KR101940277B1 - 기능성 균주를 이용한 보리 고추장의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 보리 고추장 - Google Patents

Abstract

본 발명은 (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계; (b) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효한 후 건조하여 메주를 제조하는 단계; (c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 혼합하여 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계; (d) 고춧가루, 소금, 마늘, 양파 및 물을 혼합한 후 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및 (e) 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념과 보릿가루, 고춧가루, 물엿, 주정 및 효모를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리 고추장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 보리 고추장에 관한 것이다.

Description

기능성 균주를 이용한 보리 고추장의 제조방법 및 상기 방법에 의해 제조된 보리 고추장{Method for producing barley red pepper paste using functional microorganism and barley red pepper paste produced by the same method}

본 발명은 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주를 이용하여 제조된 보리 코지와 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주를 이용하여 제조된 메주를 이용하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리 고추장의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 보리 고추장에 관한 것이다.

고추장은 간장, 된장과 예전부터 널리 애용되어 온 우리나라 고유의 전통 발효식품으로, 탄수화물에서 생성되는 당류의 단맛, 단백질에서 생성된 아미노산의 구수한 맛, 고춧가루의 매운맛, 그리고 소금의 짠맛 등이 잘 조화를 이루어 독특한 맛을 형성하는 복합 향신 조미료이다. 또한 된장과 간장에 비해 비타민 B1, B2, C 및 엽산(folic acid) 등이 다량 함유되어 있고, 미생물의 대사 및 발효작용으로 생성되는 유기산, 핵산, 알코올 및 색소 등의 미량성분이 맛, 향 및 색 등에 조화를 이루는 식품이다. 최근에는 소비자들의 식품 선택 시 식품의 관능적인 품질과 함께 기능성을 중시하는 경향으로 식생활 문화가 변화하고 있다. 그러한 변화를 반영하여 고추장에 다양한 식품을 첨가하여 풍미와 기능성을 동시에 향상시키려는 연구들이 보고되고 있다.

보리는 다른 작물에 비해 병해충이 심하지 않아 농약 살포가 거의 필요 없고, 일반 식생활에서 부족하기 쉬운 여러 가지 비타민, 무기질이 풍부하여 영양성분을 균형있게 섭취할 수 있는 좋은 식품소재이며, 겨울철 유휴지 이용, 국내 농업보호 측면에서도 재배의 중요성이 크게 인식되고 있다. 보리의 식이섬유 함량은 쌀에 비해 월등히 높을 뿐만 아니라 보리의 대표적 식이섬유인 β-글루칸(β-glucan)은 간에서 콜레스테롤 생성과 축적을 방지, 혈액 중의 콜레스테롤 수치 저하, 혈당증가 억제로 동맥경화 고혈압, 심장질환, 당뇨병 예방에 효과적이며, 변비와 비만 방지, 각종 질병에 대한 저항성을 증진시키는 효능이 있다고 알려져 있다.

한국등록특허 제1280455호에는 약초 고추장의 제조방법이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1110781호에는 건강증진에 도움이 되는 기능성 한방 고추장의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 기능성 균주를 이용한 보리 고추장의 제조방법과는 상이하다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 기능성 성분이 강화되면서 기호도가 우수한 보리 고추장을 제조하기 위해, 기능성 균주 선정, 코지 및 메주 제조조건과 배합비 및 숙성조건 등의 제조조건을 최적화하여, 영양성분이 강화되면서 기호도가 향상된 기능성 균주를 이용한 보리 고추장의 제조방법을 제공하는 데 있다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계; (b) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효한 후 건조하여 메주를 제조하는 단계; (c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 혼합하여 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계; (d) 고춧가루, 소금, 마늘, 양파 및 물을 혼합한 후 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및 (e) 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념과 보릿가루, 고춧가루, 물엿, 주정 및 효모를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리 고추장의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 보리 고추장을 제공한다.

본 발명의 방법으로 제조된 보리 고추장은 선정된 우수 발효 균주들을 통해 다른 균주들을 이용한 고추장에 비해 영양성분 및 품질이 우수할 뿐만 아니라, 고추장의 감칠맛 및 구수한 맛이 증진되어 기호도가 우수한 보리 고추장을 제공할 수 있다.

도 1은 본 발명의 보리 고추장의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 2는 아스퍼질러스 오리재 균주 종류를 달리하여 제조된 보리 코지 사진이다.
도 3은 보리 코지, 메주, 소금 및 물 혼합물의 숙성기간에 따른 수분 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 4는 보리 코지, 메주, 소금 및 물 혼합물의 숙성기간에 따른 pH 및 산도 변화를 비교한 그래프이다.
도 5는 보리 코지, 메주, 소금 및 물 혼합물의 숙성기간에 따른 염도 변화를 비교한 그래프이다.
도 6은 보리 코지, 메주, 소금 및 물 혼합물의 숙성기간에 따른 아미노산성 질소 함량 변화를 비교한 그래프이다.
도 3 내지 도 6의 충무발효(주)종균: 충무발효(주) 종균을 이용한 보리 코지, SRCM100280: 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주를 이용한 보리 코지, SRCM100687: 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주를 이용한 보리 코지를 포함하는 숙성물을 의미한다.
도 7은 균주 종류에 따른 보리고추장의 농도별 α-글루코시다아제 활성을 비교한 그래프이다.
도 8은 균주 종류에 따른 보리고추장의 농도별 DPPH 라디칼 소거능을 비교한 그래프이다.
도 9는 균주 종류에 따른 보리고추장의 농도별 SOD 유사 활성을 비교한 그래프이다.
도 7 내지 9의 충무발효(주): 충무발효(주) 종균을 이용한 보리 코지로 제조된 보리고추장, SRCM100280: 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주를 이용한 보리 코지로 제조된 보리고추장, SRCM100687: 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주를 이용한 보리 코지로 제조된 보리고추장을 의미한다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 균주를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;

(b) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 균주를 첨가하여 발효한 후 건조하여 메주를 제조하는 단계;

(c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 혼합하여 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계;

(d) 고춧가루, 소금, 마늘, 양파 및 물을 혼합한 후 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및

(e) 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념과 보릿가루, 고춧가루, 물엿, 주정 및 효모를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리 고추장의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 보리 고추장의 제조방법에서, 상기 (a)단계의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주는 바람직하게는 2017년 3월 14일자로 한국미생물보존센터에 기탁한 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주이다(기탁번호: KCCM11988P). 상기 기탁된 특정 균주로 보리 코지를 제조하는 것이 다른 균주를 사용하는 것에 비해 α-아밀라아제 활성이 높고, β-글루칸 함량이 높은 이점이 있다.

또한, 본 발명의 보리 고추장의 제조방법에서, 상기 (b)단계의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주는 바람직하게는 2018년 6월 28일자로 한국미생물보존센터에 기탁한 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주이다(기탁번호: KCCM12283P). 상기 특정 균주를 이용하여 제조된 메주는 아미노산성 질소 및 글루타메이트 함량이 높은 이점이 있다.

또한, 본 발명의 보리 고추장의 제조방법은, 보다 구체적으로는

(a) 보리에 물을 첨가하여 50~70분 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주(기탁번호: KCCM11988P)를 접종하고 28~40℃에서 1~3일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;

(b) 대두에 물을 첨가하여 20~28시간 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주(기탁번호: KCCM12283P)를 첨가하여 28~32℃에서 1~3일 동안 발효한 후 55~65℃에서 건조하여 메주를 제조하는 단계;

(c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 19~23:0.8~1.2:3.5~4.5:19~23 중량비율로 혼합하여 27~33℃에서 18~22일 동안 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계;

(d) 고추 양념 총 중량 기준으로, 고춧가루 36~44 중량%, 소금 13~17 중량%, 마늘 8~10 중량%, 양파 1.5~2.5 중량% 및 물 32~36 중량%를 혼합한 후 4~7℃에서 6~8일 동안 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및

(e) 보리 고추장 총 중량 기준으로, 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 44~49 중량% 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념 16~20 중량%와 보릿가루 2~2.6 중량%, 고춧가루 3.5~4.5 중량%, 물엿 24~28 중량%, 주정 2~3 중량% 및 효모 0.1~0.3 중량%를 혼합하는 단계를 포함할 수 있으며,

더욱 구체적으로는

(a) 보리에 물을 첨가하여 60분 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주(기탁번호: KCCM11988P)를 접종하고 38℃에서 2일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;

(b) 대두에 물을 첨가하여 24시간 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주(기탁번호: KCCM12283P)를 첨가하여 30℃에서 2일 동안 발효한 후 60℃에서 건조하여 메주를 제조하는 단계;

(c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 20.82:1.02:4.06:20.66 중량비율로 혼합하여 30℃에서 20일 동안 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계;

(d) 고추 양념 총 중량 기준으로, 고춧가루 40 중량%, 소금 15 중량%, 마늘 9 중량%, 양파 2 중량% 및 물 34 중량%를 혼합한 후 4~7℃에서 7일 동안 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및

(e) 보리 고추장 총 중량 기준으로, 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 46.56 중량% 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념 18.25 중량%와 보릿가루 2.3 중량%, 고춧가루 4.0 중량%, 물엿 26.19 중량%, 주정 2.5 중량% 및 효모 0.2 중량%를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 보리 고추장의 제조방법에서, 상기 (c) 내지 (e)단계의 재료 및 배합비로 제조된 고추장은 재료들의 맛과 향이 잘 어우러져 고추장의 매운맛, 짠맛, 구수한 맛 및 감칠맛이 잘 조화되어 풍미가 우수하여 기호도를 향상시킬 수 있었다.

또한, 본 발명의 보리 고추장의 제조방법에서, 상기 (c) 및 (e)단계의 조건으로 코지, 메주 및 염수를 혼합하여 먼저 숙성시킨 후 나머지 부재료를 혼합하는 것이 제조된 고추장의 아미노태 질소 함량이 200 mg% 이상을 나타내어 구수한 맛을 한층 더 높일 수 있고, 군내 및 이취는 나지 않으면서 재료들의 맛과 향이 한층 더 잘 어우러져 완성된 고추장에 더욱더 깊은맛을 줄 수 있었다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 보리 고추장을 제공한다.

이하, 본 발명의 제조예 및 실시예를 들어 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.

제조예 1: 보리 고추장 제조

(a) 제주산 찰보리에 물을 1:1 비율로 첨가하여 60분 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 40℃로 냉각하고, 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주(기탁번호: KCCM11988P)를 접종하고 38℃ 온도 및 습도 80%에서 2일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하였다.

(b) 대두에 물을 1:3 비율로 첨가하여 24시간 동안 침지한 후 121℃에서 30분 동안 증자하고 40℃로 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주(기탁번호: KCCM12283P)를 0.5% 첨가하여 30℃ 온도 및 80% 습도에서 2일 동안 발효한 후, 60℃에서 열풍 건조하여 메주를 제조하였다.

(c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 천일염 및 정제수를 20.82:1.02:4.06:20.66 중량비율로 혼합하여 30℃에서 20일 동안 숙성시켜 숙성물을 제조하였다.

(d) 고추 양념 총 중량 기준으로, 고춧가루 40 중량%, 소금 15 중량%, 마늘 9 중량%, 양파 2 중량% 및 물 34 중량%를 혼합한 후 4~7℃에서 7일 동안 숙성시켜 고추 양념을 제조하였다.

(e) 보리 고추장 총 중량 기준으로, 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 46.56 중량% 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념 18.25 중량%와 보릿가루 2.0 중량%, 볶은 보릿가루 0.3 중량%, 고춧가루 4.0 중량%, 물엿 26.19 중량%, 주정 2.5 중량% 및 효모 0.2 중량%를 혼합하여 보리 고추장을 제조하였다(도 1).

실시예 1: 곰팡이 균주 선별을 위한 보리 코지 제조

1. 실험방법

보리 코지를 제조하기 위하여 보유 중인 균주 중 업체에서 사용하고 있는 기존 균주에 비하여 전분분해 활성이 높은 균주 6주를 대상으로 보리 코지를 제조하여 실험에 이용하고자 하였다.

가. 원료 및 미생물

코지에 사용한 원료는 제주산 찰보리를 구입하여 사용하였으며, 균주는 진흥원에서 보유중인 균주 6주를 사용하였다. 미생물은 PDA 배지에 배양한 다음 멸균된 1% Tween 80% 용액에 포자를 현탁하였다. 이때 균주의 농도는 UV 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 400 nm에서 OD값 0.8로 맞춰 이용하였다.

나. 균주별 보리 코지 제조

원료 보리를 수세한 다음 보리에 물을 1:1 비율로 60분 동안 침지하여 물을 빼내고 121℃ 및 30분 동안 증자하고, 약 40℃로 식힌 다음 보리 무게에 대하여 0.5%의 아스퍼질러스 오리재 각 균주별로 접종하고 38℃ 및 습도 80%를 유지하면서 48시간 동안 발효하였다.

다. 실험방법

(1) 수분

수분함량은 적외선 수분측정기(FD-720, kett, Japan)를 사용하여 0.1% 이하의 유의차를 항량으로 하여 측정하였다.

(2) α-아밀라아제 활성

조효소액 추출은 시료 10 g에 증류수 90 mL를 가하여 30℃, 150 rpm 진탕배양기(shaking incubator)에서 1시간 진탕하여 효소액을 추출하였다. α-아밀라아제 활성도는 효소액 1 mL에 pH 5.2 Buffer(0.2M Na₂HPO₄·12H₂O+0.1M citric acid) 2 mL와 1% 전분 용액 2 mL를 첨가하여 40℃ 항온수조에서 반응시킨 후 반응액을 여과한 후 여액 1 mL를 취해 1N 초산 10 mL로 반응을 정지시키고 0.005% 요오드 용액 10 mL를 넣어 660 nm에서 흡광도를 측정하였고, 측정값을 (Blank-시료) × 1000 × 80 / (100-수분)으로 계산하여 unit로 표시하였다.

(3) 베타글루칸 함량 분석

베타글루칸 함량은 Megazyme β-glucan assay kit(K-BGLU, Megazyme International)를 이용하여 측정하였다. 시료는 100 메쉬 체로 거른 분쇄 시료 100 mg을 튜브에 넣어 0.2 mL 50% 에탄올을 넣고 20 mM 인산나트륨 버퍼 4 mL를 넣고 충분히 혼합하였다. 100℃에서 60초 동안 전 배양하고 혼합한 다음 100℃에서 2분간 배양하였다. 다시 혼합한 후 50℃에서 5분간 안정시킨 후 리케나아제(10 U) 0.2 mL를 넣고 50℃에서 1시간 반응시켰다. 반응이 끝난 후 200 mM 아세트산나트륨 버퍼 5 mL를 넣고 혼합한 후 5분간 원심분리한 후 상등액 0.1 mL를 세 개의 튜브에 각각 넣고 두 개의 튜브에는 0.1 m의 β-글루코시다아제(0.2 U, in 50 mM sodium acetate buffer)를 넣고 세 번째 튜브에는 50 mM 아세트산나트륨 버퍼 0.1 mL를 넣고 50℃에서 10분간 반응시켰다. GOPOD Reagent 3.0 mL를 각각 첨가한 후 50℃에서 20분간 반응시키고, 1시간 이내에 510 nm에서 흡광도를 측정하였다.

2. 실험결과

(1) 수분함량

상기 방법대로 균주 별로 제조한 보리 코지의 사진은 도 2와 같으며, 수분함량은 표 1과 같다. 7개 실험군의 전체적인 수분함량은 27.17~40.14% 범위로 측정되었고, 평균값은 35.54%로 측정되었다.

아스퍼질러스 오리재 SRCM100670, SRCM100685, SRCM100687, 충무발효 종균을 이용하여 제조한 보리 코지의 수분함량은 평균값보다 높게 측정되었으며, 아스퍼질러스 오리재 SRCM100675, SRCM100678, SRCM100280을 이용하여 제조한 코지의 수분함량은 평균값보다 낮게 측정되었다.

각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 수분함량

균주	수분함량(%)
Aspergillus oryzae SRCM100670	40.11
Aspergillus oryzae SRCM100675	31.76
Aspergillus oryzae SRCM100678	27.17
Aspergillus oryzae SRCM100685	39.30
Aspergillus oryzae SRCM100687	40.14
Aspergillus oryzae SRCM100280	30.43
충무발효(주) 종균	39.89
평균	35.54

(2) α-아밀라아제 활성

각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 α-아밀라아제 활성은 아래 표 2와 같고, 활성은 4,020.20~4,635.40 unit/g의 범위를 보여주었다. 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687을 이용하여 제조한 보리 코지의 활성이 4,635.40 unit/g의 활성을 보여 가장 높은 값을 나타내었으며, 이는 충무 발효 종균을 이용한 보리 코지의 활성(4,020.20 unit/g) 보다 높은 활성을 보여주었다.

각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 α-아밀라아제 활성

균주	α-아밀라아제 활성(unit/g)
Aspergillus oryzae SRCM100670	4,545.15
Aspergillus oryzae SRCM100675	4,510.90
Aspergillus oryzae SRCM100678	4,579.08
Aspergillus oryzae SRCM100685	4,612.58
Aspergillus oryzae SRCM100687	4,635.40
Aspergillus oryzae SRCM100280	4,612.62
충무발효(주) 종균	4,020.20

(3) 베타글루칸 함량 분석

각 균주별 보리 코지를 제조하여 베타글루칸 함량을 측정한 결과는 표 3과 같고, 그 범위는 3.8687~6.7156%를 나타내었다. 그 중 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687로 제조한 보리 코지가 가장 높은 함량을 나타내었고 이는 기존의 사용하고 있는 종균(충무발효) 보다도 높은 함량을 나타내었다.

각 균주를 이용하여 제조한 보리 코지의 β-글루칸 함량

균주	β-글루칸 함량(%)
Aspergillus oryzae SRCM100670	6.5174
Aspergillus oryzae SRCM100675	3.8687
Aspergillus oryzae SRCM100678	3.9376
Aspergillus oryzae SRCM100685	5.7189
Aspergillus oryzae SRCM100687	6.7156
Aspergillus oryzae SRCM100280	6.0698
충무발효(주) 종균	6.2468

상기 실험결과, 보리 코지에 사용할 최종 균주는 α-아밀라아제 활성 및 베타글루칸 함량이 높은 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687로 선정되었으며, 한국미생물보존센터에 2017년 3월 14일자로 기탁하여(기탁번호: KCCM11988P), 이를 보리 코지의 주요 종균으로 이용하기로 하였다.

실시예 2: 콩알메주 제조를 위한 바실러스 균주 선별

1. 실험방법

가. 제조방법

바실러스 균주를 이용하여 콩알메주를 제조하고 이의 품질특성을 측정하여 균주를 선별하였다.

(1) 원료 및 미생물

콩알메주에 사용한 원료는 국산 백태를 구입하여 사용하였으며, 균주는 진흥원에서 보유중인 균주 4주를 사용하였다. 미생물은 TSA(Tryptic Soy Agar, Difco) 배지에 1차 배양한 다음 TSB(Tryptic Soy Broth, Difco) 배지에 균주를 2 콜로니 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 사용하였다. 이때 균주의 농도는 UV 분광광도계를 이용하여 600 nm에서 OD 값 0.6으로 맞춰 이용하였다.

(2) 콩알메주 제조

콩알메주를 제조하기 위하여 대두(국산)를 24시간 침지한 다음 121℃ 및 30분간 증자하여 40℃로 식힌 다음 대두 무게에 대하여 0.5%의 바실러스 속을 각 균주별로 접종하고 30℃ 및 습도 80%를 유지하면서 48시간 동안 발효한 후 열풍건조하여 콩알메주를 제조하였다.

나. 실험방법

(1) AN(아미노산성 질소) 함량

AN 함량은 Formol 적정법에 준하여 실시하였다. 즉, 시료 2 g을 취하여 증류수 100 mL를 가하고 1시간 동안 교반한 후 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.4까지 적정하였다. 여기에 중성 포르말린 용액 20 mL를 가하고 다시 0.1N-NaOH 용액으로 pH 8.4가 되도록 적정하였다.

(2) 글루타메이트(Glutamate) 함량 분석

글루타메이트(Glutamate) 함량은 글루타메이트 분석 키트(Bio vision)로 측정하였으며, 발효가 끝난 각 균주별 메주를 4500 rpm에서 15분간 원심분리하여 균체를 제거한 후 상층액 50 ㎕를 96 웰 플레이트에 각각 분주하였다. 분석 버퍼(assay buffer) 90 ㎕, 글루타메이트 디벨로퍼(glutamate developer) 8 ㎕, 글루타메이트 효소믹스(glutamate enzyme Mix) 2 ㎕를 시료가 있는 웰(well)에 첨가하였고, 스텐다드 글루타메이트 웰(standard glutamate well)에도 첨가하였다. 이를 37℃에서 30분 동안 배양시킨 후 450 nm 마이크로 리더(Micro reader)에서 측정하였다.

글루타메이트 스텐다드 커브(Glutamate standard curve)를 위해서 1 mM 스텐다드 글루타메이트(standard Glutamate)를 준비하여 96 웰 플레이트에 1 mM 글루타메이트 0, 2, 4, 6, 8, 10 ㎕를 순서대로 첨가하였다. 웰 당 총 부피가 50 ㎕가 되도록 분석 버퍼를 첨가하였다.

2. 실험결과

(1) AN(아미노산성 질소) 함량

각 균주별로 제조한 콩알메주의 아미노산성 질소 함량을 측정한 결과는 표 4와 같다. 콩의 단백질은 발효가 되는 과정에서 미생물에 의해서 아미노산으로 분해가 되고 이러한 아미노산은 질소화합물 중 아미노산성 질소를 측정하여 발효 정도를 추측할 수 있다. 콩알메주를 제조하여 발효한 후 아미노산성 질소를 측정한 결과 바실러스 서브틸리스 2번 균주가 423.3 mg%의 함량을 나타내어 가장 높은 값을 보여주었다.

각 균주를 이용하여 제조한 콩알메주의 AN 함량

균주	AN 함량(mg%)
Bacillus subtilis 1	369.8
Bacillus subtilis 2	423.3
Bacillus subtilis 3	196.8
Bacillus subtilis 4	194.3

(2) 글루타메이트 함량 분석

글루타메이트는 식품의 감칠맛을 더해주는 성분으로서 많이 생성될수록 식품의 맛이 좋아지고, 발효과정에서 균이 단백질에 작용하여 생성되는 분해산물이다. 바실러스를 이용하여 콩알메주를 제조하여 글루타메이트 함량을 측정한 결과는 아래 표 5와 같다. 그 결과 범위는 3.12~25.31 ㎎/L의 수치를 나타내었고, 바실러스 서브틸리스 2번 균주가 가장 높은 값을 나타내었다.

각 균주를 이용하여 제조한 콩알메주의 글루타메이트 함량

균주	글루타메이트 함량(㎎/L)
Bacillus subtilis 1	23.37
Bacillus subtilis 2	25.31
Bacillus subtilis 3	3.12
Bacillus subtilis 4	6.11

따라서 콩알메주용 바실러스는 높은 AN 함량과 글루타메이트 함량을 나타내는 바실러스 서브틸리스 2번 균주로 이름은 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주이며, 한국미생물보존센터에 2018년 6월 28일자로 기탁하여(기탁번호: KCCM12283P), 본 발명의 보리 고추장 제조에 사용하여 품질 특성을 비교하였다.

실시예 3: 보리 고추장 제조

1. 실험방법

(1) 제조방법

보리 고추장은 자사 기준의 고추장 제조방법에 준하여 제조하기로 하였다. 보리코지는 상기 선별한 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687(KCCM11988P) 균주와 비교 균주로 아스퍼질러스 오리재 SRCM100280 균주, 충무발효 균주 3가지를 이용하여 제조하고 상기 선별된 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주(KCCM12283P)를 이용한 콩알메주는 고추장의 제조에 이용하였다. 보리코지, 콩알메주, 소금 및 물을 혼합한 혼합물을 30℃에서 20일간 숙성하였다. 숙성물은 숙성기간별 5일 간격으로 샘플링하여 수분함량, pH 및 산도, AN, 염도를 측정하였으며, 숙성이 끝난 숙성물에 부재료를 혼합하여 고추장을 제조하였다.

(2) 실험방법

고추장 숙성물에 대하여 일반성분을 측정하였으며, 부재료를 혼합한 완제품에 대하여 유기산 및 유리당, 유리 아미노산, 미생물학적 특성, α-글루코시다아제, 폴리페놀 및 항산화 활성과 관능검사를 실시하였다.

(가) 일반성분

수분함량은 적외선 수분기(Kett)를 이용하여 측정하였다. pH 및 산도는 시료 5 g을 10배 희석하여 pH 미터(Mettler Toledo CH/MPC227, Switzerland)로 측정하였고, 산도는 0.1N-NaOH를 가하여 pH 8.3이 될 때까지 적정하고, 이때 소비된 양을 젖산함량으로 환산하여 계산하였다. AN(아미노산성 질소) 함량은 상기 동일한 방법으로 분석하였다. 염도는 시료 10 g을 90 mL의 증류수를 넣어 균질화한 후, 염도계(TM-30D, Takemura, Japan)를 이용하여 측정하였다.

(나) 유기산 및 유리당

유기산과 유리당의 분석은 시료 5 g에 증류수 45 mL를 가하여 1시간 동안 균질화 시킨 후 0.45 ㎛ 멤브레인 필터와 Sep-pak C₁₈ cartridge(MeOH 2 mL, Water 2 mL 로 활성화)에 통과시킨 후 표 6의 분석조건으로 HPLC로 분석하였다.

유기산 및 유리당 HPLC 분석조건

Instument	Agilent
Detector	RID, DAD 210 nm
Column	Aminex column HPX-87P(300×7.8 mm)
Temperature	50℃
Injection volume	20 ㎕
Flow rate	0.6 mL/min
Mobile phase	0.02N H2SO4

(다) 유리 아미노산

유리 아미노산은 시료 2 g을 취하여 3차 증류수 30 mL를 넣고 교반한 후 50 mL로 정용한 후 초음파를 이용하여 20분간 추출한 후 원심분리(3000 rpm, 10분)한 다음 상등액 2 mL에 5% TCA 2 mL를 넣은 후 원심분리(10,000 rpm, 10분)한 후 상등액을 취하여 0.02N-HCl로 희석한 후 0.2 ㎛ 실린지 필터에 통과시킨 후 아미노산분석기로 분석하였다.

유리 아미노산 분석조건

Instument	Amino acid analysis(Hitachi L-8900)
Detector	UV/Vis (440 nm-570 nm)
Column	Hitachi 4.6×60 mm (speration) Hitachi 4.6×40 mm (Ammonia filtering)
Buffer flow rate	0.40 mL/min
Ninhydrin flow rate	0.35 mL/min
Temperature	50℃
Injection volume	20 ㎕
Mobile phase	Buffer set (PH-SET KANTO)

(라) 미생물학적 특성분석

세균수, 진균수(곰팡이, 효모)는 시료 10 g을 멸균한 식염수에 넣어 교반한 후 희석해서 Petrifilm^TM acrobic count, yeast and mold count(3M, USA)를 이용하여 측정하였다. 식중독 미생물 분석은 식품공전법에 준하여 실험을 실시하였다.

(마) α-글루코시다아제 저해활성

α-글루코시다아제(α-glucosidase) 저해활성 측정을 하기 위해 균주별 보리고추장에 증류수로 10배 희석하여 80℃에서 3시간 추출하여 원심분리한 후 상등액을 0.45 ㎛ 실린지 필터로 여과과정을 거쳐 시료로 사용하였다.

AGI(α-glucosidase inhibitory) 활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다. 즉, 시료 50 ㎕에 0.5 U/mL α-글루코시다아제 효소액 50 ㎕(in 0.1M PBS, pH 6.8)을 혼합하여 37℃에서 10분 동안 전배양하였다. 3 mM ρ-NPG(ρ-nitro-phenyl-α-glucopyranoside, in 0.1M PBS, pH 6.8) 100 ㎕를 가한 후 37℃에서 10분간 반응시킨 후 0.1M Na₂CO₃ 100 ㎕를 가하여 반응을 정지시켰다. 이때 생성된 ρ-니트로페놀의 양을 분광광도계(elisa reader, Infinite 200 TECAN)를 사용하여 흡광도 405 nm에서 측정하였다. 이때 무처리구(control)는 배양액 대신 0.1M PBS(pH 6.8)을 사용하였으며, blank로는 균주 배양액 및 효소액 대신 0.1M PBS(pH 6.8)을 사용하였다.

효소저해능(%) = (1 - 반응구의 ρ-니트로페놀 생성량/무처리구의 ρ-니트로페놀 생성량) × 100

(바) 총 페놀 함량

총 페놀 함량은 Folin-Denis 변법에 따라 추출된 시료를 농도별로 적절히 희석한 후 측정하였다. 각 농도별 시료 200 ㎕에 Folin-Ciocalteu 시약 12.5 ㎕를 혼합하여 교반한 뒤, 120분 동안 상온에서 방치하여 반응시켰다. 반응액의 흡광도 값은 UV-Vis 분광광도계(DU 800, Beckman coulter, Fullerton, CA, USA)를 사용하여 750 nm에서 분석하였다. 총 페놀 함량은 갈산(gallic acid)을 분석시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출 하였고, 총 폴리페놀 함량은 1 L 중의 mg gallic acid equivalent로 나타내었다.

(사) 항산화 활성

항산화 활성 측정을 하기 위해 균주별 보리고추장에 80% 에탄올로 10배 희석하여 상온에서 3시간 추출하여 원심분리한 후 상등액을 0.45 ㎛ 실린지 필터로 여과과정을 거쳐 시료로 사용하였고, 항산화 활성은 DPPH 라디칼 소거능 및 SOD 유사 활성으로 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거능은 DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 사용하여 라디칼에 대한 시료의 전자공여능(electron donating ability, EDA)을 측정하였다. 시료의 전자공여능 측정을 위해 일정 농도로 희석한 시료 50 ㎕에 0.15 mM DPPH 용액 250 ㎕를 넣고 30분간 암실에서 반응시킨 후 517 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 이를 시료 용액의 첨가구와 무첨가구의 흡광도 감소율을 백분율(%)로 표시하여 DPPH 라디칼 소거능으로 나타내었다.

SOD 유사 활성은 SOD determination Kit(Sigma, 19160)를 사용하여 측정하였다. 시료별 처리 후 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

(아) 관능검사

보리 고추장의 기호도를 조사하기 위하여 관능평가 훈련을 받고, 다른 관능평가 실험에 참여한 경험이 있는 발효미생물산업진흥원 직원 10명과 토박이순창식품(주) 업체 직원 10명을 대상으로 색, 맛, 향 및 전체적 기호도를 9점 채점법으로 평가하였다. 평가는 아주 좋다(9점), 보통이다(5점), 아주 나쁘다(1점)으로 하였다.

2. 실험결과

(1) 일반성분

(가) 수분

보리 고추장 숙성물의 수분 함량은 도 3과 같다. 수분함량은 숙성 10일까지 점점 증가하였고, 숙성 20일째에는 67.20~70.89%의 함량을 나타내었다. 원료 자체의 수분함량과 숙성 기간 중 상대습도의 변화, 고형분의 분해 정도에 의해 수분함량이 달라지는 것으로 보고되고 있는데, 본 실험 결과 수분함량은 시료 간의 큰 차이를 보이지 않았다.

(나) pH 및 산도

숙성일수 및 균주별 보리 고추장 숙성물의 pH 및 산도 변화는 도 4와 같다. pH와 산도의 변화는 반대의 결과를 보여주었으며, 숙성초기 5.10~5.46의 pH를 나타내다가 20일경엔 점점 낮아져 4.33~4.89의 수치를 나타내었다. 산도는 숙성초기 0.61~0.81%에서 점점 증가하여 숙성 20일경 0.90~1.49%의 수치를 나타내었다. 숙성 중 pH의 저하는 다른 장류 발효식품에서도 나타나는 일반적인 현상으로 숙성 중 미생물의 작용으로 다양한 유기산 생성이 원인이라고 알려졌다.

(다) 염도

숙성일수 및 균주별 보리 고추장 숙성물의 염도는 도 5와 같다. 염도는 숙성 초기 7.28~7.72%의 함량을 나타내다가 숙성 20일경 7.84~7.89%의 함량으로 거의 변화를 보이지 않았다. 숙성 20일경 염도가 조금 증가한 경향은 숙성기간 중 숙성 환경에 의해 일부 수분의 증발이 일어난 것으로 생각되나 염도의 변화는 크지 않았다.

(라) AN 함량

고추장의 단백질은 미생물이 발효하면서 분비하는 효소에 의하여 유리 아미노산으로 변하면서 구수한 맛을 나타낸다. 단백질이 유리 아미노산 형태로 어느 정도까지 분해되어 있는지를 신속하고 간접적으로 파악할 수 있는 수단으로 통상 장류공장에서는 아미노산성 질소를 측정한다. 본 기업에서는 고추장 숙성물의 숙성 종료 시점을 AN 함량 160 mg% 이상으로 기준하고 있다.

균주를 달리하여 제조한 보리 고추장 숙성물의 숙성일수별 AN 함량은 도 6과 같고, 제조 초기엔 44.10~173.3 mg%의 함량을 보이다가 숙성 20일째엔 162.80~239.30 mg%의 함량을 나타내었다. 선별된 균주(SRCM100687)를 이용한 고추장 숙성물이 20일째 239.30 mg%를 나타내어 기존 균주 및 충무발효 종균을 이용한 숙성물에 비하여 높은 함량을 나타내었다.

(2) 유기산 및 유리당

균주별 보리 고추장의 유리당 및 유기산 함량은 표 8과 같다. 고추장의 단맛은 발효미생물이 전분질을 가수분해하여 생성되는 유리당에서 유래한다. 고추장의 유리당은 글루코스가 주요 당으로 나타났으며, 말토오스의 함량도 높은 것으로 나타났다. 이 이유는 고추장 배합시 물엿 원료의 첨가로 사료된다. 원료나 숙성과정 중의 미생물 발효로 생성되는 유기산은 고추장의 풍미형성에 필요한 성분이다. 분석된 유기산 중 구연산이 그 비중을 많이 차지하였는데 이는 원료인 보리와 콩에서 유래되는 것으로 판단된다. 숙신산(succinic acid)은 보리나 콩의 원료에는 미량으로 존재하지만 미생물 대사작용이나 발효에 의해 생성되는 고추장의 주 유기산으로 추측된다. 유기산 및 유리당 함량 모두 SRCM100687 균주로 제조한 고추장이 가장 높은 함량을 보였다.

균주별 보리 고추장의 유리당 및 유기산 함량

유리당 및 유기산		함량(%)
		충무발효종균(주)	SRCM100280	SRCM100687
유리당	Maltose	10.29	4.60	9.40
	Glucose	11.52	17.40	19.91
	Fructose	0.50	0.40	0.70
유기산	Citric acid	0.39	0.30	0.70
	Succinic acid	0.33	0.29	0.37
	Acetic acid	0.18	0.20	0.40
합계		23.20	23.19	31.48

(3) 유리 아미노산

균주별 보리 고추장의 유리 아미노산 함량은 표 9와 같다. 아미노산 분석결과 글루탐산(glutamic acid) 함량이 가장 높은 것으로 나타났다. 총 유리 아미노산의 함량은 SRCM100687 균주로 제조한 고추장이 기존 균주로 제조한 고추장보다 높은 함량을 나타내었다. 일반적으로 고추장의 맛은 유리 아미노산에 의해 좌우되며, 담금 원료, 숙성 온도, 숙성 기간에 따라 차이가 날수 있고, 아스파르트산(aspartic acid), 글루탐산(glutamic acid)은 고추장의 감칠맛을 내는 성분으로 알려져 있으며, 단맛을 나타내는 알라닌(Alanine) 역시 SRCM100687 균주를 이용한 고추장이 가장 높은 함량을 보였다.

균주별 보리 고추장의 유리 아미노산 함량

번호	아미노산	함량(㎎%)
		충무발효	SRCM100280	SRCM100687
1	P-serine	15.73	12.03	13.88
2	Taurine	3.72	3.95	4.89
3	Aspartic acid	5.05	4.50	5.32
4	Threonine	114.70	88.56	123.52
5	Glutamic acid	381.57	349.95	398.79
6	Sarcosine	51.58	48.21	55.68
7	a-AAA	22.23	27.23	32.76
8	Glycine	86.10	58.38	84.97
9	Alanine	29.41	29.54	32.65
10	a-Aminobutyric Acid	5.99	4.98	3.74
11	Valine	58.05	47.58	65.41
12	Cystine	1.40	1.313	1.39
13	Methionine	34.06	31.44	37.63
14	Cystionine	74.45	68.61	79.82
15	Isoleucine	43.36	32.14	41.33
16	Leucine	52.65	43.78	51.66
17	Phenylalanine	10.81	16.53	21.09
18	g-Aminoisobutyric Acid	36.26	36.49	28.56
19	EOHNH2	1.56	2.55	2.80
20	NH3	21.87	17.56	24.54
21	Ornithine	2.91	4.42	19.44
22	Lysine	-	68.60	94.19
23	Histidine	18.18	15.40	23.25
24	Arginine	25.42	-	66.60
25	Hypro	33.16	30.79	34.23
26	pro	230.05	206.20	150.09
합계		1,360.27	1,250.72	1,498.21

(4) 미생물학적 특성

균주별 보리 고추장의 미생물학적 특성을 측정한 결과는 표 10과 같다. 식중독 미생물은 두 시료 모두 검출되지 않았으며, 일반세균수는 8.19~10.27 log10 CFU/g의 수치를 나타내었고 진균수는 3.34~4.16 log10(CFU/g)의 수치를 나타내었다. 장류의 바실러스 세레우스는 1.58~1.64 log10(CFU/g)로 장류기준 규격인 4.0 log10(CFU/g) 이하로 검출되었다. 장류 생산 중 공정상 위생만 철저히 한다면 충분히 감소시킬 수 있을 것이라 사료된다.

균주별 보리 고추장의 미생물학적 특성

시료	일반 세균수	진균수	B. cereus	E. coli	Salmonella spp.	E. coli O157	L. monocytogene s	S. aureus	Cl. perfringens	Vibrio
	log10(CFU/g)
충무발효종균	8.19	3.34	1.63	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
SRCM 100280	10.27	3.34	1.64	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND
SRCM 100687	8.19	4.16	1.58	ND	ND	ND	ND	ND	ND	ND

ND: 검출되지 않음

(5) α-글루코시다아제 저해활성

장내 α-글루코시다아제는 탄수화물의 분해에 필수적으로 관여하는 효소로 아밀라아제에 의해 분해된 올리고당(oligosaccharide)이 포도당으로 분해되는데 관여하는 효소이다. 따라서 이 효소의 저해를 통해 탄수화물의 분해를 억제하여 포도당이 흡수되는 것을 지연시키면 결과적으로 식후 혈당을 조절할 수 있으므로 α-글루코시다아제 저해제는 인슐린 비의존성 당뇨병 개선에 효과적인 것으로 알려져 있다.

균주별 보리고추장의 α-글루코시다아제 저해활성을 측정한 결과는 도 7과 같다. 그 결과, SRCM100687 균주를 이용한 고추장이 시료농도 100 ㎕/mL일 때 59.22%의 활성으로 가장 높게 나타났다.

(6) 총 폴리페놀 함량

균주별 보리고추장의 총 폴리페놀 함량은 표 11과 같다. 그 결과, SRCM100687 균주를 이용한 고추장이 시료농도 100 ㎕/mL일 때 44.99 mg/L의 함량으로 가장 높은 함량을 나타내었다.

균주별 보리고추장의 폴리페놀 함량(Unit: mg/L)

농도	10 ㎕/mL	100 ㎕/mL
충무발효(주)	0.64	40.62
SRCM100280	0.89	43.20
SRCM100687	0.92	44.99

(7) 항산화 활성

균주별 보리고추장의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 도 8과 같다. 그 결과, SRCM100687 균주를 이용한 보리고추장이 43.43%(100 ㎕/mL)로 가장 높은 활성을 보였으며, 고추장의 농도가 높을수록 DPPH 라디칼 소거능은 더 높은 경향을 나타내었다.

균주별 보리고추장의 SOD 유사 활성을 측정한 결과는 도 9와 같다. 그 결과, SRCM100687 균주를 이용한 보리고추장이 75.88%(100 ㎕/mL)로 가장 높은 활성을 보였으며, 고추장의 농도가 높을수록 SOD 유사 활성이 더 높은 경향을 나타내었다.

(8) 관능검사 결과

균주별 보리 고추장의 관능적 검사를 5점 채점법으로 조사한 결과는 표 12와 같다. 선별된 균주로 제조한 보리 고추장이 색, 맛, 향 등 전체적인 기호도가 우수한 것으로 나타났으며, 이 선별 균주를 이용 시 보리 고추장의 품질뿐만 아니라 소비자들의 기호도면에서도 적합하여 상품성이 높을 것으로 사료된다.

균주별 보리 고추장의 관능적 검사

관능항목	충무발효	SRCM100280	SRCM100687
색	6.44	6.32	6.56
향	6.53	6.00	5.83
맛	6.21	5.77	6.39
전체적 기호도	6.22	5.83	6.95

한국미생물보존센터(국외) KCCM11988P 20170314 한국미생물보존센터(국외) KCCM12283P 20180628

Claims (5)

1. (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주(기탁번호: KCCM11988P)를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
   (b) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주(기탁번호: KCCM12283P)를 첨가하여 발효한 후 건조하여 메주를 제조하는 단계;
   (c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 혼합하여 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계;
   (d) 고춧가루, 소금, 마늘, 양파 및 물을 혼합한 후 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및
   (e) 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념과 보릿가루, 고춧가루, 물엿, 주정 및 효모를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리 고추장의 제조방법.
2. 삭제
3. 제1항에 있어서,
   (a) 보리에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주(기탁번호: KCCM11988P)를 접종하고 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
   (b) 대두에 물을 첨가하여 침지한 후 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주(기탁번호: KCCM12283P)를 첨가하여 발효한 후 건조하여 메주를 제조하는 단계;
   (c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 19~23:0.8~1.2:3.5~4.5:19~23 중량비율로 혼합하여 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계;
   (d) 고추 양념 총 중량 기준으로, 고춧가루 36~44 중량%, 소금 13~17 중량%, 마늘 8~10 중량%, 양파 1.5~2.5 중량% 및 물 32~36 중량%를 혼합한 후 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및
   (e) 보리 고추장 총 중량 기준으로, 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 44~49 중량% 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념 16~20 중량%와 보릿가루 2~2.6 중량%, 고춧가루 3.5~4.5 중량%, 물엿 24~28 중량%, 주정 2~3 중량% 및 효모 0.1~0.3 중량%를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리 고추장의 제조방법.
4. 제3항에 있어서,
   (a) 보리에 물을 첨가하여 50~70분 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각하여 아스퍼질러스 오리재 SRCM100687 균주(기탁번호: KCCM11988P)를 접종하고 28~40℃에서 1~3일 동안 발효하여 보리 코지를 제조하는 단계;
   (b) 대두에 물을 첨가하여 20~28시간 동안 침지한 후 110~130℃에서 25~35분 동안 증자하고 냉각한 대두에 바실러스 서브틸리스 SRCM101362 균주(기탁번호: KCCM12283P)를 첨가하여 28~32℃에서 1~3일 동안 발효한 후 55~65℃에서 건조하여 메주를 제조하는 단계;
   (c) 상기 (a)단계의 제조한 보리 코지 및 상기 (b)단계의 제조한 메주와 소금 및 물을 19~23:0.8~1.2:3.5~4.5:19~23 중량비율로 혼합하여 27~33℃에서 18~22일 동안 숙성시켜 숙성물을 제조하는 단계;
   (d) 고추 양념 총 중량 기준으로, 고춧가루 36~44 중량%, 소금 13~17 중량%, 마늘 8~10 중량%, 양파 1.5~2.5 중량% 및 물 32~36 중량%를 혼합한 후 4~7℃에서 6~8일 동안 숙성시켜 고추 양념을 제조하는 단계; 및
   (e) 보리 고추장 총 중량 기준으로, 상기 (c)단계의 제조한 숙성물 44~49 중량% 및 상기 (d)단계의 제조한 고추 양념 16~20 중량%와 보릿가루 2~2.6 중량%, 고춧가루 3.5~4.5 중량%, 물엿 24~28 중량%, 주정 2~3 중량% 및 효모 0.1~0.3 중량%를 혼합하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 보리 고추장의 제조방법.
5. 제1항, 제3항, 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 보리 고추장.

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