KR101693315B1 - 기능성 균주를 이용한 보리 된장의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 보리 된장 - Google Patents

기능성 균주를 이용한 보리 된장의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 보리 된장 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계; (b) 소맥분을 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계; (c) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계; (d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 혼합하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계; (f) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효한 후 소금을 첨가하여 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및 (g) 상기 (e)단계의 숙성물 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장과 주정, 육수 및 메줏가루를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리된장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 보리된장에 관한 것이다.

Description

기능성 균주를 이용한 보리 된장의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 보리 된장{Method for producing barley soybean paste using functional strain and barley soybean paste produced by the same method}
본 발명은 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주를 이용하여 제조된 코지와 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주를 이용하여 제조된 한식된장을 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리된장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 보리된장에 관한 것이다.
된장은 제조방식에 따라 약간의 차이는 있으나 일반적으로 대두를 삶아 찧고, 성형한 다음 자연 상태에서 미생물들이 착생, 번식하도록 한 메주를 소금물에 담군 후 일정기간 동안 발효 숙성시켜 가정에서 제조하는 재래식 된장과, 공장에서 대두와 밀가루 등에 아스퍼질러스 오리재를 접종, 배양하여 코지(koji)를 만들어 제조하는 개량식 된장이 있다. 그러나, 기존의 재래식 된장 제조방법은 메주의 제조방법이 까다롭고 자동화 내지 반자동화가 어려워 노동집약적 비효율성을 감수해야 하며, 또한 메주의 염수 침지 시간이 지나치게 길어 제조 원가상승 요인이 될 소지가 많은 반면에 개량식의 경우 제조시간 단축, 공정의 자동화 내지 반자동화가 가능한 이점은 있으나 전통적 풍미와 특성을 가진 된장으로는 미흡하여 이들의 절충적 방법에 의한 된장의 제조가 선호되고 있는 실정이다.
개량식 장류라 불리는 공장식 장류의 제조는 소맥분에 황국곰팡이(Aspegillus oryza)를 배양하여 제조된 코지(koji)로 콩과 함께 담금하여 제조하고 설비의 기계화로 대량생산이 가능하다. 하지만 사용하는 종균은 일본식 종균에 한정되어 있으며, 맛과 풍미는 단순화되고 획일화되었다. 최근 개량식 된장의 맛과 풍미를 개선하고자 코지와 메주를 혼합 이용하여 전통 풍미를 지닌 개량된장을 제조하고 있으나 업체별, 제품 종류별 품질 차이가 있으며 품질 특성으로는 전통된장과 일본식 된장의 중간 형태를 띠고 있다. 된장 숙성 과정 중의 맛, 향, 색 등의 품질특성은 메주나 코지 제조에 사용하는 균주, 이들의 제조방법에 따라 많은 차이가 있으므로 우수한 품질의 된장을 제조하기 위해서는 당화 및 단백질분해효소의 활성이 강력 우량 균주의 사용이 필요하다.
한편 개량식 된장의 주 효소원으로 수입산 원료를 이용하고 있는데 건강한 원재료와 원산지에 대한 소비자 니즈가 증가함에 따라 장류의 원재료를 바꿀 필요가 있는 실정이다. 다른 곡류에 비해 우수한 기능성을 함유한 보리는 최근 건강기능성 식품소재로서 국민건강증진 및 보건향상을 위해 소비확대를 해나가야 할 것으로 생각된다. 특히 보리 중 제주산 찰보리는 일반 보리보다 식이섬유 및 β-글루칸 함량이 약 30% 이상 더 많이 함유하고 있어 품질이 우수한 이점이 있다.
한국공개특허 제1991-0020168호에는 한국 재래식 된장 제조용 미생물을 이용한 된장의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 기능성 균주를 이용한 보리 된장의 제조방법과는 상이하다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 유해균 및 유해물질이 생성되지 않으면서, 영양성분 및 효소 활성이 강화되고 기호도가 우수한 보리 된장을 제조하기 위해, 선정된 우수 균주들을 이용하여 제조조건을 최적화하여 품질 및 기호도가 증진된 보리 된장의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계; (b) 소맥분을 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계; (c) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계; (d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 혼합하는 단계; (e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계; (f) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효한 후 소금을 첨가하여 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및 (g) 상기 (e)단계의 숙성물 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장과 주정, 육수 및 메줏가루를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리된장의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 보리된장을 제공한다.
본 발명의 방법으로 제조된 보리 된장은 선정된 우수 발효 균주들을 통해 된장 제조 시 발생할 수 있는 유해균 및 유해물질을 저해하고, 다른 균주들을 이용한 된장에 비해 영양성분 및 품질이 우수할 뿐만 아니라, 된장의 감칠맛 및 구수한 맛이 증진되어 기호도가 우수한 보리 된장을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 보리된장의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 2는 아스퍼질러스 오리재 균주 종류를 달리하여 제조된 보리 코지 사진이다.
도 3은 바실러스 균주를 달리하여 제조된 한식된장 사진이다.
도 4는 증자 대두와 코지의 배합비에 따른 pH 및 산도 변화를 비교한 그래프이다. ◇□△: pH, ○＊×: 산도
도 5는 증자 대두와 코지의 배합비에 따른 아미노산성 질소 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 4 내지 5의 숫자 1, 2, 3은 증자 대두와 보리 코지의 비율(1 = 1:1, 2 = 1:1.5, 3 = 1:2)을 의미한다.
도 6은 코지와 증자 대두를 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가한 후 숙성기간에 따른 수분 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 7은 코지와 증자 대두를 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가한 후 숙성기간에 따른 pH 및 산도 변화를 비교한 그래프이다. △×: pH, □◇: 산도
도 8은 코지와 증자 대두를 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가한 후 숙성기간에 따른 염도 변화를 비교한 그래프이다.
도 9는 코지와 증자 대두를 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가한 후 숙성기간에 따른 아미노산성 질소 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 10은 코지와 증자 대두를 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가한 후 숙성기간에 따른 프로테아제 활성 변화를 비교한 그래프이다.
도 6 내지 도 10의 1: 충무발효에서 상업적으로 판매하는 아스퍼질러스 오리재 균주 이용, 2: 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주를 이용한 것을 의미한다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
(b) 소맥분을 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계;
(c) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계;
(d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 혼합하는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계;
(f) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효한 후 소금을 첨가하여 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및
(g) 상기 (e)단계의 숙성물 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장과 주정, 육수 및 메줏가루를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리된장의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 보리된장의 제조방법에서, 상기 아스퍼질러스 오리재 균주는 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주로, 한국미생물보존센터에 2016년 6월 21일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11846P). 상기 기탁된 특정 균주는 아플라톡신 및 바이오제닉 아민을 생성하지 않으면서, 프로테아제 및 아밀라아제 활성이 높고, 상기 특정 균주를 이용하여 제조된 코지는 α-아밀라아제 활성이 높고, β-글루칸 함량이 높은 이점이 있다.
또한, 본 발명의 보리된장의 제조방법에서, 상기 바실러스 서브틸리스 균주는 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주로, 한국미생물보존센터에 2016년 6월 21일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM11847P). 상기 기탁된 특정 균주는 유해균 억제능, 아밀라아제 및 프로테아제 활성이 우수하고, 글루타메이트 생성, 바이오제닉 분해율 및 γ-PGA 활성도 높은 이점이 있으며, 상기 특정 균주를 이용하여 제조된 된장은 아미노산성 질소 및 글루타메이트 함량이 높은 이점이 있다.
본 발명의 보리된장의 제조방법은, 보다 구체적으로는
(a) 보리에 물을 첨가하여 50~70분 동안 침지한 후 110~130℃에서 10~20분 동안 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 28~32℃에서 1~3일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
(b) 소맥분을 110~130℃에서 5~15분 동안 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 28~32℃에서 1~3일 동안 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계;
(c) 대두에 물을 첨가하여 12~18시간 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계;
(d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 9~12:8~11 중량비율로 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 1.6~2.4:0.8~1.2 중량비율로 혼합하는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 28~32℃에서 16~24일 동안 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계;
(f) 대두에 물을 첨가하여 20~28시간 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주(기탁번호: KCCM11847P)를 첨가하여 28~32℃에서 1~3일 동안 발효한 후 소금을 첨가하여 28~32℃에서 80~100일 동안 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및
(g) 보리된장 100 중량부를 기준으로, 상기 (e)단계의 숙성물 79~85 중량부 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장 10~14 중량부와 주정 2~4 중량부, 육수 0.8~1.2 중량부 및 메줏가루 1.6~2.4 중량부를 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(a) 보리에 물을 첨가하여 60분 동안 침지한 후 121℃에서 15분 동안 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 30℃에서 2일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
(b) 소맥분을 121℃에서 10분 동안 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 30℃에서 2일 동안 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계;
(c) 대두에 물을 첨가하여 15시간 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계;
(d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 10.5:9.72 중량비율로 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 2:1 중량비율로 혼합하는 단계;
(e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 30℃에서 20일 동안 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계;
(f) 대두에 물을 첨가하여 24시간 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주(기탁번호: KCCM11847P)를 첨가하여 30℃에서 2일 동안 발효한 후 소금을 첨가하여 30℃에서 90일 동안 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및
(g) 보리된장 100 중량부를 기준으로, 상기 (e)단계의 숙성물 82.2 중량부 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장 12 중량부와 주정 2.8 중량부, 육수 1 중량부 및 메줏가루 2 중량부를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 보리된장의 제조방법에서, 상기 (d)단계의 비율로 코지와 증자 대두를 혼합하는 것이 숙성 시 아미노산성 질소 함량이 증진되는 이점이 있다.
또한, 본 발명의 보리된장의 제조방법에서, 상기 (e)단계의 조건으로 숙성시키는 것이 아미노산성 질소 함량 및 프로테아제 활성이 높으면서 색, 맛, 향 및 기호도가 우수한 이점이 있다.
또한, 본 발명의 보리된장의 제조방법에서, 상기 (f)단계의 조건으로 숙성시켜 한식된장을 제조하는 것이 아미노산성 질소 함량을 증진시킬 수 있었다.
또한, 본 발명의 보리된장의 제조방법에서, 상기 (g)단계의 배합비로 제조된 된장은 감칠맛 및 구수한 맛이 증진되어 품질 및 기호도가 우수한 된장을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 보리된장을 제공한다.
이하, 본 발명의 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1: 보리된장 제조
(a) 제주산 찰보리에 물을 1:1 비율로 첨가하여 60분 동안 침지한 후 121℃에서 15분 동안 증자하고 40℃로 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 30℃ 온도 및 습도 80%에서 2일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하였다.
(b) 소맥분을 121℃에서 10분 동안 증자한 후 40℃로 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 30℃에서 2일 동안 발효하여 소맥분 코지를 제조하였다.
(c) 대두에 물을 1:3 비율로 첨가하여 15시간 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하였다.
(d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 10.5:9.72 중량비율로 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 2:1 중량비율로 혼합하였다.
(e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 30℃에서 20일 동안 숙성시켜 숙성물을 획득하였다.
(f) 대두에 물을 1:3 비율로 첨가하여 24시간 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 40℃로 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주(기탁번호: KCCM11847P)를 0.5% 첨가하여 30℃ 온도 및 80% 습도에서 2일 동안 발효한 후 소금을 첨가하여 30℃에서 90일 동안 숙성시켜 한식된장을 제조하였다.
(g) 보리된장 100 중량부를 기준으로, 상기 (e)단계의 숙성물 82.2 중량부 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장 12 중량부와 주정 2.8 중량부, 사골육수분말 1 중량부 및 메줏가루 2 중량부를 혼합하여 염도 10~11%의 보리 된장을 제조하였다.
실시예 1: 찰보리 코지 및 보리된장에 적합한 균주 선발
1. 실험방법
장류 발효에 바실러스(Bacillus)와 아스퍼질러스(Aspergillus)는 핵심적인 미생물로서 장류의 초기 발효에 두 가지 균주의 역할은 중요하다. 특히 전분질 효소원을 이용한 장류 제조에 있어 단백 및 전분분해 활성은 균주의 특징 중 장류를 발효하는 데 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 보리 코지에 적합한 균주를 선발하기 위하여 진흥원에 보유중인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 대상으로 바이오제닉 아민 생성여부, 아플라톡신 생성 유무, 프로테아제(protease) 및 아밀라아제(amylase) 활성을 측정하여 보리 코지를 제조하는데 이용하고자 하였으며, 우수한 바실러스 균주는 한식된장을 제조하는데 이용하고자 하였다.
가. 실험 방법
(1) 균주 생육
-80℃에 보존 중인 곰팡이 균주는 PDA(Difco, Potato Dextrose Agar) 배지에 스트리킹(streaking)하여 30℃에서 배양하고 바실러스 균주는 NA(Difco, Nutrient Agar) 배지에 스트리킹하여 37℃에서 배양하여 준비하였다.
(2) 아플라톡신(Aflatoxin) 생산 유무
아플라톡신(Aflatoxin) 생산 유무를 확인하기 위하여 5% 코코넛 분말(coconut powder)이 들어간 코코넛 배지에 선발된 곰팡이 균주를 접종하여 28℃에서 72시간 배양한 다음 UV로 형광유무를 확인하였다. 코코넛은 C12-C14의 지방산을 많이 함유하여 가수분해 시 C16-C18보다 더 높은 농도의 글리세롤(glycerol)을 생성하고 이것이 배지 상에서의 높은 아플라톡신을 유도한다. 생성된 아플라톡신은 365 nm의 자외선을 흡수하여 녹색 및 노란색의 형광을 생성한다. 대조구(Control) 균주로 충무발효에서 상업적으로 판매하는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주를 이용하였다.
(3) 고체 배지 조건에서 프로테아제(protease) 및 아밀라아제(amylase) 활성 측정
프로테아제 효소 활성 검사를 위해 탈지유 2%(w/v)를 첨가한 PDA 배지를 이용하였다. 시험 균주를 배지에 접종하고 30℃에서 72시간 배양한 다음 형성되는 투명환 크기를 측정하였고 균주의 균사체 크기로 나누어 상대적인 활성 값을 측정하였다.
고체 배양 상에서 아밀라아제 효소 활성 검사를 위해 전분 2%(w/v)를 첨가한 PDA 배지를 이용하여 시험 균주를 배지에 접종하고 30℃에서 72시간 배양한 다음 아이오딘-아이오딘화칼륨 용액을 이용하여 배지를 염색한 후 구별되는 투명환 크기를 측정하였고 균주의 균사체 크기로 나누어 상대적인 활성 값을 측정하였다.
(4) HPLC를 이용한 바이오제닉 아민(biogenic amines) 분해율 확인
선발한 곰팡이 균주의 바이오제닉 아민 분해율을 확인하기 위하여 삶은 콩가루 0.3 g에 각 16 mg의 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 푸트레신(putrescine) 그리고 카다베린(cadaverine)을 첨가한 0.8 mL PDB 배지를 첨가하고 활성화시킨 균주 배양액 0.2 mL를 접종하였다. 대조군으로 균주를 접종하지 않은 PDB 배지를 사용하였다. 47℃에서 72시간 배양한 후 10,000 g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 상등액 0.1 mL와 아세톤 용해 1% 댄실염화물(dansyl chloride) 80 ㎕, 포화 Na2CO3 50 ㎕, 내부 표준 용액 50 ㎕를 섞어 45℃ 1시간 유도체화 시켰다. 유도체화한 시료 용액에 10% 프롤린(proline) 50 ㎕를 넣어 여분의 댄실염화물을 제거한 뒤 에테르 0.5 mL를 넣고 완전히 섞어주었다. 5분 동안 실온에 방치하여 시료 용액층과 완전히 분리된 상층액 에테르층만을 모으고 에테르를 완전히 증발시킨 후 아세토니트릴 0.1 mL에 녹여 최종 시료로 사용하였다. HPLC는 역상 컬럼으로 C18 Capcell pack(Shiseido, Japan; 4.6 mm × 150 mm, 5 ㎛), 이동상은 0.1% 포름산이 용해된 H2O(A)와 0.1% 포름산이 용해된 아세토니트릴(B)을 사용하였고 농도 경사는 0-10분, A:B=45:55; 10-15분, A:B=35:65, 15-25분, A:B=20:80; 25-30분 A:B=10:90, 유속은 분당 1 mL이었으며 10 ㎕ 시료를 주입하였다. 시료 주입 후 표준물질(histamine, tyramine, putrescine, cadaverin)의 머무름 시간을 확인하고, 같은 머무름 시간에 있는 시료의 면적 값을 비교하여 바이오제닉 아민 분해율(시료 peak 면적 값/ 대조군 peak 면적 값 × 100)을 측정하였다.
(5) 유해균 억제능
바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 및 부패균에 대해 길항능력을 지닌 바실러스(Bacillus) 균주로 안전한 장류를 생산하기 위해, 저염 장류에서 증식한 유해 균주인 바실러스 세레우스(B. cereus)와 스타필로코커스 사프로파이티쿠스( Staphylococcus saprophyticus), 스타필로코커스 와르네리(S. warneri), 스타필로코커스 아우레우스(S. aureus), 리스테리아 모노사이토젠(Listeria monocytogene), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 슈도모나스 쿠드리아브제비(Pseudomonas kudriavzevii)를 대상으로 이들 발효균의 저해능을 조사하였다.
(6) 글루타메이트(Glutamate) 함량
균주의 글루타메이트(Glutamate) 함량은 2% 콩가루 배지에서 47℃에서 48시간 배양 후 13,000 rpm에서 10분 동안 원심 분리하여 균체를 제거하였다. 상등액 50 ㎕를 96 웰 플레이트(well plate)에 분주한 뒤 글루타메이트 분석 키트(Catalog #K629-100; 100 reactions; Store kit at -20℃)의 분석 버퍼(assay buffer) 90 ㎕, 글루타메이트 디벨로퍼(glutamate developer) 8 ㎕, 글루타메이트 효소믹스(glutamate enzyme Mix) 2 ㎕를 상등액이 있는 웰(well)에 분주하였다. 37℃에서 30분간 빛을 차단하며 배양한 뒤 450 nm 마이크로플레이트 리더(microplate reader)에서 O.D.(optical density)값을 측정하였다
(7) γ-PGA(γ-polyglutamate) 생산능
알이 고른 햇콩을 선별하여 이물질을 제거한 후 물에 침지하였다. 침지된 콩을 각각 10 g씩(±0.05 g) 50 mL 튜브에 담고, 121℃에서 15분 동안 열처리하여 증자시켰다. 콩을 발효시키는 우수발효 바실러스 균주는 NB에서 37℃, 18시간 액체 배양하여 1 mL 접종하였다. 37℃에서 48시간 배양 후 콩의 표면에 생긴 γ-PGA의 늘어나는 정도를 측정하여 γ-PGA의 생산능을 확인할 수 있었다.
2. 실험결과
(1) 곰팡이
발효미생물산업진흥원에서 보유중인 곰팡이 균주 중 아스퍼질러스 오리재 균주 중 바이오제닉 아민 생성여부, 아플라톡신 생성 유무, 프로테아제 및 아밀라아제 활성을 측정한 결과는 하기 표 1과 같다. 총 32주에 대한 평가를 하였으며, 32주 모두 장류에서 위해 물질로 여겨지는 바이오제닉 아민을 생성하지 않았으며, 곰팡이의 독소로 알려진 아플라톡신 역시 생성하지 않는 것으로 나타났다. 기존의 업체에서 사용하고 있던 균주(충무발효)에 비해 활성이 좋은 균주를 실험에 이용하기로 하였다.
번호 SRCM No. Identification Aflatoxin 생성 유무 Biogenic amine 생성 유무 *Protease 활성 Amylase 활성
1 충무균주 Aspergillus oryzae - - 1.76 2.10
2 100270 Aspergillus oryzae - - 2.00 3.50
3 100271 Aspergillus oryzae - - 2.22 3.00
4 100272 Aspergillus oryzae - - 1.16 2.70
5 100273 Aspergillus oryzae - - 1.00 2.50
6 100274 Aspergillus oryzae - - 1.50 3.60
7 100275 Aspergillus oryzae - - 2.00 2.40
8 100276 Aspergillus oryzae - - 2.50 3.50
9 100277 Aspergillus oryzae - - 2.50 2.00
10 100278 Aspergillus oryzae - - 2.40 3.00
11 100280 Aspergillus oryzae - - 2.30 3.50
12 100283 Aspergillus oryzae - - 2.10 3.20
13 100667 Aspergillus oryzae - - 1.12 1.12
14 100668 Aspergillus oryzae - - 1.05 1.18
15 100669 Aspergillus oryzae - - 1.30 1.23
16 100670 Aspergillus oryzae - - 1.09 1.09
17 100671 Aspergillus oryzae - - 1.07 1.03
18 100672 Aspergillus oryzae - - 1.08 1.15
19 100673 Aspergillus oryzae - - 1.09 1.03
20 100674 Aspergillus oryzae - - 1.08 1.17
21 100675 Aspergillus oryzae - - 1.07 1.19
22 100676 Aspergillus oryzae - - 1.10 1.06
23 100677 Aspergillus oryzae - - 1.07 1.16
24 100678 Aspergillus oryzae - - 1.08 1.19
25 100679 Aspergillus oryzae - - 1.07 1.22
26 100680 Aspergillus oryzae - - 1.07 1.12
27 100681 Aspergillus oryzae - - 1.07 1.06
28 100682 Aspergillus oryzae - - 1.02 1.06
29 100683 Aspergillus oryzae - - 1.06 1.06
30 100684 Aspergillus oryzae - - 1.05 1.19
31 100685 Aspergillus oryzae - - 1.00 1.31
32 100686 Aspergillus oryzae - - 1.02 1.20
* 프로테아제 & 아밀라아제 활성: 균을 전분 및 탈지유 함유 배지에 접종하고 30℃에서 4일 배양시킨 후 생성되는 투명환 지름을 균 콜로니 지름으로 나눈 값
(2) 바실러스
발효미생물산업진흥원에서 보유중인 바실러스 균주 중 바이오제닉 아민 분해율, 프로테아제 및 아밀라아제 활성, 글루타메이트 함량, 유해균 억제능, 감마 PGA 함량을 측정한 결과는 표 2 내지 5와 같았다. 총 18주에 대한 평가를 하였으며, 18균주 모두 장류에서 위해 식중독균으로 불리우는 바실러스 세레우스 유해균을 억제하는 능력을 보였다. SRCM101273과 SRCM101275 균주는 다른 균주에 비해 높은 단백질 분해 활성을 보였으며, SRCM101273과 SRCM101274 균주는 다른 균주에 비해 높은 γ-PGA의 활성도 나타내었다.
총 18주 중 바실러스 메틸로트로피커스(B. methylotrophicus)를 제외하고 GRAS 균주를 실험에 이용하기로 하였다. 이 중 장류 제조에 있어 중요한 역할을 하는 효소활성과 글루타메이트 함량을 기준으로 실험에 이용하기로 하였다.
바실러스 균주의 유해균 억제능 1
유해균 억제능 1 2 3 4 5 6
SRCM101338 SRCM101268 SRCM101270 SRCM101271 SRCM101272 SRCM101273
B. amyloliquefaciens B. subtilis B. subtilis B. methylotrophicus B. subtilis B. subtilis
B. cereus
(0607)		 1.85 1.93 1.95 1.7 1.7 1.36
B. cereus
(1016)		 1.65 1.8 1.95 1.81 1.86 1.5
E. coli 1.86 1.8 1.74 1.62 1.51 1.66
L. monocytogene 1.15 1.96 - 1.23 1.48 1.39
P. kudriavzevii 1.36 1.4 1.19 1.37 1.33 1.22
S. aureus 1.21 1.37 1.21 1.12 1.41 1.26
S. saprophyticus 2.02 2.06 2.01 2.03 1.85 2.13
S. warneri 1.6 2.01 2.06 2.37 1.88 2.03
P. aeruginosa 1.57 1.81 1.65 1.36 1.74 1.61
바실러스 균주의 유해균 억제능 2
유해균 억제능 7 8 9 10 11 12
SRCM101274 SRCM101275 SRCM101276 SRCM101277 SRCM101278 SRCM101279
B. subtilis B. subtilis B. methylotrophicus B. subtilis B. methylotrophicus B. subtilis
B. cereus
(0607)		 1.46 1.45 1.76 1.49 1.55 1.92
B. cereus
(1016)		 1.74 1.29 1.57 1.61 1.92 1.4
E. coli 1.63 1.59 1.64 1.53 1.57 1.57
L. monocytogene - 1.41 - 1.22 1.11 1.37
P. kudriavzevii 1.26 1.27 1.35 1.24 1.17 1.28
S. aureus 1.28 1.41 1.3 - 1.35 1.26
S. saprophyticus 1.87 1.77 1.96 2.02 1.91 2.01
S. warneri 1.56 1.93 1.97 2.03 1.99 2.01
P. aeruginosa 1.57 1.75 1.76 1.6 1.7 1.87
바실러스 균주의 유해균 억제능 3
유해균 억제능 13 14 15 16 17 18
SRCM101281 SRCM101282 SRCM101283 SRCM101284 SRCM101285 SRCM101286
B. methylotrophicus B. methylotrophicus B. methylotrophicus B. methylotrophicus B. methylotrophicus B. subtilis
B. cereus
(0607)		 1.5 1.76 1.99 1.78 1.64 1.4
B. cereus
(1016)		 2.05 1.76 2.06 1.58 1.92 1.78
E. coli 1.61 1.83 1.62 1.72 1.6 1.65
L. monocytogene - - - - - -
P. kudriavzevii 1.24 1.2 1.26 1.12 1.18 1.4
S. aureus 1.32 1.15 1.24 1.39 1.44 1.14
S. saprophyticus 1.93 1.94 2.08 2.13 1.94 2.06
S. warneri 1.95 1.89 2.07 2.06 2.02 2.09
P. aeruginosa 1.53 1.84 1.74 1.62 1.64 1.43
바실러스 균주의 활성 비교
순번
균주번호
Identification		 아밀라아제 활성
 프로테아제 활성 글루타메이트(g/L) 바이오제닉 아민 분해율(%) γ-PGA(cm)
his tyr put cad
1 SRCM101338 B. amyloliquefaciens 2.13 1.82 0.636 7 7 9 10 2
2 SRCM101268 B. subtilis 2.34 1.90 0.423 8 9 4 4 5
3 SRCM101270 B. subtilis - 2.92 0.888 14 16 13 14 3
4 SRCM101271 B. methylotrophicus 1.91 2.60 0.176 3 4 2 6 10
5 SRCM101272 B. subtilis 1.48 2.14 0.391 3 4 4 6 8
6 SRCM101273 B. subtilis 2.83 2.90 1.106 18 17 14 17 20
7 SRCM101274 B. subtilis 4.37 2.31 0.701 1 8 -3 8 30
8 SRCM101275 B. subtilis 2.58 2.93 0.925 5 5 4 7 5
9 SRCM101276 B. methylotrophicus 1.97 1.48 1.118 17 17 18 21 5
10 SRCM101277 B. subtilis 1.92 1.36 0.649 3 45 35 6 0
11 SRCM101278 B. methylotrophicus 1.19 1.74 0.531 7 3 5 4 0
12 SRCM101279 B. subtilis 1.78 2.16 0.789 12 12 10 12 3
13 SRCM101281 B. methylotrophicus 1.51 1.45 0.958 -12 12 -9 3 20
14 SRCM101282 B. methylotrophicus 1.31 3.79 0.609 9 12 11 13 25
15 SRCM101283 B. methylotrophicus 1.53 1.54 0.462 9 19 8 16 20
16 SRCM101284 B. methylotrophicus - 1.59 0.4 2 64 40 15 5
17 SRCM101285 B. methylotrophicus 1.2 1.39 0.327 11 13 13 17 10
18 SRCM101286 B. subtilis 1.16 2.62 0.222 11 10 9 7 15
실시예 2: 곰팡이 균주 선별을 위한 보리 코지 제조
1. 실험방법
보리 코지를 제조하기 위하여 보유 중인 균주 중 업체에서 사용하고 있는 기존 균주에 비하여 전분분해 활성이 높은 균주 5주를 대상으로 보리 코지를 제조하여 실험에 이용하고자 하였다.
가. 원료 및 미생물
코지에 사용한 원료는 제주산 찰보리를 구입하여 사용하였으며, 균주는 진흥원에서 보유중인 균주 5주를 사용하였다. 미생물은 PDA 배지에 배양한 다음 멸균된 1% Tween 80% 용액에 포자를 현탁하였다. 이때 균주의 농도는 UV 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 400 nm에서 OD 값 0.8로 맞춰 이용하였다.
나. 균주별 보리 코지 제조
원료 보리를 수세한 다음 보리양과 1:1의 양의 물에 60분 동안 침지하여 물을 빼내고 121℃, 15분 동안 증자한 다음 약 40℃로 식힌 다음 보리 무게에 대하여 0.5%의 아스퍼질러스 오리재 각 균주별로 접종하고 30℃, 습도 80%를 유지하면서 48시간 동안 발효하였다.
다. 실험방법
(1) 수분
수분함량은 적외선 수분측정기(FD-720, kett, Japan)를 사용하여 0.1% 이하의 유의차를 항량으로 하여 측정하였다.
(2) α-아밀라아제 활성
조효소액 추출은 시료 10 g에 증류수 90 mL를 가하여 30℃, 150 rpm 진탕배양기(shaking incubator)에서 1시간 진탕하여 효소액을 추출하였다. α-아밀라아제 활성도는 효소액 1 mL에 pH 5.2 Buffer(0.2M Na2HPO4·12H2O+0.1M citric acid) 2 mL와 1% 전분 용액 2 mL를 첨가하여 40℃ 항온수조에서 반응시킨 후 반응액을 여과한 후 여액 1 mL를 취해 1N 초산 10 mL로 반응을 정지시키고 0.005% 요오드 용액 10 mL를 넣어 660 nm에서 흡광도를 측정하였고, 측정값을 (Blank-시료) × 1000 × 80 / (100-수분)으로 계산하여 unit로 표시하였다.
(3) 베타글루칸 함량 분석
베타글루칸 함량은 Megazyme β-glucan assay kit(K-BGLU, Megazyme International)를 이용하여 측정하였다. 시료는 100 메쉬 체로 거른 분쇄 시료 100 mg을 튜브에 넣어 0.2 mL 50% 에탄올을 넣고 20 mM 인산나트륨 버퍼 4 mL를 넣고 충분히 혼합하였다. 100℃에서 60초 동안 전 배양하고 혼합한 다음 100℃에서 2분간 배양하였다. 다시 혼합한 후 50℃에서 5분간 안정시킨 후 리케나아제(10 U) 0.2 mL를 넣고 50℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 200 mM 아세트산나트륨 버퍼 5 mL를 넣고 혼합한 후 5분간 원심분리한 후 상등액 0.1 mL를 세 개의 튜브에 각각 넣고 두 개의 튜브에는 0.1 m의 β-글루코시다아제(0.2 U, in 50 mM sodium acetate buffer)를 넣고 세 번째 튜브에는 50 mM 아세트산나트륨 버퍼 0.1 mL를 넣고 50℃에서 10분간 반응시켰다. GOPOD Reagent 3.0 mL를 각각 첨가한 후 50℃에서 20분간 반응시키고, 1시간 이내에 510 nm에서 흡광도를 측정한다.
2. 실험결과
(1) 수분 함량
상기 방법대로 균주 별로 제조한 보리 코지의 사진은 도 2와 같으며, 수분함량은 표 6과 같다. 6개 실험군의 전체적인 수분함량은 36.89~40.72% 범위로 측정되었으며, 평균값은 38.70%로 측정되었다.
아스퍼질러스 오리재 SRCM100271, SRCM100274, SRCM100276를 이용하여 제조한 보리 코지의 수분함량은 평균값보다 높게 측정되었으며, 아스퍼질러스 SRCM100280, SRCM100283, 충무발효 종균을 이용하여 제조한 코지의 수분함량은 평균값보다 낮게 측정되었다.
각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 수분함량
균주 수분함량(%)
Aspergillus oryzae SRCM100271 40.30
Aspergillus oryzae SRCM100274 38.91
Aspergillus oryzae SRCM100276 40.72
Aspergillus oryzae SRCM100280 37.04
Aspergillus oryzae SRCM100283 38.32
충무발효(주) 종균 36.89
평균 38.70
(3) α-아밀라아제 활성
각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 α-아밀라아제 활성은 아래 표 7과 같고, 활성은 410.69~2018.56 unit/g의 범위를 보여주었다. 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280을 이용하여 제조한 보리 코지의 활성이 2018.56 unit/g의 활성을 보여 가장 높은 값을 나타내었으며, 이는 충무 발효 종균을 이용한 보리 코지의 활성(1,490.43 unit/g) 보다 높은 활성을 보여주었다.
각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 α-아밀라아제 활성
균주 α-아밀라아제 활성(unit/g)
Aspergillus oryzae SRCM100271 1,451.39
Aspergillus oryzae SRCM100274 1,282.83
Aspergillus oryzae SRCM100276 1,028.61
Aspergillus oryzae SRCM100280 2,018.56
Aspergillus oryzae SRCM100283 410.69
충무발효(주) 종균 1,490.43
(4) 베타 글루칸 함량 분석
각 균주별 보리 코지를 제조하여 베타글루칸 함량을 측정한 결과는 표 8과 같고, 그 범위는 2.1228~5.3972%를 나타내었다. 그 중 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280으로 제조한 보리 코지가 가장 높은 함량을 나타내었고 이는 기존의 사용하고 있는 종균(충부발효) 보다도 높은 함량을 나타내었다. 또한, 아스퍼질러스 오리재 SRCM100274도 SRCM100280과 비슷한 수준을 보여주었다.
각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 β-글루칸 함량
균주 β-glucan 함량(%)
Aspergillus oryzae SRCM100271 2.8590
Aspergillus oryzae SRCM100274 5.1658
Aspergillus oryzae SRCM100276 4.4100
Aspergillus oryzae SRCM100280 5.3972
Aspergillus oryzae SRCM100283 2.1228
충무발효(주) 종균 3.1871
보리 코지에 사용할 최종 균주는 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280으로 선정되었으며, 한국미생물보존센터에 2016년 6월 21일자로 기탁하여(기탁번호: KCCM11846P), 이를 보리 코지의 주요 종균으로 이용하기로 하였다.
실시예 3: 한식된장 제조를 위한 바실러스 균주 선별
1. 실험방법
가. 제조방법
한식된장을 제조하기 위하여 바실러스 균주를 이용하여 콩알메주를 제조하고 이의 품질특성을 측정하여 균주를 선별하였다.
(1) 원료 및 미생물
콩알메주에 사용한 원료는 국산 백태를 구입하여 사용하였으며, 균주는 진흥원에서 보유중인 균주 6주를 사용하였다. 미생물은 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco) 배지에 1차 배양한 다음 TSB(Tryptic Soy Broth, Difco) 배지에 균주를 2 콜로니 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 사용하였다. 이때 균주의 농도는 UV 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 OD 값 0.6으로 맞춰 이용하였다.
(2) 콩알메주 제조
콩알메주를 제조하기 위하여 대두(국산)를 24시간 침지한 다음 121℃, 30분간 증자하여 40℃로 식힌 다음 대두 무게에 대하여 0.5%의 바실러스 속을 각 균주별로 접종하고 30℃, 습도 80%를 유지하면서 48시간 동안 발효하였다.
나. 실험방법
(1) AN(아미노산성 질소) 함량
AN 함량은 Formol 적정법에 준하여 실시하였다. 즉 시료 2 g을 취하여 증류수 100 mL를 가하고 1시간 동안 교반한 후 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.4까지 적정하였다. 여기에 중성 포르말린 용액 20 mL를 가하고 다시 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.4가 되도록 적정하였다.
(2) 글루타메이트(Glutamate) 함량 분석
글루타메이트(Glutamate) 함량은 글루타메이트 분석 키트(Bio vision)로 측정하였으며, 발효가 끝난 각 균주별 메주를 4500 rpm에서 15분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 상층액 50 ㎕를 96 웰 플레이트에 각각 분주하였다. 분석 버퍼(assay buffer) 90 ㎕, 글루타메이트 디벨로퍼(glutamate developer) 8 ㎕, 글루타메이트 효소믹스(glutamate enzyme Mix) 2 ㎕를 시료가 있는 웰(well)에 첨가하였고, 스텐다드 글루타메이트 웰(standard glutamate well)에도 첨가하였다. 이를 37℃에서 30분 동안 배양시킨 후 450 nm 마이크로 리더(Micro reader)에서 측정하였다.
글루타메이트 스텐다드 커브(Glutamate standard curve)를 위해서 1 mM 스텐다드 글루타메이트(standard Glutamate)를 준비하여 96 웰 플레이트에 1 mM 글루타메이트 0, 2, 4, 6, 8, 10 ㎕를 순서대로 첨가하였다. 웰 당 총 부피가 50 ㎕가 되도록 분석 버퍼를 첨가하였다.
2. 실험결과
(2) AN(아미노산성 질소) 함량
각 균주별로 제조한 낱알메주의 사진은 도 3과 같으며, 아미노산성 질소 함량을 측정한 결과는 표 9와 같다. 콩의 단백질은 발효가 되는 과정에서 미생물에 의해서 아미노산으로 분해가 되고 이러한 아미노산은 질소화합물 중 아미노산성 질소를 측정하여 발효 정도를 추측할 수 있다. 낱알메주를 제조하여 발효한 후 아미노산성 질소를 측정한 결과 바실러스 서브틸리스 SRCM101273이 787.37 mg%의 함량을 나타내어 가장 높은 값을 보여주었으며, 그 다음으로 바실러스 서브틸리스 SRCM101275, 바실러스 서브틸리스 SRCM101272 순으로 높은 함량을 나타내었다.
각 균주를 이용하여 제조한 낱알메주의 AN 함량
균주 AN 함량(mg%)
Bacillus subtilis SRCM101272 619.08
Bacillus subtilis SRCM101273 787.37
Bacillus subtilis SRCM101274 594.02
Bacillus subtilis SRCM101275 685.07
Bacillus subtilis SRCM101279 595.00
Bacillus subtilis SRCM101286 457.82
(3) 글루타메이트 함량 분석
글루타메이트는 식품의 감칠맛을 더해주는 성분으로서 많이 생성될수록 식품의 맛이 좋아지고, 발효과정에서 균이 단백질에 작용하여 생성되는 분해산물이다. 바실러스를 이용하여 낱알메주를 제조하여 글루타메이트 함량을 측정한 결과는 아래 표 10과 같다. 그 결과 균주별 측정했던 값과 유사한 흐름을 보였으며 그 범위는 0.544~1.364 g/L의 수치를 나타내었다. 바실러스 서브틸리스 SRCM101273가 가장 높은 값을 나타내었으며, 이는 AN 함량의 결과와 부합하는 결과를 보여주었다.
각 균주를 이용하여 제조한 낱알메주의 글루타메이트 함량
균주 글루타메이트 함량(g/L)
Bacillus subtilis SRCM101272 0.892
Bacillus subtilis SRCM101273 1.364
Bacillus subtilis SRCM101274 0.945
Bacillus subtilis SRCM101275 1.026
Bacillus subtilis SRCM101279 0.897
Bacillus subtilis SRCM101286 0.544
따라서 낱알메주용 바실러스는 높은 AN 함량과 글루타메이트 함량을 나타내는 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주로 선정하여, 한국미생물보존센터에 2016년 6월 21일자로 기탁하여(기탁번호: KCCM11847P), 본 발명의 보리된장 제조에 사용하여 품질 특성을 비교하였다.
실시예 4: 증자 대두와 보리 코지 혼합비율에 따른 품질특성
가. 증자 대두와 보리 코지의 혼합비율
증자 대두와 보리 코지의 비율을 결정하기 위하여 증자 대두, 보리 코지 혼합비율을 표 11과 같이 하였다. 이에 최종 염도가 10%가 되게 소금물을 첨가하여 숙성시켜 된장 숙성죽을 제조하였다.
증자대두와 보리 코지의 혼합비율
처리구 1 2 3
증자대두 1 1 1
보리 코지 1 1.5 2
위 숙성죽을 30℃에서 20일간 숙성시키면서 AN 함량, pH, 산도를 측정하여 혼합비율을 선정하기로 하였다. 이때 실험방법은 상기 방법과 동일한 방법으로 측정하였다.
(1) pH 및 산도
된장 숙성죽을 30℃에서 20일간 숙성하면서 5일 간격으로 샘플링하여 pH 및 산도를 측정한 결과는 도 4와 같다. pH는 숙성일수가 지날수록 낮아졌으며 산도는 반대의 결과를 보여주었다. pH가 1번 처리구는 5.97~5.42, 2번 처리구는 5.90~5.35, 3번 처리구는 5.80~5.20의 범위를 나타내었다. 산도는 1번 처리구가 1.26~1.95%, 2번 처리구는 1.33~2.12%, 3번 처리구가 1.73~2.27%의 범위를 나타내었다.
(2) 아미노산성 질소 함량
장류 발효 중 숙성도를 나타내는 지표로 아미노산성 질소 함량(AN)을 측정하는데 숙성 일수 별 된장 숙성죽의 AN 함량은 도 5와 같다. 3 처리구 중 3번 처리구가 숙성 일수 별 가장 높은 함량을 나타내었고 초기 90.27 mg%에서 숙성 20일째 269.78 mg%의 값을 보여주었다. 1번과 2번 처리구에 비해 3번 처리구는 코지의 함량이 가장 높고, 효소가 배출한 효소의 작용으로 단백질을 분해하여 아미노산성 질소 함량을 높인 것으로 사료된다. 자사의 기존 된장 숙성죽 200 mg% 이상 기준에 맞는 비율로 증자대두와 보리 코지의 비율을 1:2로 결정하였다.
실시예 5: 보리된장 제조
1. 실험방법
(1) 재료 및 방법
보리된장은 자사 기준의 된장 제조법에 기준하여 제조하기로 하였다. 토종균주를 이용하여 보리 코지(보리: 제주산)를 제조하고 121℃에서 30분간 증자하여 냉각한 대두를 2:1의 비율로 제조하였으며, 토종 바실러스를 이용한 콩알메주는 한식된장을 제조하여 된장의 제조에 이용하였다. 소금물(소금:정제염)은 된장의 최종염도가 10~11%가 되도록 염수를 제조하여 보리 코지와 증자 대두를 혼합하여 된장 숙성죽을 제조한 다음 30℃에서 20일간 숙성하였다. 숙성죽은 숙성기간별 5일 간격으로 샘플링하여 수분함량, pH 및 산도, 염도, 효소역가를 측정하였으며, 숙성이 끝난 숙성죽에 한식된장을 혼합하여 제조하였다. 최종 제조된 된장은 유기산, 유리당, 유리아미노산, 미생물학적 특성, 베타글루칸 함량을 측정하였다. 여기에 대조군으로 선정된 곰팡이 대신에 기존 자사에서 사용하는 균주를 이용하여 상기 동일한 방법으로 제조하여 준비하였다.
(2) 실험방법
된장 숙성죽에 대하여 일반성분, 효소역가를 측정하였으며, 완제품에 대하여 유기산 및 유리당, 유리 아미노산, 미생물학적 특성, 관능검사를 실시하였다.
(가) 일반성분
수분함량은 적외선 수분기(Kett)를 이용하여 측정하였다. pH 및 산도는 시료 5 g을 10배 희석하여 pH 미터(Mettler Toledo CH/MPC227, Switzerland)로 측정하였고 산도는 0.1N-NaOH를 가하여 pH 8.3이 될 때까지 적정하고, 이때 소비된 양을 젖산함량으로 환산하여 계산하였다. AN(아미노산성 질소) 함량은 상기 동일한 방법으로 분석하였다. 염도는 시료 10 g을 90 mL의 증류수를 넣어 균질화한 후, 염도계(TM-30D, Takemura, Japan)를 이용하여 측정하였다. 색도는 색차계(Colorimeter, Model CR-300, Minolta, Japan)를 사용하여 명도(L 값), 적색도(a 값, +:적색, -: 녹색), 황색도(b 값, -: 황색, +: 청색)로 나타내었다.
(나) 프로테아제 활성
효소액 0.5 mL에 0.1M 인산완충액(pH 6.2) 1 mL를 가한 다음, 기질용액(0.6% casein, pH 6.2)를 넣고 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응 후 0.44M TCA(trichloroacetic acid) 2.5 mL를 넣어 반응을 중지시키고 실온에서 10분간 방치한 다음 원심분리시켜 상등액 1 mL에 0.55M Na2CO3 용액 10 mL와 1 mL의 1N Folin & ciocalteus' reagent 용액을 넣어 37℃에서 30분간 발색시켜 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit는 1분 동안 티로신 1 g을 유리시키는 양을 환산하여 나타내었다.
(다) 유기산 및 유리당
유기산과 유리당의 분석은 시료 5 g에 증류수 45 mL를 가하여 1시간 동안 균질화 시킨 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터와 Sep-pak C18 cartridge(MeOH 2 mL, Water 2 mL 로 활성화)에 통과시킨 후 표 12의 분석조건으로 HPLC로 분석하였다.
유기산 및 유리당 HPLC 분석조건
Instument Agilent
Detector RID, DAD 210 nm
Column Aminex column HPX-87P(300×7.8 mm)
Temperature 50℃
Injection volume 20 ㎕
Flow rate 0.6 mL/min
Mobile phase 0.02N H2SO4
(라) 유리 아미노산
유리 아미노산은 시료 2 g을 취하여 3차 증류수 30 mL를 넣고 교반한 후 50 mL로 정용한 후 초음파를 이용하여 20분간 추출한 후 원심분리(3000 rpm, 10분)한 다음 상등액 2 mL에 5% TCA 2 mL를 넣은 후 원심분리(10,000 rpm, 10분)한 후 상등액을 취하여 0.02N-HCl로 희석한 후 0.2 ㎛ 실린지 필터에 통과시킨 후 아미노산분석기로 분석하였다.
(마) 미생물학적 특성분석
세균수, 진균수(곰팡이, 효모)는 시료 10 g을 멸균한 식염수에 넣어 교반한 후 희석해서 PetrifilmTM acrobic count, yeast and mold count(3M, USA)를 이용하여 측정하였다. 식중독 미생물 분석은 식품공전법에 준하여 실험을 실시하였다.
(바) 관능검사
보리된장의 기호도를 조사하기 위하여 관능평가 훈련을 받고, 다른 관능평가 실험에 참여한 경험이 있는 발효미생물산업진흥원 직원 10명과 토박이순창식품(주) 업체 직원 10명을 대상으로 색, 맛, 향 및 전체적 기호도를 5점 채점법으로 평가하였다. 평가는 아주 좋다(5점), 보통이다(3점), 아주 나쁘다(1점)으로 하였으며 각 패널의 채점평균을 각 시료의 관능검사 점수로 하였다.
2. 실험결과
(1) 일반성분
(가) 수분
보리된장 숙성죽의 수분 함량은 도 6과 같다. 수분함량은 초기 44.20~45.9%의 함량을 보이다가 점점 증가하여 숙성 20일째에는 48.00~48.23%의 함량을 나타내었다. 원료 자체의 수분함량과 숙성 기간 중 상대습도의 변화, 고형분의 분해 정도에 의해 수분함량이 달라지는 것으로 보고되고 있는데, 본 실험 결과 수분함량은 두 시료구간 큰 차이를 보이지는 않았다.
(나) pH 및 산도
숙성일수 별 균주별 보리된장 숙성죽의 pH 및 산도 변화는 도 7과 같다. pH와 산도의 변화는 반대의 결과를 보여주었으며, 숙성초기 6.01~6.02의 pH를 나타내다가 20일경엔 점점 낮아져 5.02~5.35의 수치를 나타내었다. 산도는 숙성초기 1.03~1.52%에서 점점 증가하여 숙성 20일경 1.94~2.35%의 수치를 나타내었다. 된장 숙성 중 pH의 저하는 다른 장류 발효식품에서도 나타나는 일반적인 현상으로 숙성 중 미생물의 작용으로 다양한 유기산 생성이 원인이라고 알려졌다.
(다) 염도
숙성일수 별 균주별 보리된장 숙성죽의 염도는 도 8과 같다. 염도는 숙성 초기 10.00~10.04%의 함량을 나타내다가 숙성 20일경 10.20~10.23%의 함량으로 거의 변화를 보이지 않았다. 숙성 20일경 염도가 조금 증가한 경향은 숙성기간 중 숙성 환경에 의해 일부 수분의 증발이 일어난 것으로 생각되나 염도의 변화는 크지 않았다.
(라) AN 함량
아미노산성 질소 함량(AN)은 된장의 숙성 정도를 나타내는 중요한 기준으로 콩 단백질이 미생물의 효소작용으로 가수분해되어 생성된다. 일반적으로 아미노산성 질소는 제조과정에서 대두 단백질의 변성도, 발효미생물의 생육과 효소 생성 조건 그리고 보관 및 숙성 등에 의해 차이가 나타나며, 함량이 높은 장류가 성분 면에서 좋은 것으로 평가된다. 본 기업에서는 된장 숙성죽의 숙성 종료 시점을 AN 함량 200 mg%이상으로 기준하고 있다. 균주를 달리하여 제조한 보리된장 숙성죽의 숙성일수별 AN 함량은 도 9와 같고, 제조 초기엔 30.78~45.69 mg%의 함량을 보이다가 숙성 20일째엔 250.62~320.82 mg%의 함량을 나타내었다. 선별된 균주(SRCM100280)를 이용한 된장 숙성죽이 20일째 320.82 mg%를 나타내어 기존 균주(충무)를 이용한 숙성죽에 비하여 높은 함량을 나타내었다.
(라) 색도
균주를 달리하여 제조한 보리된장 숙성죽의 숙성일수 별 색도의 변화는 표 13과 같다. 20일 숙성 시료의 명도 L 값은 31.31~37.13 수준으로 나타났고, 선별된 균주를 이용한 균주의 명도가 더 낮은 값을 나타내었다. 적색도를 나타내는 a값은 1번 시료는 숙성 10일째까지 증가하다가 다시 감소하는 경향을 나타냈으며, 2번 처리구는 5일째까지 증가하다가 다시 감소하는 경향을 보였다. 황색도를 나타내는 b값은 숙성 초기에 비하여 숙성 20일째 감소하는 경향을 나타내었다. 명도와 황색도는 단백질분해효소 역가와 상관관계가 있음을 보여주고 있는데 단백질 분해효소 역가가 높을수록 명도와 황색도가 더욱 낮아짐을 알 수 있었다. 이러한 결과는 단백질분해효소 작용으로 생성된 유리 아미노산과 생성된 유리당이 아미노카르보닐(aminocarbonyl) 반응을 통해 멜라노이딘(melanoidin)을 형성하게 되며, 된장의 색은 이러한 멜라노이딘에 의한 것으로 알려졌다.
숙성일수 별 균주별 보리된장 숙성죽의 색도
시료 Hunter 숙성일수
0 5 10 15 20
1 L 44.04 41.42 46.6 38.16 37.13
a 4.46 5.11 7.29 5.96 5.70
b 13.6 13.33 23.58 13.64 13.08
2 L 35.25 36.8 32.07 32.51 31.31
a 4.56 7.23 4.44 4.23 4.20
b 12.62 22.04 11.73 10.63 10.02
1: Aspergillus oryzae 충무, 2: Aspergillus oryzae SRCM100280
(2) 프로테아제 활성
보리된장 숙성죽의 프로테아제 활성은 도 10과 같다. 초기의 제조 시 8.62~12.64 unit/g으로 낮은 수준을 보이다가 숙성 10일부터 15일까지 급격히 증가하여 숙성 20일째에는 218.60~258.66 unit/g의 함량을 나타내었다. 프로테아제 활성은 선별된 균주로 제조한 숙성물이 더 높은 결과를 나타내었으며 이의 결과는 아미노산성 질소 함량과 같은 결과를 나타내었다.
(3) 유기산 및 유리당
균주별 보리된장 숙성죽의 유리당 및 유기산 함량은 표 14와 같다. 된장 중 유리당은 된장의 감미원으로 된장의 맛에 영향을 주는 조미원으로서 큰 영향을 준다고 보고되어 있다. 유리당의 함량을 살펴보면 원료에서 유래되는 것으로 볼 수 있으며 두 균주 별 된장 모두 글루코스가 주요 당으로 나타났으며, 말토오스는 선별된 균주를 이용하여 제조한 된장이 약 2배의 함량을 나타내었다. 원료나 숙성과정 중의 미생물 발효로 생성되는 유기산은 된장의 풍미형성에 필요한 성분이다. 분석된 유기산 중 구연산이 그 비중을 많이 차지하였는데 이는 원료인 콩에서 유래되는 것으로 판단된다.
균주별 보리된장 숙성죽의 유리당 및 유기산 함량
유리당 및 유기산 함량(%)
1 2

유리당
 Maltose 0.65 1.30
Glucose 33.41 36.14
Fructose 1.46 1.37

유기산

 Citric acid 0.37 0.35
Succinic acid 0.08 0.06
Lactic acid 0.17 0.11
Acetic acid 0.04 0.05
합계 36.18 39.38
1: Aspergillus oryzae 충무, 2: Aspergillus oryzae SRCM100280
(4) 유리 아미노산
균주별 보리된장의 유리아미노산 함량은 표 15와 같다. 아미노산 분석결과 글루탐산(glutamic acid) 함량이 가장 높은 것으로 나타났다. 총 유리 아미노산의 함량은 선정된 균주로 제조한 된장이 2356.79 mg%로 기존 균주로 제조한 된장의 함량(2066.81 mg%) 보다 높은 함량을 나타내었다. 일반적으로 된장의 맛은 유리 아미노산에 의해 좌우되며, 담금 원료, 숙성 온도, 숙성 기간에 따라 차이가 날 수 있고, 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)은 된장의 구수한 맛을 내는 성분으로 알려져 있으며, 류신(leucine)은 쓴맛에 영향을 줄 수 있다고 알려져 있다. 또한 GABA(γ-Amino-n-butyric acid)는 식품 중에 널리 분포하고 있으며, 인체에서 중추신경계 전달물질로 작용하며, 혈압상승억제, 혈중 콜레스테롤 및 중성지방의 억제, 뇌의 혈류개선 등 많은 약리적 효과가 알려져 의약품 원료로 사용되고 있다. 균주별 된장의 GABA 함량을 살펴보면 선정된 균주로 제조한 된장이 기존 균주로 제조한 된장에 비해 두 배 이상의 함량을 나타내었으며, 구수한 맛을 나타내는 글루탐산 역시 선별된 균주로 제조한 된장이 높은 함량을 나타내었다.
균주별 보리된장 숙성죽의 유리 아미노산 함량
번호 아미노산 함량(㎎%)
1 2
1 P-serine 20.98 13.08
2 Taurine 24.75 14.04
3 Phospho ethanol amine(PEA) 85.49 96.14
4 Aspartic acid 99.23 139.09
5 Threonine 51.67 53.64
6 Serine 67.61 91.28
7 Glutamic acid 415.80 469.00
8 Sarcosine 13.29 1.33
9 Proline 52.15 61.17
10 Glycine 89.58 100.41
11 Alanine 80.52 100.48
12 Citrulline 30.58 13.01
13 a-Aminobutyric Acid 15.37 4.53
14 Valine 70.63 83.76
15 Cystine 39.32 28.90
16 Methionine 39.58 34.48
17 Cystionine 11.61 5.00
18 Leucine 126.59 163.09
19 Tyrosine 73.66 83.41
20 Phenylalanine 94.46 116.52
21 b-Alanine 47.59 62.95
22 b-Aminoisobutyric Acid 24.01 19.80
23 r-Aminobutyric Acid 7.42 17.45
24 Ethanol amine 8.85 2.42
25 Ammonia 9.99 13.16
26 Lysine 216.26 320.09
27 Asparagine 94.86 88.26
28 Carnitine 39.07 16.60
29 Arginine 115.92 143.71
합계 2066.81 2356.79
1: Aspergillus oryzae 충무, 2: Aspergillus oryzae SRCM100280
(5) 미생물학적 특성
균주별 보리된장의 미생물학적 특성을 측정한 결과는 표 16과 같다. 식중독 미생물은 두 시료 모두 검출되지 않았으며, 일반세균수는 10.09~10.27 log10 CFU/g의 수치를 나타내었고 진균수는 4.12~4.68 log10(CFU/g)의 수치를 나타내었다. 장류의 위해 바실러스 세레우스는 0.78~1.52 log10(CFU/g)로 장류기준 규격인 4.0 log10(CFU/g) 이하로 검출되었다. 장류 생산 중 공정상 위생만 철저히 한다면 충분히 감소시킬 수 있을 것이라 사료된다.
균주별 보리된장 숙성죽의 미생물학적 특성
시료 일반세균수 진균수 B.C E. coli
Salmonella spp. E. coli
O157		 L. monocytogenes S. aureus Cl .
perfringens 		Vibrio
log10(CFU/g)
1 10.09 4.68 1.52 ND ND ND ND ND ND ND
2 10.27 4.12 0.78 ND ND ND ND ND ND ND
1: Aspergillus oryzae 충무, 2: Aspergillus oryzae SRCM100280
(6) 관능검사 결과
균주별 보리된장의 관능적 검사를 5점 채점법으로 조사한 결과는 표 17과 같다. 선별된 균주로 제조한 보리된장이 색, 맛, 향 등 전체적인 기호도가 우수한 것으로 나타났으며, 이 선별 균주를 이용 시 보리된장의 품질뿐만 아니라 소비자들의 기호도면에서도 적합하여 상품성이 높을 것으로 사료된다.
균주별 보리된장의 관능적 검사
관능항목 1 2
Color 3.90 4.11
Flavor 3.79 3.89
Taste 3.67 4.32
Overall 3.60 4.13
1: Aspergillus oryzae 충무, 2: Aspergillus oryzae SRCM100280
다. 결론
토착 발효미생물을 활용하여 보리 코지 및 한식된장을 제조하여 보리된장 제조에 이용한 결과 기존에 자사에서 사용하는 종균으로 제조한 보리된장에 비해 AN활성, 단백질분해력, 유리 아미노산 등의 함량이 높은 수치를 나타내었다. 이는 선별된 종균이 충분히 산업용 균주로의 적용 가능성이 있으며, 이를 활용 시 현재보다 풍부한 향미 및 맛을 기대할 수 있는 장류가 생산이 가능하게 되었다. 또한 균주를 이용한 보리 코지의 제조기술을 바탕으로 보리된장 제조기술이 확보되어 신제품 확보가 가능하게 되었다.
실시예 6: 한식된장 분석
대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 균주(KCCM11847P)를 첨가하여 발효한 후 소금을 첨가하여 숙성기간에 따른 한식된장의 품질을 분석한 결과는 하기 표 18과 같다. 그 결과, 숙성 90일째 아미노산성 질소 함량이 가장 높은 함량을 나타내었다.
한식된장 품질분석
품질항목
 숙성일수
0일 30일 60일 90일
pH 6.55 5.89 5.55 5.2
수분(%) 49.46 52.1 54.3 55.1
염도(%) 11.9 11.7 12.0 12.5
AN 함량(mg%) 250.27 320.6 459.6 534.1
실시예 7: 보리된장의 베타글루칸 함량
자사에서 생산하는 일반된장과 본 발명의 제조예 1의 보리된장의 베타글루칸 함량을 분석한 결과는 하기 표 19와 같다. 그 결과, 본 발명의 보리 된장은 일반된장에 비해 베타글루칸 함량이 약 5배 정도 증진됨을 확인할 수 있었다.
된장의 베타글루칸 함량
시료 β-글루칸 함량(%)
일반 된장 0.69
보리 된장 3.02
한국미생물보존센터(국외) KCCM11846P 20160621 한국미생물보존센터(국외) KCCM11847P 20160621

Claims (5)

  1. (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
    (b) 소맥분을 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계;
    (c) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계;
    (d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 혼합하는 단계;
    (e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계;
    (f) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주(기탁번호: KCCM11847P)를 첨가하여 발효한 후 소금을 첨가하여 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및
    (g) 상기 (e)단계의 숙성물 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장과 주정, 육수 및 메줏가루를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리된장의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
    (b) 소맥분을 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계;
    (c) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계;
    (d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 1.6~2.4:0.8~1.2 중량비율로 혼합하는 단계;
    (e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 28~32℃에서 16~24일 동안 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계;
    (f) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주(기탁번호: KCCM11847P)를 첨가하여 발효한 후 소금을 첨가하여 28~32℃에서 80~100일 동안 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및
    (g) 상기 (e)단계의 숙성물 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장과 주정, 육수 및 메줏가루를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리된장의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    (a) 보리에 물을 첨가하여 50~70분 동안 침지한 후 110~130℃에서 10~20분 동안 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 28~32℃에서 1~3일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
    (b) 소맥분을 110~130℃에서 5~15분 동안 증자한 후 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주(기탁번호: KCCM11846P)를 접종하고 28~32℃에서 1~3일 동안 발효하여 소맥분 코지를 제조하는 단계;
    (c) 대두에 물을 첨가하여 12~18시간 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각하여 증자 대두를 제조하는 단계;
    (d) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지와 상기 (b)단계의 제조한 소맥분 코지를 9~12:8~11 중량비율로 혼합한 혼합코지에 상기 (c)단계의 제조한 증자 대두를 1.6~2.4:0.8~1.2 중량비율로 혼합하는 단계;
    (e) 상기 (d)단계의 혼합한 혼합물에 소금물을 첨가하여 28~32℃에서 16~24일 동안 숙성시켜 숙성물을 획득하는 단계;
    (f) 대두에 물을 첨가하여 20~28시간 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101273 균주(기탁번호: KCCM11847P)를 첨가하여 28~32℃에서 1~3일 동안 발효한 후 소금을 첨가하여 28~32℃에서 80~100일 동안 숙성시켜 한식된장을 제조하는 단계; 및
    (g) 보리된장 100 중량부를 기준으로, 상기 (e)단계의 숙성물 79~85 중량부 및 상기 (f)단계의 제조한 한식된장 10~14 중량부와 주정 2~4 중량부, 육수 0.8~1.2 중량부 및 메줏가루 1.6~2.4 중량부를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리된장의 제조방법.
  5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 보리 된장.
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