상기 (2)단계의 제조한 쌀 황국균 발효물을 혼합한 혼합물을 숙성시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 된장의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 된장의 제조방법은, 보다 구체적으로는
(1) 대두에 물을 첨가하여 8~16시간 동안 침지하고 물을 뺀 후 100~150℃에서 10~50분 동안 증자하고, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주를 접종하여 35~45℃에서 1~5일 동안 발효한 발효물에 소금을 첨가하고 35~45℃에서 10~18일 동안 숙성시켜 대두 고초균 발효물을 제조하는 단계;
(2) 쌀에 물을 첨가하여 1~5시간 동안 침지하고 물을 뺀 후 100~150℃에서 10~30분 동안 증자하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주를 접종하고 25~35℃에서 1~5일 동안 발효한 발효물에 소금 및 물을 첨가하고 25~35℃에서 3~10일 동안 숙성시켜 쌀 황국균 발효물을 제조하는 단계; 및
(3) 상기 (1)단계의 제조한 대두 고초균 발효물 및 상기 (2)단계의 제조한 쌀 황국균 발효물을 0.8~1.2:0.8~1.2 중량비율로 혼합한 혼합물을 25~35℃에서 3~21일 동안 숙성시키는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 된장의 제조방법에서, 상기 (1) 및 (2)단계에 의해 제조된 대두 고초균 발효물 및 쌀 황국균 발효물은 글루탐산, 아미노태 질소 및 유리아미노산 함량이 높고, 감칠맛 및 구수한 맛을 내는 핵산관련물질 함량이 높고 향미가 우수하여 된장 제조에 적합한 발효물로 제조할 수 있었다.
또한, 본 발명의 된장의 제조방법에서, 상기 (3)단계와 같이 대두 고초균 발효물 및 쌀 황국균 발효물을 적정량 배합한 후 숙성시켜 제조한 된장은 감칠맛을 내는 글루탐산 및 아스파르트산과 감미를 내는 글리신, 알라닌 및 리신과 같은 유리아미노산 함량이 높고, 감칠맛을 내는 이노신 및 하이포크산틴 등과 같은 핵산관련물질 함량이 높으면서, 감칠맛과 구수한맛에 영향을 주는 다양한 향미 성분 함량이 높아 고품질의 된장으로 제조할 수 있었다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 된장을 제공한다.
이하, 본 발명의 제조예 및 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 2종의 균주를 이용한 저염 맛내기 된장
(1) 대두에 물을 첨가하여 12시간 동안 침지하고 물을 뺀 후 121℃에서 30분 동안 증자하고, 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주를 대두 무게의 0.05~0.1%(v/w) 비율로 접종하여 40℃에서 3일 동안 발효하였다. 상기 발효한 발효물에 소금을 첨가하여 염 농도를 11%로 맞춘 후 40℃에서 14일 동안 숙성하여 대두 발효물을 제조하였다.
(2) 쌀에 물을 첨가하여 2시간 동안 침지하고 물을 뺀 후 121℃에서 15분 동안 증자하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주를 쌀 무게의 0.1%(v/w) 비율로 접종하고 30℃ 온도 및 80% 습도에서 2일 동안 발효하여 쌀 코지를 제조하였다. 상기 제조한 쌀 코지에 소금 및 물을 첨가하여 염 농도를 5%로 맞춘 후 30℃에서 6일 동안 숙성시켜 쌀 발효물을 제조하였다.
(3) 상기 (1)단계의 제조한 대두 발효물 및 상기 (2)단계의 제조한 쌀 발효물을 1:1 중량비율로 혼합한 후 30℃에서 7~14일 동안 숙성시켰다.
1. 저염 맛내기 된장 기반용 신규균주 선정
(1) 사용 미생물
발효미생물산업진흥원에서 전통발효식품으로부터 분리하여 보관중인 황국균, 고초균을 이용하였다. 각 균주별 100종에서 황국균과 고초균은 효소활성 및 안전성 특성에 준하여 각 10종을 선별하여 대두발효용 균주로 이용하였다.
(2) 사용 원료
실험에 사용하는 대두와 쌀은 국산으로 순창에서 구입하여 사용하였고, 소금은 정제염을 이용하였다.
(3) 발효물 및 된장 제조
(가) 쌀 발효 적용/황국균
10종 선발된 황국균을 쌀 발효에 적용하기 위해 배양하였다. 쌀을 수세하여 동량의 물로 2시간 침지한 후 물을 거르고, 121℃에서 증자하여 방냉한 후 균주를 쌀 무게의 0.1%의 비율로 접종하여 30℃, 80% 습도에서 1-3일간 발효하였다.
(나) 대두발효 적용
고초균과 황국균은 각 10종 선별된 균주를 각 고체배지(고초균: TSA(Tryptic Soy Agar) Oxoid, 황국균: YM(Yeast Mold) agar. Oxoid)에 접종하여 준비하였다. 배양된 각 균주를 액체배지에 접종하여 대두 발효 적용 균주로 이용하였다. 대두 발효 조건은 기존 순창장류의 방법에 준하여 발효하였다. 각 균주의 농도는 고초균은 O.D 600nm 값 0.6으로 하여 접종하였으며, 곰팡이는 O.D 600nm 값 0.4로 하여 접종하였다. 대두는 동량의 증류수(v/w)에 12시간 침지하여 물을 뺀 후 121℃에서 30분간 증자한 후 50℃까지 식힌 후 사용하였다. 콩 무게의 0.05~0.1%의 비율로 균주를 접종하고 고초균은 40℃, 80%습도에서 1-5일간 발효하고 황국균은 30℃, 80% 습도에서 1-3일간 발효하였다. 각 대두 발효 중 효소활성, 감칠맛 등을 평가하여 균주 3종을 선발하였다.
(다) 발효물 제조
선별된 균주를 이용하여 쌀 발효물 및 대두 발효물을 제조하여 된장제조에 이용하고자 하였다. 황국균은 쌀에 적용하고, 고초균은 대두에 적용하여 평가하였다. 각 발효물 제조방법은 순창장류 기존의 일반적인 방법에 준하여 제조하였다. 쌀 발효물은 쌀을 동량의 증류수에 2시간 침지한 후 물을 거르고 121℃에 15분 증자하여 방냉한 후 균주를 접종하고 발효한 후 최종 염농도를 5%로 하여 소금과 물을 배합하고 마쇄하여 1-6일간 숙성한 후 특성을 평가하였다. 대두 발효물은 대두 및 균주를 처리하여 발효한 후 최종 염농도가 11%가 되게 염을 첨가하고 배합한 후 21일간 40℃에서 숙성한 후 특성을 평가하였다. 이 중 최종 균주를 선발하였다.
2. 실험방법
(1) 미생물학적 특성 분석
(가) 분리균주 보관 및 활성화
고초균은 TSB를 곰팡이 및 효모는 YM배지에 접종하여 글리세롤(glycerol)에 스톡(stock)하여 제조하였으며, -70℃ 냉동고에서 보관하였다. 사용전 각 균주는 최적 배지에서 2차 이상 계대배양하여 충분히 활성화하여 사용하였다.
(나) 미생물 특성 분석
선별된 미생물의 특성의 발효미생물산업진흥원의 각 균주별 특성분석방법에 준하여 분석하였다.
(다) 미생물 동정
선발된 균주 3종을 Macrogen(Seoul, Korea)에 16S rRNA sequence, 18S rRNA sequence 분석을 의뢰하였다. 염기서열의 크로마토그램(chromatogram)을 이용하여 gap을 최소화한 후 NCBI에서 서열 일치도가 높은 표준 균주들의 16S rRNA, 18S rRNA유전자 염기서열을 확보하여 계통도를 작성하였다. 계통도 분석은 Tamura-Nei 모델에 기초한 Maximum Likelihood 방법을 사용하여 분석하였고, 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 bootstrap 분석을 1,000회 실행하였으며, 분석은 MEGA 7.0.26 program을 사용하였다.
(2) 이화학적 특성 분석
(가) 수분
수분함량은 적외선수분기(Kett)를 이용하여 측정하였다.
(나) 염도
염도는 시료 10 g을 취해 증류수 90 mL를 가하여 충분히 혼합한 후 디지털 염도계(TM-30D, Takemura Electric works Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 측정한 값에 희석배수를 곱하여 나타내었다.
(다) pH 및 산도
시료 1~5 g을 적정기(Mettler Toledo CH/MPC227, Switzerland)를 사용하여 증류수로 시료를 최대 10배 희석하여 3회 반복 측정한 후 평균값을 구하였다.
(라) 아미노산성 질소 함량
아미노산성 질소 함량은 시료 1 g을 비커에 취하고 증류수 50 mL를 가하고 240초 동안 진탕 혼합하여 충분히 용해한 다음 0.1N NaOH 용액으로 적정하여 pH 8.4로 하였다. 여기에 중성 포르말린(formalin) 20 mL를 가하고 20초 동안 진탕 혼합한 뒤 다시 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.4가 되도록 중화·적정하였다.
아미노산성 질소(mg%)=0.1N NaOH 적정량×1.401×F×희석배수×100/시료량(g)
(마) 유리당, 유기산 함량
유리당과 유기산의 분석은 시료 5 g에 증류수 45 mL를 가하여 1시간 동안 균질화시킨 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터에 통과시킨 후 표 1의 분석조건으로 HPLC로 분석하였다.
유리당, 유리산 분석을 위한 HPLC 조건
항목 조건
Instument Agilent
Detector RID, DAD 210 nm
Column Aminex column HPX-87P(300×7.8 mm)
Temperature 50℃
Injection volume 20 ㎕
Flow rate 0.6 mL/min
Mobile phase 0.005N H2SO4
(바) 유리아미노산
유리아미노산 분석을 위하여 시료 2 g을 취하여 3차 증류수 30 mL를 넣고 교반한 후 50 mL로 정용하였다. 이후 초음파를 이용하여 20분간 추출한 후 원심분리(3000 rpm, 10분)한 다음 상등액 2 mL에 5% TCA 2 mL를 넣은 후 원심분리(10,000 rpm, 10분)한 후 상등액을 취하여 0.02N-HCl로 희석한 후 0.2 ㎛ 실린지 필터에 통과시킨 후 표 2의 분석조건으로 아미노산 분석기로 분석하였다.
유리아미노산 분석을 위한 아미노산 분석기 조건
항목 조건
Instument Amino acid analysis (Hitachi L-8900)
Detector UV/Vis (440nm-570nm)
Column Hitachi 4.6×60 mm(speration)
Hitachi 4.6×40 mm(Ammonia filtering)
Buffer flow rate 0.40 mL/min
Ninhydrin flow rate 0.35 mL/min
Temperature 50℃
Injection volume 20 ㎕
Mobile phase Buffer set (PH-SET KANTO)
(사) 핵산관련물질
핵산관련물질은 시료 5 g에 20 mL의 0.6M 과염소산(perchloric acid)을 첨가하여 균질한 후 원심분리(3,000 rpm, 10분)하여 얻은 상등액을 여과지(Whatman No. 1)를 이용하여 여과하였다. 여과액에 1M KOH를 첨가하여 pH 5.5로 적정한 다음 0.6M 과염소산(perchloric acid)을 이용하여 50 mL로 정량하였다. 그 다음 원심분리(3,000 rpm, 10 min)하여 얻은 상등액을 0.2 ㎛ 실린지 필터에 통과시킨 후 표 3의 분석조건으로 HPLC로 분석하였다.
뉴클레오티드 분석을 위한 HPLC 조건
항목 조건
Instument Agilent
Detector DAD 254 nm
Column CAPCELL PAK C18 (250 ×4.6 mm, 5 ㎛)
Temperature 30℃
Injection volume 10 ㎕
Flow rate 1 mL/min
Mobile phase 20 mM sodium phosphate buffer (pH 5.5)
(아) ACE 억제 활성
ACE 억제 활성은 50 mM Tris-Cl buffer(pH 8.3, containing 300 mM NaCl) 125 ㎕에 시료와 ACE enzyme(0.1U/mL)를 각각 10 ㎕ 첨가한 다음 37℃에서 10분 동안 예열시킨 후 6 mM HHL(hippuryl-histidyl-leucine) 50 ㎕를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 반응시켰다. 그 다음 1M HCl 75 ㎕ 첨가하여 반응을 정지시킨 후 피리딘(pyridine) 150 ㎕와 벤젠설포닐 클로라이드(benzenesulfonyl chloride) 75 ㎕를 첨가하여 1분 동안 혼합한 후 냉각하여 410 nm에서 흡광도 측정하였고, 아래 식에 따라 활성도를 나타내었다.
ACE 억제 활성(%) = [(B-A)/(B-C)] × 100
A: 시료 첨가 시 흡광도
B: 시료 대신 증류수 첨가 시 흡광도
C: 반응정지 후 시료 첨가 시 흡광도
(3) 관능적 특성 분석
(가) 향기성분 분석
향기성분 분석을 위하여 시료 2 g을 취하여 3차 증류수 10 mL로 희석하여 준비한 후 스터 바(stir bar, PDMS, 0.5 mm film thickness, 10 mm length, 24 ㎕, Gerstel)와 함께 바이알(vial)에 담아 50℃에서 450 rpm으로 2.5시간 동안 교반하여 향기성분을 흡착한 다음 스터 바(stir bar)를 향기성분용 튜브에 넣어 표 4의 분석조건 GC-MS를 이용하여 향기성분을 분석하였다. 휘발성 화합물 동정은 mass spectrum libaray(NIST05A)을 이용하였고, 동정된 휘발성 화합물의 정량적 분석은 내부표준물질은 Methyl cinnamate(200 ppm (w/v) in ethanol)을 이용하여 area로 계산하였다.
휘발성 향기 성분 분석을 위한 GC-MS 조건
항목 조건
Analytical conditions GC Agilent HP 6980
Detector Agilent HP 5973
Column 60-m DB WAX
Carrier gas He, 1.4 mL/min
Transfer line 250℃
Ion source 230℃
Quadrupole 150℃
Mass spectra range 35-400 m/z
EM voltage 70eV
Oven conditions Initial temperature 50℃(1분)
Rate 3 mL/min
Final temperature 210℃
Final time 15분
TDU conditions Initial temperature 50℃
Rate 60℃/분
Final temperature 220℃
Final time 5분
CIS conditions Initial temperature -20℃
Rate 12℃/s
Final temperature 220℃
Final time 2분
실시예 1. 균주 특성 및 선발
발효식품으로부터 분리하여 보관중인 균주 중 황국균, 고초균, 효모의 특성 DB를 바탕으로 GRAS 균주에 한해 각 10종(고초균, 황국균)씩 선발하였다. 황국균과 고초균은 전분 및 단백분해 효소활성을 기준으로 선발하였다. 고초균은 바실러스 서브틸리스(B. subtlis), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(B. amyloliquefaciens), 바실러스 벨레젠시스(B. velezensis) 등 10종으로 효소활성이 2 cm 이상 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 균주로 선발하였다(표 5 및 6).
고초균의 용혈성, 유해대사산물 생성 및 효소활성
No. 균주명
(SRCM)		 동정명 용혈성 유해대사산물 효소활성(cm)
phenyl alanine urease β-D-glucuronidase (TBX) amy
lase		 protease β- glucosidase cellulase lipase
1 B1 B. subtilis α ND ND ND 2.5 2.5 + 2.1 ND
2 B2 B. subtilis α ND ND ND 2.4 2.5 + 1.8 ND
3 B3 B. subtilis α ND ND ND 2.1 2.6 + 1.6 ND
4 B4 B. subtilis α ND ND ND 2.3 2.1 - 2.2 ND
5 B5 B. subtilis γ ND ND ND 2.3 2.2 - 2.1 ND
6 B6 B. velezensis γ ND ND ND 2.4 2.3 + 2.7 ND
7 B7 B. velezensis γ ND ND ND 2.5 2.4 + 2.6 ND
8 B8 B. subtilis β ND ND ND 2.3 2.4 + 2.6 ND
9 104466 B. amyloliquefaciens γ ND ND ND 2.3 2.4 + 2.5 ND
10 B9 B. amyloliquefaciens γ ND ND ND 2.0 2.5 + 2.4 ND
고초균의 바이오제닉 아민, 항균활성, 항혈전 및 항산화 활성
No. 균주명
(SRCM)		 동정명 Biogenic amines 항균활성(cm) 항혈전 항산화활성
ctrl Tyramine Histamine B. cereus KCCM40935 S. aureus KCCM11335 L. monocytogenes KCCM43155 E. faecalis KCCM11814 fibrinolytic activity DPPH antioxidant capacity
1 B1 B. subtilis ND ND ND ND ND ND ND ND 13.67
2 B2 B. subtilis ND ND ND ND ND ND ND 1.5 10.88
3 B3 B. subtilis ND ND ND ND ND ND ND 1.5 7.40
4 B4 B. subtilis ND ND ND 1.2 - 1.6 ND 1.6 11.41
5 B5 B. subtilis ND ND ND - - 1.4 ND 1.6 10.53
6 B6 B. velezensis ND ND ND - 1.1 1.4 ND 1.4 11.26
7 B7 B. velezensis ND ND ND 1.0 - 1.0 ND 1.5 16.05
8 B8 B. subtilis ND ND ND - - 0.9 ND 1.9 9.10
9 104466 B. amyloliquefaciens ND ND ND 1.8 1.1 1.6 ND 2.3 0.69
10 B9 B. amyloliquefaciens ND ND ND 1.7 1.2 1.5 ND 1.5 10.04
황국균은 보관된 균주 중 아플라톡신을 생성하지 않는 균주를 기준으로 선발하였으며, 황국균 역시 효소활성이 높은 균주를 선발하였다(표 7).
아스퍼질러스 오리재 균주의 특성
No. 균주명
(SRCM)		 동정명 효소활성 생성능 Aflatoxine
생성능
protease amylase cellulase lipase
1 A1 A. oryzae ++ + - - ND
2 A2 A. oryzae + - - - ND
3 A3 A. oryzae ++ +++ - + ND
4 A4 A. oryzae ++ + - - ND
5 A5 A. oryzae ++ ++ - + ND
6 A6 A. oryzae ++ + - - ND
7 A7 A. oryzae ++ + - - ND
8 A8 A. oryzae ++ ++ - - ND
9 A9 A. oryzae + + - - ND
10 102487 A. oryzae +++ + - + ND
실시예 2. 황국균의 쌀 발효 및 대두 발효 적용 평가
황국균은 전분 분해 활성이 강한 균주로 쌀이나 밀에서 당화력이 높아 발효에 따라 단맛이 부여되거나 단맛에서 오는 향미를 준다. 선발된 황국균을 쌀에 접종하여 3일간 발효하여 α-아밀라아제 활성을 분석한 결과는 표 8과 같다. 균주 중 1번, 4번, 5번 및 SRCM102487 균주가 활성이 높게 나타났다.
아스퍼질러스 오리재 균주에 의한 쌀 발효물의 α-아밀라아제 활성(Unit : unit/g)
No. 균주명
(SRCM)		 Fermentation days(3)
1 A1 1659.63±3.24
2 A2 1476.38±11.21
3 A3 1425.20±10.21
4 A4 1680.16±7.54
5 A5 1661.95±4.92
6 A6 1554.63±14.23
9 A9 1540.61±1.32
10 102487 1667.68±2.31
된장 제조에 앞서 대두에 황국균을 접종하여 발효한 후 적용평가를 실시하였다. 각 균주를 대두에 접종하여 발효 전과 발효 후의 효소활성 및 아미노산성 질소를 평가한 결과는 아래 표 9와 같다. 황국균을 대두에 접종하여 3일간 발효하여 효소활성을 평가한 결과 프로테아제 활성은 SRCM102487 균주가 높은 활성을 나타내었다. 아미노태 질소 함량은 모든 균주에 있어 발효 전에 비해 발효 후에 높아지는 경향을 나타내었으며, 그 중 9번과 SRCM102487 균주가 높은 값을 나타내었다. 위 결과를 미루어 볼 때 선발된 균주 황국균 중 단백질 분해 활성이 높으면서 아미노태 질소 함량이 높은 SRCM102487 균주를 포함한 3종의 균주를 1차 선정하였다.
아스퍼질러스 오리재 균주에 의한 대두 발효물의 특성
No. Strain
(SRCM)		 Enzyme activity after fermentation(3days) Amino type nitrogen(mg%)
Protease activity(unit/g) α-amylase activity(unit/g) Fermentation days
0 3
1 A1 16.23±0.641)e2) 1093.75±26.69c 105.89±4.14a 122.32±2.77g
2 A2 25.65±1.71bc 967.20±3.12e 110.44±6.68a 378.05±14.72de
3 A3 22.70±1.18cd 1195.79±10.89a 105.57±0.61a 363.76±18.77de
4 A4 11.55±2.87f 1208.13±4.90a 105.57±0.61a 365.75±10.94de
5 A5 18.81±1.92de 1188.06±7.96a 108.28±3.02a 353.85±6.04e
6 A6 11.97±0.11f 1150.57±12.44b 112.14±9.02a 455.49±4.65c
7 A7 7.74±0.25g 507.7±8.91g 106.07±0.10a 393.05±19.70d
8 A8 41.45±2.87a 1056.59±14.59d 112.24±3.00a 272.19±16.19f
9 A9 28.63±1.90b 979.17±2.46e 103.90±0.74a 488.87±11.50b
10 102487 42.36±2.30a 762.70±7.06f 106.38±1.22a 468.86±4.75bc
실시예 3. 고초균의 대두 발효 적용 평가
고초균을 대두에 접종하여 5일간 발효하여 효소활성을 평가한 결과 프로테아제 활성은 8.82±0.39~10.04±0.09로 균주별로 큰 차이는 보이지 않았다. α-아밀라아제 활성은 6번이 가장 높은 활성을 나타내었으며, 그 다음은 5번, SRCM104466순으로 나타났다. 아미노태 질소 함량은 6번이 가장 높은 값을 나타내었으며, 그 다음은 SRCM104466으로 나타났다. 따라서, α-아밀라아제 활성과 아미노태 질소 함량이 높은 SRCM104466 균주를 포함하는 3종의 균주를 1차 선정하였다.
바실러스 균주에 의한 대두 발효물의 특성
No. Strain
(SRCM)		 Enzyme activity after fermentation(3days) Amino type nitrogen(mg%)
Protease activity(unit/g) α-amylase activity(unit/g) Fermentation days
0 3
1 B1 8.82±0.391)d2) 151.40±12.922)ef3) 115.06±3.34?ab 206.35±1.62c
2 B2 8.98±0.17cd 139.11±17.19f 109.93±7.17?ab 354.04±14.48b
3 B3 9.32±0.18bcd 168.21±5.45def 119.04±0.85?a 214.33±16.05c
4 B4 9.73±0.19ab 249.40±19.75c 112.9±3.28ab 363.70±8.94b
5 B5 9.48±0.24bc 289.43±23.73b 114.57±4.79ab 183.18±5.86c
6 B6 9.83±0.32ab 357.63±11.58a 118.34±1.92a 402.71±21.28a
7 B7 9.34±0.21bcd 173.70±6.96de 106.94±6.7b 201.36±26.68c
8 B8 10.04±0.09a 187.40±6.80d 115.74±2.86ab 180.53±0.30c
9 104466 9.58±0.12ab 254.09±10.15c 118.25±6.41a 384.80±8.99ab
10 B9 9.29±0.13cd 152.02±5.86ef 113.89±4.26ab 199.57±20.89c
실시예 4. 황국균 3종을 이용한 쌀 발효물의 발효기간별 품질특성
장류제조에 있어 이전의 선행연구를 바탕으로 된장을 제조하기 위해 균주의 복합발효는 lab scale에서는 적용이 가능하나 100 kg 이상의 pilot scale로 확대 적용시 시제품 생산에만 그쳐있다. 또한 저염 된장을 제조하기 위해서는 복합발효는 염도로 인해 균주의 적정 생육이 이루어지지 않는다. 따라서 본 실험에서는 생산적용 및 상품화를 용이하게 하기 위해 선별된 균주를 쌀에 발효하고 이를 이용한 각 발효물을 제조하고 숙성기간 중의 평가를 통하여 최종 숙성기간 및 균주를 선발하고 된장을 제조하고자 하였다.
황국균 3종을 쌀에 적용하여 발효한 후 쌀 코지를 제조하고 최종 5%의 염도로 조정하여 제조한 후 적정 균주를 선발하고자 숙성 0일부터 6일까지의 특성을 평가한 결과 pH는 숙성기간이 지남에 따라 낮아지는 경향을 보였고, 산도는 높아지는 경향을 보였다. 염도와 수분함량은 숙성기간에 따라 균주별, 숙성기간별로 유의차를 보이지 않았다. 발효과정 중, 원료의 전분이 미생물이 분비하는 효소의 작용으로 가수분해되어 단맛 성분의 주체인 당류가 생성되는데 이의 양을 측정하기 위해 환원당과 총당 함량을 평가하였다. 총당 함량은 숙성기간에 따라 증가하는 경향을 보였으며, SRCM102487 균주가 가장 높은 함량을 나타내었다. 환원당 함량 역시 숙성기간에 따라 증가하는 경향을 보였으며, SRCM102487 균주가 가장 높은 함량을 나타내었다. 또한 당 함량에 있어 SRCM102487 균주는 숙성 5일까지는 증가하다가 숙성 6일차에는 감소하는 경향을 나타내었다. 글루탐산 함량은 숙성기간에 따라 증가하는 경향을 나타내었고, 숙성 6일차에 SRCM102487 균주가 17.77±0.39 mg/100 g으로 가장 높은 함량을 나타내었다. 아미노태 질소 역시 숙성기간에 따라 증가하는 경향을 나타내었고, 숙성 6일차에 SRCM102487 균주가 가장 높은 함량을 나타내었다. 본 실험결과를 바탕으로 쌀 발효물 제조용 균주로는 SRCM102487 균주로 선발하고 숙성 적정기간은 6일로 결정하였다.
Figure 112020128494318-pat00001
실시예 5. 고초균 3종을 이용한 대두 발효물의 발효기간별 품질특성
선별된 고초균 3종을 대두에 발효하고 이를 최종 11%의 염도로 조정하여 제조한 후 0일부터 21일까지 숙성하면서 특성을 평가하였다. pH는 숙성기간에 따라 낮아지고 산도는 높아지는 경향을 나타내었다. 염도와 수분함량은 숙성기간에 따라 균주별, 숙성기간별로 유의차를 보이지 않았다. 총당 및 환원당 함량은 숙성기간이 지남에 따라 초기보다 증가하는 경향을 보였으며, 2번 균주가 가장 높은 값을 나타내었다. 글루탐산 함량 및 아미노산성 질소 함량은 숙성기간에 따라 증가하는 경향을 보였으며, 균주별로는 SRCM104466 균주가 가장 높은 함량을 나타내었다. 또한 SRCM104466 균주는 숙성기간 14일까지는 증가하다가 21일에 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 대두 발효물 제조용 균주로는 SRCM104466 균주로 선발하고 숙성적정기간은 14일로 결정하였다. 이전 실험에서 황국균과 고초균을 대두에 발효하여 평가하였을 때 결과와 소금을 첨가하여 제조한 발효물에서의 균주별 특성은 다르게 나타났으며, 염에 따라 미생물의 생육 및 효소활성으로 인하여 특성이 달라지고 추후 단맛 및 감칠맛에도 영향을 미치는 것으로 판단되었다.
Figure 112020128494318-pat00002
실시예 6. 선발된 균주를 이용한 쌀 및 대두 발효물의 품질특성 비교
기존 주관기관에서 사용중인 균주를 대조구(control)로 하고 선발된 균주(SRCM102487, SRCM104466)를 시험구(sample)로 하여 각각의 쌀, 대두 발효물을 제조하여 특성을 비교하였다. 각각의 균주를 사용하여 쌀 코지를 제조하고 염을 첨가하여 숙성 6일을 진행하였고, 대두는 각 고초균을 이용하여 대두발효물을 제조하고 숙성 3주 후 품질특성을 비교하였다. pH 및 산도, 수분함량, 염도에서는 차이를 보이지 않았으나 아미노산성 질소 함량은 유의적인 차이를 나타내었다. 이 결과로 미루어 볼 때 선발된 균주는 기존 균주에 비하여 효소활성이 높아 장류를 제조함에 있어 같은 숙성기간일지라도 더 높은 숙성도를 나타낼 수 있다고 판단되었다.
선별된 균주에 의한 발효물의 품질 특성
Quality
characteristics		 Fermented products 대조구 시험구
pH Rice 6.18±0.08 6.20±0.07
Soybean 6.20±0.03 6.12±0.04
Titratable acidity Rice 0.24±0.01 0.20±0.04
Soybean 0.25±0.02 0.27±0.04
Salt content(%) Rice 5.55±0.07 5.45
Soybean 11.55±0.07 11.45±0.07
Moisture content(%) Rice 50.16±0.49 49.89±0.45
Soybean 51.61±0.30 52.02±0.16
Amino type nitrogen content (mg/100g) Rice 215.93±6.73 240.42±4.52
Soybean 628.60±7.92 672.41±9.10
실시예 7. 선발된 균주를 이용한 쌀 및 대두 발효물의 유리아미노산 함량
선발된 균주를 이용한 쌀 및 대두 발효물의 유리아미노산 함량을 측정한 결과는 아래 표 14와 같다. 쌀 발효물은 26종의 유리아미노산이 분석되었는데, 대조구에 비해 선발된 균주를 이용한 발효물의 총 유리아미노산 함량이 2896.09 mg%로 더 높은 함량을 보여주었다. 특히 감칠맛을 나타내는 아스파르트산(aspartic acid)과 글루탐산(glutamic acid)이 더 높은 함량을 나타내었으며, 단맛을 나타내는 알라닌(alanine), 아르기닌(arginine) 역시 높은 함량을 나타내었다. 대두 발효물은 총 28종의 유리아미노산이 분석되었으며, 대두 발효물 역시 대조구에 비해 선발된 균주를 이용한 발효물의 총 유리아미노산 함량이 더 높은 함량을 보여주었다. 특히 감칠맛을 나타내는 아스파라트산과 글루탐산이 높은 함량을 나타내었으며, 쓴맛을 나타내는 류신(leucine), 이소류신(isoleucine)은 더 낮은 함량을 나타내었다. 이를 통해 선발된 균주는 감칠맛과 단맛 등 복합적인 맛을 나타낼 수 있는 장류의 선발균주로 사용이 가능할 것으로 판단되었다.
선별 균주에 의한 발효물의 유리 아미노산 함량(mg%)
No. Amino acids 쌀 발효물 대두 발효물
대조구 시험구 대조구 시험구
1 Phosphoserine 30.83 36.71 80.64 77.86
2 Aspartic Acid 156.12 174.65 277.26 303.07
3 Threonine 81.58 123.07 171.27 133.82
4 Serine 77.84 73.31 94.25 89.07
5 Glutamic Acid 226.47 292.31 366.31 427.23
6 a-Aminoadipic Acid 9.99 21.91 41.94 55.48
7 Glycine 125.71 213.16 167.55 165.57
8 Alanine 246.34 388.17 477.53 452.72
9 Valine 150.62 180.16 334.23 337.22
10 Cystine 34.68 41.03 12.87 14.81
11 Methionine 60.13 68.31 115.26 112.86
12 Isoleucine 175.67 138.39 383.89 331.54
13 Leucine 288.26 241.24 426.13 390.43
14 Tyrosine 129.01 160.31 239.92 294.60
15 Phenylalanine 95.11 154.90 289.01 297.72
16 b-Alanine 24.78 33.54 8.90 23.60
17 b-Aminoisobutyric Acid 29.93 25.88 42.94 56.35
18 r-Aminobutyric Acid 41.69 43.82 9.45 29.06
19 Tryptamine 12.56 13.82 29.42 38.18
20 Ethanol amine 2.99 4.28 1.87 8.86
21 Ammonia 53.96 58.05 52.26 43.54
22 Hylys 15.66 17.63 11.51 8.97
23 Ornithin 7.45 15.29 52.39 47.88
24 Histidine 106.56 111.79 195.76 299.27
25 Lysine 27.16 50.71 53.86 58.25
26 3-Methylhistidine - - 1.17 5.14
27 Anserine - - 18.08 -
28 Arginine 181.90 213.65 174.49 199.88
　Total 2,393.00 2,896.09 4,130.16 4,302.98
실시예 8. 선발된 균주를 이용한 쌀 및 대두 발효물의 핵산관련 물질
선발균주를 이용한 각 발효물의 핵산관련물질을 분석한 결과 하이포크산틴(hypoxanthine)의 함량이 가장 많았고 그 다음은 IMP순으로 나타났으며, 선발균주를 이용한 발효물의 물질 함량이 대조구에 비해 높은 함량을 나타내었다. 핵산 관련 성분의 분해과정에서 생성되는 정미성분인 IMP는 AMP가 AMP 탈아미노 효소의 작용에 의하여 생성된 성분으로 향미 강화기능을 한다. 일반적으로 장류 중의 핵산관련물질은 원료 대두나 보리속의 RNA가 효소작용에 의해 RNA-AMP-IMP-이노신(inosine)-하이포크산틴(hypoxanthine)으로의 분해 경로에 따라 생성되고 IMP는 아스파르트산(aspartic acid)과 글루탐산(glutamic acid)에 대하여 감칠맛의 상승제로 작용한다는 보고가 있는데, 상기 분석결과와 동일한 결과로 감칠맛을 내는 유리아미노산과 핵산물질로 인해 장류 제조 시 장의 고유의 맛인 감칠맛, 구수한 맛을 나타낼 수 있을 것으로 판단되었다.
선별 균주에 의한 발효물의 핵산관련물질 함량
No. Nucleotides Related Compounds 쌀 발효물 대두 발효물
대조구 시험구 대조구 시험구
1 IMP
(mg/100g)		 5.14±0.13 11.58±0.241) 4.44±0.03 8.60±0.06
2 Hypoxanthine
(mg/100g)		 12.15±0.12 19.09±0.17 11.78±0.16 22.47±0.03
3 AMP
(mg/100g)		 3.22±0.05 4.46±0.02 3.91±0.03 4.06±0.05
4 Inosine
(mg/100g)		 6.94±0.15 7.12±0.03 10.22±0.36 6.65±0.03
실시예 9. 선발된 균주를 이용한 쌀 및 대두 발효물의 향기성분 분석
선발 균주를 이용한 각 발효물의 향기성분을 분석한 결과를 아래 표 16 내지 19에 나타내었다. 발효물의 휘발성 성분을 분석한 결과, 총 65종의 화합물이 동정되었다. 이 중에서 알데히드류 9종, 알코올류 5종, 산류 2종, 에스테르류 22종, 탄화수소류 15종, 질소 함유 화합물 2종, 기타 화합물 10종이 동정되었다. 알데히드류가 발효 중 지방 산화 또는 분해산물로 생성되며 이러한 대사는 된장의 과일향, 넛트향, 로스팅향에 기여한다고 보고되었다. 선정된 균주를 이용한 쌀 발효물과 대두 발효물은 각각의 대조구에 비해 과일향, 아몬드향, 오렌지향 등을 가진 알데히드류 함량이 증가하였는데, 이는 미생물의 높은 효소활성으로 인한 분해산물로 증가한 것으로 판단되어진다.
퓨란 유도체는 된장 제조 과정 중 생성되는 당의 가열에 따른 마이얄 반응으로 생성되고, 된장에서의 구수한 향과 쿰쿰한 향의 주성분이라고 알려져 있는데, 실제로 본 실험에서 가열에 따라 퓨란 유도체인 2-페닐퓨란(2-phenylfuran) 함량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 피라진류는 주로 식품이나 원료의 가열조작에 의해 생성되는 갈변 풍미의 대표적 물질로 가열식품의 향기에 중요한 역할을 하는 물질로 이 대부분은 단백질, 아미노산의 열분해, 당과 단백질 혹은 아미노산과의 반응에서 생성되는 것으로 알려졌다. 피라진류는 대개 고소한 견과류의 향을 내는 것으로 된장의 풍미에 긍정적으로 작용하는 것으로 알려졌으며, 실제로 본 실험에서 선정된 균주를 이용한 대두 발효물은 대조구에 비해 함량이 증가한 것으로 나타났다. 탄화수소류는 총 15종이 검출되었는데, 대조구에 비해 선발된 균주를 이용한 각 발효물에서 검출되었는다. 이는 각 원료가 가지는 당단백질이 미생물의 주요 효소에 의해 고분자물질이 끊어진 분해산물로 추정되었다. 본 실험 결과 된장의 고소한 향을 지니는 피라진류가 높게 나타나고, 된장의 고린내로 특정 지어지는 3-메틸 부탄산(3-methyl butanoic acid)은 검출되지 않은 것으로 보아 선정된 균주는 된장의 향미에 있어 긍정적인 역할을 할 것으로 판단되었다.
Figure 112020128494318-pat00003
Figure 112020128494318-pat00004
Figure 112020128494318-pat00005
Figure 112020128494318-pat00006
실시예 10. 균주의 동정
최종 선발된 곰팡이에 대해 형태학적 특징을 분석하였으며, 유전학적 동정을 위해서 선정된 3종의 유전자서열 분석 결과를 이용하여 NCBI nucleotide BLAST search를 수행하였고, GenBank에 등록된 타 균주와의 상동성을 분석하였다. 이들의 염기서열을 바탕으로 계통수(phylogenetic tree)를 작성하기 위해 evolutionary distance 추론은 Maximum Likelihood method를 사용하였고, bootstrap 분석 1,000회를 시행하여 계통수의 신뢰도를 확보하여 동정하였다. 선발된 균주는 한국미생물보존센터에 유전자원 등록을 하였으며 등록번호는 각각 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae, KCCM12804P), 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens, KCCM12803P)로 한국미생물보존센터에 2020년 10월 15일자로 기탁하였다.
실시예 11. 된장의 제조 및 특성 분석
상기 대조구 발효물과 처리구 발효물을 이용한 각 된장 및 시판된장(기존 주관기관 유아용 된장)의 이화학적 특성을 분석한 결과는 표 20과 같다. pH는 시판된장이 가장 낮았으며, 산도는 가장 높은 값을 보여주었다. 염도는 시판된장이 11.25%로 가장 높았으며, 수분 함량 역시 가장 높은 함량을 나타내었다. 아미노산성 질소 함량은 선발된 균주를 이용한 된장이 가장 높은 함량을 나타내었다.
3가지 된장의 품질특성
Quality characteristics 대조구 처리구 시판된장
1 pH 6.68±0.041)a2) 6.67±0.01a 6.10±0.02b
2 Titratable acidity 0.33±0.01b 0.34±0.00b 0.54±0.00a
3 Salt content (%) 8.95±0.07b 9.05±0.07b 11.25±0.07a
4 Moisture content (%) 49.91±0.33b 50.87±0.58b 53.51±0.39a
5 Amino type nitrogen content (mg/100g) 438.02±7.83b 469.71±1.92a 462.00±1.85a
실시예 12. 된장의 유기산, 유리당
된장 3종의 유기산 및 유리당을 분석한 결과는 아래 표 21과 같다. 유기산은 된장의 풍미 형성에 영향을 주며, 적당량은 보존성에도 관여하는 중요한 성분으로 본 연구결과 4종의 유기산이 검출되었다. 선발된 균주를 이용한 된장은 유기산은 구연산(citric acid)과 젖산(lactic acid)의 함량이 높은 결과를 보였으며, 구연산 및 젖산은 원료인 콩과 된장의 숙성과정 중 생육하는 내염성 젖산균의 작용에 의해 생성된 것으로 보고된 바 있는데, 본 실험에서는 선정된 균주인 고초균 및 황국균이 높은 효소활성으로 인해 원료 유래 젖산염(lactate)을 많이 생성된 것으로 판단되었다.
유리당은 선정된 균주를 이용한 된장에서는 글루코스가 가장 높은 함량을 보였으며, 각 된장별 유리당의 차이는 발효에 사용된 균주 및 제조방법의 차이에 의한 결과라고 판단되었다.
3가지 된장의 유기산 및 유리당 함량
항목 대조구 처리구 시판된장
유기산 oxalic acid 632.00±5.091)a2) 244.9±3.63b 119.15±3.08b
citric acid 187.14±4.94b 515.50±2.25a 149.42±4.31c
succinic acid 761.77±5.06a 425.88±14.85b 236.71±8.43c
lactic acid 233.32±14.06c 516.95±14.71b 503.19±12.01a
유리당 maltose 427.55±12.23b 598.54±1.04a 15.04±4.33c
glucose 2658.92±43.06b 3787.64±6.93a 173.25±16.73c
fructose 454.07±7.39a 412.99±6.63b 333.14±4.93c
실시예 13. 된장의 유리아미노산
된장 3종의 유리아미노산 함량을 측정한 결과는 아래 표 22와 같다. 선정된 균주를 이용한 된장의 총 유리아미노산 함량이 4,030.41 mg%로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 그 다음은 시판된장, 대조구순의 결과를 나타내었다. 지미성분 강화를 위해서는 글루탐산(glutamic acid) 분해를 유도하는 것이 좋고 쓴맛은 메티오닌(methionine), 이소류신(isoleucine), 류신(leucine) 등의 유리아미노산과 펩타이드(peptide)에 의해 주로 좌우되므로 맛의 조화면에서 적당한 고미를 유지할 필요가 있다. 본 실험결과 선정된 균주를 이용한 된장의 글루탐산(glutamic acid)과 아스파르트산(aspartic acid) 함량이 높은 결과를 나타내었으며. 감미를 나타내는 글리신(glycine), 알라닌(alanine), 리신(lysine)은 선정된 균주를 이용한 된장이 높은 함량을 나타내었다.
3가지 된장의 유리아미노산 함량(mg%)
No. Amino acids 대조구 처리구 시판된장
1 Phosphoserine 55.71 65.36 52.28
2 Aspartic Acid 213.21 320.06 170.57
3 Threonine 82.99 130.70 104.56
4 Serine 78.45 83.82 67.05
5 Glutamic Acid 414.37 510.53 385.49
6 a-Aminoadipic Acid 42.26 45.48 36.38
7 Glycine 80.89 95.25 76.20
8 Alanine 255.21 339.78 271.83
9 Valine 175.99 236.03 188.82
10 Cystine 28.94 34.78 27.82
11 Methionine 126.67 161.38 129.10
12 Isoleucine 260.53 271.96 314.95
13 Leucine 286.97 304.54 380.68
14 Tyrosine 122.19 176.57 141.26
15 Phenylalanine 184.63 281.61 225.29
16 b-Alanine 61.96 52.93 42.34
17 b-Aminoisobutyric Acid 60.31 63.81 51.05
18 r-Aminobutyric Acid 22.77 30.23 24.19
19 Tryptamine 34.18 36.61 29.29
20 Ethanol amine 15.67 16.44 13.15
21 Ammonia 77.01 86.67 77.34
22 Hylys 2.29 29.06 13.24
23 Ornithin 42.34 89.23 51.38
24 Histidine 231.33 276.43 221.15
25 Lysine 45.56 68.66 44.93
26 3-Methylhistidine 10.57 12.48 8.24
27 Arginine 129.93 210.01 168.01
　Total 3,142.93 4,030.41 3,316.59
실시예 14. 된장의 핵산관련물질
된장 3종의 핵산관련물질을 분석한 결과는 아래 표 23과 같다. 핵산관련물질은 글루탐산(glutamic acid)과 아스파르트산(aspartic acid)과 함께 감칠맛을 증진시키는 효과가 있으며, 풍부한 맛을 내는데 중요한 역할을 한다. 본 실험결과 핵산관련물질은 선정된 균주를 이용한 된장이 하이포크산틴(hypoxanthine), 이노신(inosine), IMP, AMP 순으로 높게 나타났는데, 이 결과는 상기 발효물의 분석결과와 유사한 결과를 보여주었다. AMP는 AMP 탈아미노효소에 의한 탈아미노 반응을 거쳐 IMP로 분해되고, IMP는 시간이 지남에 따라 효소적 작용에 의해 이노신 또는 하이포크산틴으로 분해되며, 이노신 또한 최종적으로 하이포크산틴으로 분해된다고 하였다.
된장의 핵산관련물질 함량
No. 핵산관련물질 함량 대조구 처리구 시판된장
1 IMP
(mg/100g)		 4.20±0.05b 4.28±0.04ab 4.34±0.02a
2 Hypoxanthine
(mg/100g)		 16.31±0.26c 21.41±0.30a 19.19±0.18b
3 AMP
(mg/100g)		 3.16±0.04c 3.36±0.01a 3.06±0.02b
4 Inosine
(mg/100g)		 8.06±0.03b 13.06±0.11a 5.81±0.03c
실시예 15. 된장의 향기성분분석
쌀 발효물과 콩 발효물을 혼합하여 저염 혼합된장을 만들어 숙성시킨 후 휘발성 성분 분석 결과를 아래 표 24 내지 28에 나타내었고, 비교를 위해 시판된장과 대조구를 함께 분석하였다. 저염된장, 대조구 및 시판된장의 휘발성 성분을 분석한 결과, 총 77종의 화합물이 동정되었다. 이 중에서 알데히드류 8종, 에스테르류 34종, 탄화수소류 14종, 기타 화합물 21종이 동정 되었다. 에스테르류는 식품의 좋은 향기성분에 기여하는 가장 바람직한 성분으로 알려져 있고, 숙성된 된장의 구수한 냄새에 기여한다고 보고되어 있다. 에스테르 화합물의 종류나 함량은 된장의 제조 방법에 따라 차이가 크고, 미생물상(microflora)의 차이에 중요한 역할을 한다고 많은 논문에서 보고되었고, 또한 향미특성 뿐만 아니라 낮은 역치를 가지고 있기 때문에 된장의 향미특성에서의 차이를 보인다. 향기 성분 분석 결과, 에스테르류 함량이 모든 된장에서 약 90% 이상을 차지하였다. 시판된장은 저염 혼합된장에 비해 유리지방산과 에탄올의 에스테르화로 인해 생성된 에틸에스테르(ethyl esters) 화합물들이 대부분 동정되었다.
알데히드류가 발효 중 지방 산화나 발효 중 분해산물로 생성되며 이러한 대사는 된장의 과일향(fruity), 견과류향(nutty), 로스팅향(roasting)에 기여한다고 보고하였다. 저염 혼합된장에서는 장미향을 가진 노나날(nonanal), 과일향을 가진 헥사날(haxanal)이 대조구와 시판된장에 비해 많은 함량을 나타냈다. 방향족 알데히드 중 구조가 가장 간단하고 아몬드와 유사한 향미 특성이 있으며 공기 중에서 쉽게 산화되는 벤즈알데히드(benzaldehyde)는 모두 검출되었으며, 저염 혼합된장에서는 함량이 0.23%로 가장 높았다. 또한 특징적으로 저염 혼합된장에서 탄화수소류가 많이 검출되었다. 펜타코산(pentacosane), 옥탄데칸(octadecane) 등의 화합물이 높은 함량을 나타내었다. 이 화합물은 당단백질과 같이 탄화수소류의 가지(branch)를 가진 고분자물질들의 분해산물로 추정되는데, 이는 콩 발효물에서 기인한 것으로 추정된다. 피라진류 중 트리메틸피라진(trimethylpyrazine)은 가열한 된장의 향기성분으로 알려져 있으며, 2,5-디메틸-피라진(2,5-dimethyl-pyrazine)과 2,3,5-트리메틸피라진(2,3,5-trimethylpyrazine)은 감칠맛에 기여하는 향기성분으로 선정된 균주를 이용한 된장에서 검출된 것으로 나타났다.
2-에틸 퓨란(2-ethyl furan), 1,2-디메틸 벤젠(1,2-dimethyl benzene), 2-펜틸 퓨란(2-pentyl furan) 등을 된장의 구수한 향을 내는 향미물질로 정하여 된장 모델을 구축하였는데, 이는 전통된장과 가장 유사한 구수한 향을 나타내는 향미들 중의 하나로 본 연구결과에서 선정된 균주를 이용한 된장에서도 검출된 물질로 나타났다. 본 연구결과 3가지 된장의 향기성분을 분석하였을 때, 선정된 균주를 이용한 된장은 감칠맛 및 구수한 맛에 영향을 주는 향미물질 들의 다양한 검출로 인하여 선정된 균주는 장류 제조시 향미에 긍정적인 영향을 줄 것으로 판단되었다.
Figure 112020128494318-pat00007
Figure 112020128494318-pat00008
Figure 112020128494318-pat00009
Figure 112020128494318-pat00010
Figure 112020128494318-pat00011
한국미생물보존센터(국외) KCCM12803P 20201015 한국미생물보존센터(국외) KCCM12804P 20201015

Claims (7)

  1. 아밀라아제, 프로테아제, β-글루코시다아제 및 셀룰라아제의 효소 분비능, γ-용혈 활성, 혈전분해 활성 및 항산화 활성과 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 및 리스테리아 모노시토게네스(Listeria monocytogenes)의 유해미생물에 대한 항균활성이 있고, 페닐알라닌(phenylalanine), 우레아제(urease), β-글루쿠로니다아제(β-glucuronidase), 티라민 및 히스타민을 생성하지 않는 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P).
  2. 삭제
  3. 제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 대두 발효용 미생물 제제.
  4. 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주(KCCM12803P) 및 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주(KCCM12804P)를 유효성분으로 함유하는 된장 제조용 미생물 제제.
  5. (1) 대두에 물을 첨가하여 침지하고 물을 뺀 후 증자하고, 제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주를 접종한 후 발효한 발효물에 소금을 첨가하고 숙성시켜 대두 고초균 발효물을 제조하는 단계;
    (2) 쌀에 물을 첨가하여 침지하고 물을 뺀 후 증자하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주(KCCM12804P)를 접종한 후 발효한 발효물에 소금 및 물을 첨가하고 숙성시켜 쌀 황국균 발효물을 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 (1)단계의 제조한 대두 고초균 발효물 및 상기 (2)단계의 제조한 쌀 황국균 발효물을 혼합한 혼합물을 숙성시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 된장의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서,
    (1) 대두에 물을 첨가하여 10~14시간 동안 침지하고 물을 뺀 후 110~130℃에서 20~40분 동안 증자하고, 제1항의 바실러스 아밀로리퀴페시언스(Bacillus amyloliquefaciens) SRCM104466 균주를 접종하여 38~42℃에서 1~5일 동안 발효한 발효물에 소금을 88~90:10~12 중량비율로 첨가하고 38~42℃에서 12~16일 동안 숙성시켜 대두 고초균 발효물을 제조하는 단계;
    (2) 쌀에 물을 첨가하여 1~3시간 동안 침지하고 물을 뺀 후 110~130℃에서 10~20분 동안 증자하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) SRCM102487 균주(KCCM12804P)를 접종하고 28~32℃에서 1~3일 동안 발효한 발효물에 소금 및 물을 53~57:4~6:38~42 중량비율로 첨가하고 28~32℃에서 5~7일 동안 숙성시켜 쌀 황국균 발효물을 제조하는 단계; 및
    (3) 상기 (1)단계의 제조한 대두 고초균 발효물 및 상기 (2)단계의 제조한 쌀 황국균 발효물을 0.8~1.2:0.8~1.2 중량비율로 혼합한 혼합물을 28~32℃에서 7~14일 동안 숙성시키는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 된장의 제조방법.
  7. 제5항의 방법으로 제조된 된장.
KR1020200162952A 2020-11-27 2020-11-27 저염맛내기 된장 제조용 바실러스 아밀로리퀴페시언스 srcm104466 균주 및 아스퍼질러스 오리재 srcm102487 균주의 특성 KR102242535B1 (ko)

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