KR101444614B1

KR101444614B1 - 세리포리아 락세라타 및 젖산균의 혼합배양을 통한 ｇａｂａ가 증진된 발효물 제조방법

Info

Publication number: KR101444614B1
Application number: KR1020130091537A
Authority: KR
Inventors: 이삼빈; 이은지; 김지은
Original assignee: 계명대학교 산학협력단
Priority date: 2013-08-01
Filing date: 2013-08-01
Publication date: 2014-09-26

Abstract

본 발명은 세리포리아 락세라타 및 젖산균의 혼합배양을 통하여 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata) 균사체를 미강(rice bran)이 함유된 배지에 배양하는 단계; 젖산 발효를 위한 젖산균 스타터를 준비하는 단계; 및 상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에 상기 젖산균 스타터를 접종하고 배양하는 젖산 발효 단계를 포함하는 타이로신(tyrosine) 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효물 제조방법에 관한 것이다. 또한 상기의 방법에 의해 제조된 기능성 발효물은 식품 및 기능성 식품, 화장품, 사료 소재로 이용할 수 있다.

Description

세리포리아 락세라타 및 젖산균의 혼합배양을 통한 ＧＡＢＡ가 증진된 발효물 제조방법{Method for producing fermented material with high GABA by mixed culture of Ceriporia lacerata and Lactobacillus}

본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체 및 젖산균의 혼합배양을 통하여 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)는 구멍장이과 버섯으로 참나무나 적송에 부생하며 백색 부후균의 일종이다. 생태계에서 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 기타 다당류 및 글리세롤(glycerol) 등의 탄소원을 이용하기 위하여 리그닌(Lignin) 분해라는 공동대사를 수행하는 것으로 알려져 있다. 자실체는 완전 배착성이며 기주 위에 단단히 부착하여 넓게 퍼진다. 또한 자실층은 관공으로 형성되어 있고 백색이며 짙은 솔향을 발산한다.

버섯은 우수한 기능성 성분을 함유하고 있어서 자실체 뿐만 아니라 액체배양을 통한 균사체로도 식용 가능하여 식품 및 의약품으로 소재화하는 다양한 활용 방안이 제시되고 있다. 버섯의 자실체를 얻기 위해서는 배양기간에 오랜 시간이 소요되며, 무균화된 배양 시설과 공간이 필요하다. 최근 대부분의 버섯 종균은 액체배지에 함유된 영양성분을 이용한 생물전환을 통해서 다양한 생리활성 물질을 포함하는 균사체 배양이 가능하게 되었다. 그러나 세리포리아 버섯은 잘 알려져 있지 않아 종균을 이용한 액체배양에 대한 연구가 미비한 실정이다.

버섯의 균사체와 유용성분을 포함하는 액체 배양물을 대량으로 단기간에 생산하기 위해서는 배지 성분의 최적화 및 경제성이 있는 원료들의 사용이 요구된다. 버섯의 액체배양을 위한 영양성분으로 옥수수 침지액(corn steep liquor), 효모 추출물(yeast extract), 펩톤(peptone) 등의 부산물 유래 탄소원과 고가의 질소원 등이 사용되고 있다. 액체배양에 사용되는 원료 배지에 대한 대체소재로 현미에서 정백미로 도정과정에서 생기는 미강을 사용할 수 있다.

미강(rice bran)은 주로 종피와 씨눈으로 이루어져 지방질, 단백질, 필수지방산, 필수아미노산, 비타민, 식이섬유 및 미량원소가 풍부하게 들어있다. 미강의 주요 함유 비타민은 B군으로 비타민 E도 소량 함유하고 있으며, 미량원소로는 인(P), 칼륨(K), 그리고 마그네슘(Mg)이며, 칼슘(Ca)도 어느 정도 함유하고 있는 것으로 알려져 있다. 미강에 들어있는 식이섬유는 세포벽을 구성하는 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴 물질, 리그닌 등으로, 이들 중 점성을 갖는 식이섬유, 오리자놀 및 피토스테롤(phytosterol)은 식이성 콜레스테롤 흡수 저해로 혈중 콜레스테롤 농도 상승을 억제시키는 동시에 간장 콜레스테롤의 축적 억제작용을 나타내는 것으로 알려져 있다.

그러나 미강은 지방 함량이 높아 변패되기 쉬운 문제점을 가지고 있어 국내의 경우 주로 미강의 산패와 관련된 연구와 미강유 토코페롤 또는 불포화지방산에 대한 연구가 주를 이루고 있으며, 미강의 화학적인 성분 및 주요 면역활성 다당성분으로 알려진 아라비노실란(arabinoxylan)의 약리작용에 대한 일부 보고가 있을 뿐, 면역기능과 그의 산업적 활용에 대한 연구결과는 거의 없는 실정으로 이들 유효성분의 연구와 소재화는 중요한 의의가 있다고 사료된다. 또한 미강으로부터 이러한 생리활성 성분들을 생산할 수 있는 미생물의 선정과 생산 최적화에 따른 발효기술 및 생체조절 활성성분에 대한 정확한 활성연구 및 스크리닝(screening) 기술, 물질의 분리 및 정제기술 등과 같이 미생물을 미강에 발효시켜 검토한 연구는 거의 없는 실정이다. 특히 미강 발효물 생리활성 물질의 구조와 기능의 상호관계를 밝히는 것은 천연물로부터의 유용성분 개발을 가능하게 할 수 있으나 기능성 물질의 본체규명과 구조결정기술, in vivo test, 독성실험, 활성성분의 작용기작 및 생체에서의 정확한 기능 파악이 어려워 이들을 이용한 기능성 식품의 개발 또는 의약품 제재로서의 응용에 큰 진전을 보지 못하고 있다. 따라서 사료나 비료 등의 저가치 물질로 이용되거나 농산 폐기물로 대부분 처리되는 미강에 생체에 대하여 다양한 생리기능을 수행하는 물질이 발견된다면, 이용가치의 향상을 가져올 수 있다고 판단된다.

오늘날에는 젖산균이 건강에 좋다는 인식이 확산되면서 젖산균을 이용한 산업이 다양해지고 이를 이용한 제품개발이 활발해지고 있으며, 젖산균을 기능성 식품에 사용하기 위하여 잠재력을 평가하기 위한 젖산균의 선발기준에 대한 연구가 전 세계적으로 광범위하게 진행되고 있다. 특히 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)을 생산하는 젖산균에 대한 관심이 높아지고 있다.

중추신경계의 대표적인 신경전달물질인 L-글루탐산(L-glutamic acid)은 신경세포 활성을 유도하는 물질로 알려져 있으며, 글루탐산 디카복실라제(glutamatic acid decarboxylase; GAD, EC 4. 1. 1. 15)의 작용을 받아 GABA로 전환된 것이다. 이 GABA는 1950년 Florey와 Robert에 의해 포유류의 뇌 추출액에서 처음 발견된 이래 연구가 활발하게 진행되고 있다. GABA는 혈류를 개선하며 뇌의 산소 공급을 증가시켜 뇌의 대사 촉진 및 뇌 기억을 증진시키며, 연수의 혈관 중추에 작용하여 항 이뇨 호르몬인 바소프레신의 분비를 억제하고, 혈관을 확장시켜 혈관을 낮추는 고혈압 저하 효과 및 신경 안정 효과 등의 생리활성 기능이 있다. 그 밖에도 성장호르몬의 분비 조절, 통증 완화, ACE 저해활성 등이 있어 생리학적으로 매우 유익한 물질이다.

GABA는 일명 피페린산(Piperic acid, C₁₂H₁₀O₄)으로 불리우며, 분자량은 103.12, 녹는점은 203℃로 물에 잘 녹는 물질이다. GABA는 혐기적으로 처리한 녹차, 발아시킨 쌀, 김치, red-mold rice, 치즈, 발효유 등 다양한 식품에 함유되어 있으나, 함량이 낮아 생리 작용을 나타내는 농도를 얻기 어렵다고 알려져 있다. 최근에는 발효 제법을 이용한 GABA의 생산이 연구되고 있으나, 아직은 수율이 낮은 형편이며, 합성 GABA의 경우 식욕 부진, 설사, 변비 등의 부작용이 보고되고 있다. 이러한 문제를 보완하기 위해 GABA 생산 능력이 있는 미생물을 탐색한 결과, 쌀, 콩, 김치의 발효 식품에서 분리한 젖산균이 매우 높은 GABA 생산 능력을 가지는 것이 밝혀졌다. 특히 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 등의 젖산균이 고농도의 GABA를 생산한다고 알려져 있다. 최근에는 GABA를 건강기능성 식품소재로 이용할 목적으로 GABA를 첨가한 식품이나 음료가 개발되어 판매되고 있으나, 미생물에 의해 생성된 GABA를 식품에 적용한 연구는 거의 없다.

따라서 본 발명자들은 식품에 주로 응용되어 왔던 미생물 및 미강을 이용하여 세리포리아 락세라타 버섯 종균의 액체배양을 통해서 버섯 균사체 생산을 최적화하고 화학적 특성을 분석하였다. 또한 세리포리아 배양액에 GABA를 생산하는 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종하여 2차 젖산발효를 통해 GABA 생산을 위한 최적 배양 조건을 확립하였다. 이에 따라 혼합 발효를 통한 세리포리아 락세라타 균사체 최적화 및 기능성 GABA의 대량 생산 개발 가능성을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

한편, 한국등록특허 제10-1031605호는 당뇨병 질환의 예방 및 치료를 위한 세리포리아 락세라타 배양액 추출물의 제조방법 및 이에 따른 세리포리아 락세라타 배양액 추출물에 대해 개시하고 있으나, 본원발명의 세리포리아 락세라타 배양액 및 락토바실러스 플랜타룸 균주의 혼합 배양을 통한 GABA 생산에 대한 언급은 어디에도 없다.

본 발명의 목적은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata) 균사체를 미강(rice bran)이 함유된 배지에 배양하고, 상기 배양액에 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종하여 젖산발효하는 단계를 포함하는 타이로신(tyrosine) 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 기능성 발효물을 제조하는데 의의가 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata) 균사체를 미강(rice bran)이 함유된 배지에 배양하는 단계; 젖산 발효를 위한 젖산균 스타터를 준비하는 단계; 및 상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에 상기 젖산균 스타터를 접종하고 배양하는 젖산 발효 단계를 포함하는 타이로신(tyrosine) 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효물 제조방법을 제공한다.

바람직하게는, 상기 젖산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)이지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용된 락토바실러스 플랜타럼(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P)는 김치에서 분리된 균주로서 한국식품과학연구원으로부터 분양받아 사용하였다.

상세하게는, 상기 미강은 전체 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에 대하여 0.1 내지 10 중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다.

상세하게는, 상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양 단계는 25 내지 30℃에서, 1일 내지 7일 동안 배양하는 것이고, 상기 젖산 발효 단계는 25 내지 30℃에서, 1일 내지 7일 동안 발효하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, "스타터(starter)"란 발효물을 제조하는 경우에 사용하는 미생물 배양액을 말한다. 따라서 스타터 미생물의 종류는 그 제품의 특성을 결정하게 되며 제품의 품질에 중요한 영향을 미친다. 미생물 중에서 스타터로 사용되고 있는 것은 박테리아, 곰팡이, 효모 등을 들 수 있으며, 이것을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "타이로신(Tyrosine)"은 단백질을 구성하는 20가지의 표준 아미노산 중 하나로서, 비필수아미노산인 동시에 방향족 아미노산이다. 뇌의 신경세포의 전달물질 중 중요한 도파민, 에피네프린, 노르에피네프린, 갑상선 호르몬, 피부의 멜라닌 성분의 생성에 필요한 성분으로 알려져 있다. 또한, 스트레스를 다스리고 집중력 향상에 효과가 있는 아미노산으로서, 우울증 및 치매 치료에 사용되기도 한다.

한편, 발효물의 펩타이드(peptide) 생성 정도를 측정하기 위하여 발효물 중에 존재하는 타이로신(tyrosine) 함량을 측정한 것이며, 상기 펩타이드가 타이로신으로 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 타이로신(tyrosine) 및 GABA가 증진된 발효물을 제공한다.

본 발명은 세리포리아 락세라타 균사체 및 젖산균의 혼합배양을 통하여 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효물을 제조하는 방법에 관한 것으로서, 혼합 배양 형태인 2단 발효를 수행함으로써 GABA, 타이로신과 같은 펩타이드 등을 포함하는 기능성 발효물을 제조함으로써, 이를 활용하여 기능성 음료 및 식품 개발의 가능성을 높일 수 있다.

도 1은 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 pH(A) 및 산도(B)를 측정한 결과이다.
도 2는 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 당도를 측정한 결과이다.
도 3은 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 균사체(A) 및 다당류(B) 함량을 측정한 결과이다.
도 4는 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 α-아밀라아제(α-amylase) 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 셀룰라아제(cellulase) 활성을 측정한 결과이다. 배양액은 7일 동안 발효하여 얻었다.
도 6은 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 환원당 함량을 측정한 결과이다.
도 7은 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 총당 함량을 페놀 황산(phenol sulfuric acid) 방법에 의해 측정한 결과이다.
도 8은 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서의 타이로신 함량을 측정한 결과이다.
도 9는 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액(CL) 및 젖산발효한 GRS 배지(GRS)에서의 pH(A) 및 산도(B)를 측정한 결과이다.
도 10은 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액(CL) 및 젖산발효한 GRS 배지(GRS)에서의 생균수를 측정한 결과이다.
도 11은 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액(CL) 및 젖산발효한 GRS 배지(GRS)에서의 타이로신 함량를 측정한 결과이다.
도 12는 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액(A) 및 젖산발효한 GRS 배지(B)에서의 TLC 분석 결과이다. (A) a 내지 d는 표준농도를 나타낸다. a: 2% 소듐 글루타메이트(sodium glutamate), b: 0.2% GABA, c: 0.5% GABA, d: 1% GABA. e-l은 젖산 발효 기간을 나타낸다(0 내지 7일). (B) a-d는 표준농도를 나타낸다. a: 2% 소듐 글루타메이트(sodium glutamate), b: 0.1% GABA, c: 0.2% GABA, d: 0.5% GABA. e 내지 l은 젖산 발효 기간을 나타낸다(0 내지 7일).
도 13은 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액(A) 및 젖산발효한 GRS 배지(B)에서의 SDS-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 분석 결과이다. SDS-PAGE는 농도구배 폴리아크릴아미드 젤(gradient polyacrylamide gel, 4-15%)에서 수행되었다. 샘플 로딩 농도는 15 μL이었다. Lane a; 단백질 분자량 마커: 10, 15, 25, 35, 40, 55, 70, 130, 170 kDa. Lane b; 1% 스킴 밀크 용액. Lane c 내지 j; 젖산 발효 기간(0 내지 7일).

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > 세리포리아 락세라타 균사체 배양

1. 사용균주

본 발명에 사용한 버섯 균주는 (주)월드바이오텍에서 분양받은 세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata)로 Potato Dextrose Agar (PDA; Difco. Co. Maryland, USA) 배지에 접종하여 25 ℃, pH 5.1±0.2, 암 조건에서 10일간 배양하여 사용하였다.

2. 세리포리아 락세라타 균사체 배양

세리포리아 락세라타 버섯 액체배양의 균사체 생산을 최적화하기 위해 성립된 배지 조성으로 글루코스(glucose) 3%(w/v), 대두분(soybean flour) 3%(w/v), MgSO₄ 0.15%(w/v)를 혼합하여 기본 배지로 사용하였으며, 미강(rice bran)을 0-10%(w/v)로 첨가하였다. 제조한 배지는 121℃에서 15분간 멸균하였고, 균주는 500 mL baffle flask에서 배양하였다. PDA 배지에서 배양된 세리포리아 락세라타 버섯 종균을 펀치(punch)를 이용하여 지름 1.5 cm로 절개한 후 첨가하여 액체 배양하였다. 배양 조건으로는 25℃에서 160 rpm으로 하여 7일간 배양한 후 화학적 특성을 평가하였다.

3. pH, 산도 및 당도 측정

pH는 배양액 10 mL을 취하여 pH meter (Digital pH meter 420A+, Thermo Orion. Beverly, MA, USA)를 이용하여 측정하였다. 적정 산도는 pH meter를 이용하여 배양액의 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1 N-NaOH로 적정하고, 그 소비량을 타르타르산(tartaric acid) 및 젖산(lactic acid) 함량(%, v/v)으로 환산하여 나타내었다. 당도는 전자굴절당도계(0-93 °Brix, Refractometer, ATAGO, Tokyo, Japan)를 이용하였다.

4. 균사체 및 다당류 함량 측정

세리포리아 락세라타 균사 배양액에 함유된 균사체와 세포외 다당체 함량을 측정하기 위해 배양액 200 mL씩 취하여 원심분리기를 이용하여 원심분리(10,000xg, 20 min)하여 침전물과 상등액으로 분리하였다. 침전물은 균사체 성분으로 증류수로 2회 세척하여 동결 건조하여 무게를 측정하였고, 상등액에 함유된 세포외 다당체를 분리하기 위하여 차가운 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)을 배양액 대비 2 volume 첨가하여 4℃에서 밤새도록(overnight) 두었다. 이소프로필 알콜(isopropyl alcohol)에 침전된 다당체는 원심분리(10,000xg, 20 min)하여 회수하여 동결 건조하여 무게를 측정하였다.

5. 결과

(1) 미강 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 pH, 산도 및 당도 변화

세리포리아 락세라타 균사체 액체배양의 생산을 최적화하기 위해 미강을 각각 0, 2.5, 5, 7.5, 10%를 첨가하여 7일 동안 배양하여 pH와 산도를 측정한 결과는 도 1과 같다. 미강을 첨가하지 않은 배양액에서 0, 7일 배양하였을 때, pH가 각각 5.9, 5.0으로 나타났으며, 미강 10% 첨가한 배양액에서 0, 7일 배양하였을 때는 각각 6.11, 5.78로 나타났다(도 1A). 미강 5%를 첨가한 배양액에 7일간 배양하여 산도를 측정한 결과, 배양 전 0.27%, 7일 배양 0.63%로 증가하는 경향이 나타났다(도 1B). 또한 미강 10%를 첨가한 배양액에서 7일간 배양 후 산도의 변화는 배양 전 0.3%, 7일 배양 0.7%로 증가하였다. 배양 기간이 지속될수록 pH는 감소하고, 산도는 증가하는 경향을 보였으며, 첨가하는 미강의 농도에 따른 pH 변화에 큰 차이가 없었다.

당도는 미강 2.5%를 첨가한 배양액에 0, 7일간 배양 후 당 함량은 각각 5.9, 8.1 °Brix로 나타났다(도 2). 또한 미강 7.5%를 첨가한 배양액은 0, 7일 배양하였을 때 각각 8.1, 10.2 °Brix로 나타나 미강 첨가량의 증가와 배양 기간이 길어짐에 따라 당 함량이 증가하였다. 이는 세리포리아 락세라타 균사체 액체 배지로 사용한 글루코스(glucose), 대두분(soybean flour)와 미강에 함유된 당 함량이 높아 배양 기간 중 당이 수용액 상태로 용출되는 것으로 추측된다.

(2) 세리포리아 락세라타 배양액의 균사체 및 다당류 함량 변화

미강 첨가 농도에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 균사체 및 다당류 함량을 배양 기간에 따라 분석한 결과는 도 3과 같다. 균사체 함량은 미강 2.5% 첨가한 배양액에서 배양 1일째 2.2 g/L로 나타났고, 배양 3일째 6.2 g/L, 배양 7일째 8.2 g/L로 나타나 배양이 지속 될수록 균사체 함량이 증가하였다(도 3A). 또한 미강 7.5% 첨가한 배양액에서 배양 1일째부터 급격히 증가하여 배양 5일째 8.1 g/L, 배양 7일째 11.3 g/L로 나타났다. 미강 10%를 첨가한 배양액 역시 배양 1일째 4 g/L, 배양 3일째 7.5 g/L, 배양 5일째 10.9 g/L, 배양 7일째 13.4 g/L로 나타나 배양 기간에 따라서 균사체 함량이 매우 높았다.

다당류 함량은 미강 2.5% 첨가한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에서 배양 1일째 0.4 g/L, 배양 5일째 0.9 g/L, 배양 7일째 1.9 g/L로 배양 기간에 따라 다당류 함량이 증가하였다. 또한 미강 5% 첨가한 배양액은 배양 1일째 1.5 g/L, 배양 5일째 2.1 g/L로 나타났으며, 배양 7일 후에는 3 g/L로 증가하는 경향이 나타났다. 미강 10%을 첨가한 배양액에서도 배양 1일째 1.4 g/L로 나타났고, 배양 7일 후에는 3.6 g/L로 다당류 함량이 증가하였다.

(3) α-아밀라아제(α-Amylase) 가수분해효소 활성 변화

미강을 농도별로 첨가하여 배양한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 α-아밀라아제(α-amylase) 활성을 측정한 결과는 도 4와 같다. 미강을 첨가하지 않은 배양액은 배양 전에는 효소 활성이 나타나지 않았으나, 배양 3일째부터 효소활성이 차츰 증가하여 7일째 배양하였을 때 2.92 unit/mL로 나타났다. 미강 5%를 첨가하여 7일 배양 후 18.95 unit/mL로 가장 높은 활성을 보였다. 또한 미강 10%를 첨가하여 7일간 배양하였을 때 10.66 unit/mL로 나타났다. 미강을 첨가하는 농도가 높을수록 배양기간에 따라서 α-아밀라아제(α-amylase) 활성이 증가하는 경향이 나타났으며, 미강을 첨가한 농도 중에서 5%를 첨가하였을 때, 효소 활성이 가장 높게 나타나 이를 최적조건으로 선정하였다.

(4) 섬유소 분해 효소 활성 측정

미강을 농도별로 첨가하여 7일간 배양한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 섬유소 분해능을 알아보기 위해 카복시메틸 셀룰로오스 셀룰라아제(carboxymethyl cellulose cellulase; CMC) 활성을 측정한 결과는 도 5과 같다. 미강을 첨가하지 않은 배양액은 0.02%, 미강 2.5% 첨가한 배양액은 1.6%, 미강 7.5% 첨가한 배양액은 3.8%로 나타났으며, 미강 10% 첨가한 배양액은 3.47%로 나타났다. 7일간 배양한 경우, 미강 5% 첨가한 배양액이 4.1%의 셀룰라아제(cellulase) 활성을 나타내서 미강을 첨가하지 않은 배양액보다 상대적으로 가장 높은 셀룰라아제(cellulase) 활성을 나타냈다. 따라서 세리포리아 락세라타 버섯이 셀룰로오스의 분해에 관여하는 것으로 나타났으며, 첨가한 미강의 농도가 증가할수록 셀룰라아제(cellulase) 활성이 높았다. 이는 미강의 첨가가 세리포리아 락세라타의 셀룰라아제(cellulase) 활성에 시너지 효과를 주어 효소 활성이 증가하거나 효소 활성에 안정성을 높여준 것으로 사료된다.

(5) 환원당 및 총당의 함량 변화

미강 첨가량에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 환원당을 측정한 결과는 도 6와 같다. 미강을 첨가하는 농도가 높을수록 배양 기간에 따른 환원당 함량이 증가하는 경향이 나타났다. 첨가한 미강 농도 중에서 5%를 첨가하였을 때 환원당 함량이 배양 전 3%에서 7일 배양 후 4.53%로 가장 높게 나타났다. 이는 7일 배양한 미강 7.5% 첨가 배양액 3.94%, 미강 10% 첨가 배양액 4% 보다 더 높은 함량을 보였다. 환원당은 염기성 용액에서 알데하이드 또는 케톤을 형성하는 당의 일종으로 포도당, 과당, 엿당, 글리세르알데하이드 및 아라비노스 등이 여기에 속한다. 이러한 버섯 배양액 중의 환원당은 배지원료로 사용된 글루코스(glucose), 대두분(soybean flour)과 미강의 전분질이 세리포리아 락세라타에 의해 분해되어 환원당이 증가한 것으로 앞서 보고한 α-아밀라아제(α-amylase) 활성 및 셀룰라아제(cellulase) 활성 역시 미강 5% 첨가하였을 때, 활성이 가장 높게 나타난 것으로 이와 관련성이 있다고 사료된다.

총당은 세리포리아 락세라타 균사체 액체 배양을 7일간 하였을 때 감소하는 경향이 나타났다(도 7). 미강을 첨가하지 않은 배양액에서 배양 전 5.73%, 7일 배양 후에는 5.42%로 나타났고, 미강 5%를 첨가하여 배양하였을 때 배양 전 8.53%, 7일 배양 후에는 6.22%로 나타났다. 또한 미강 10%를 첨가한 배양액의 배양 전에는 10.48%, 7일 배양하였을 때는 10.14%로 나타나 미강 5%를 첨가하여 7일간 배양 후 총당 함량이 가장 크게 감소하였다. 이는 세리포리아 락세라타가 균사체 성장 시 배지의 원료로 사용된 글루코스(glucose), 대두분(soybean flour)과 미강을 이용하여 증식한 것으로 추측된다.

(6) 타이로신(Tyrosine) 함량 변화

미강 첨가량에 따른 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 펩타이드 함량을 간접적으로 측정하는 방법 중 하나인 타이로신(tyrosine) 함량을 측정한 결과는 도 8과 같다. 배양이 지속될수록 타이로신(tyrosine) 함량이 점차 증가하였으며, 미강을 첨가하는 농도가 높을수록 타이로신(tyrosine) 함량이 높았다. 미강을 첨가하지 않은 배양액에서는 배양 전 139.34 μg/mL, 7일 배양 후 552.46 μg/mL로 나타났으며, 미강 5% 첨가한 배양액에서는 배양 전 387.5 μg/mL, 7일 배양 후 792.8 μg/mL로 나타났다. 또한 미강 10% 첨가한 배양액에서도 배양을 하면서 타이로신(tyrosine) 함량이 서서히 증가하기 시작하여 배양 전 633.8 μg/mL, 배양 1일 후 641.64 μg/mL로 나타났고, 배양 3일부터 급격히 증가하여 배양 5일 후 813.45 μg/mL, 배양 7일 후 820.9 μg/mL로 나타나 함량이 가장 높았다. 따라서 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 배양 기간에 따라서 미강 첨가량이 높을수록 단백질 가수분해에 의한 펩타이드 생산이 많아진 것으로 확인되었다.

< 실시예 2 > 락토바실러스 플랜타룸 ( Lactobacillus plantarum ) K154 균주를 이용한 2차 젖산발효

1. 사용균주 및 젖산발효 조건

GABA를 생산하는 젖산균은 한국식품연구원에서 분양받은 김치에서 분리된 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154를 Lactobacilli MRS broth agar (Difco. Co. Maryland, USA) 배지에 접종하여 30 ℃, pH 6.5±0.2, 24시간 배양하여 사용하였다.

세리포리아 락세라타 1차 배양액을 이용하여 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주(기탁번호: KACC 91727P)를 접종하고 2차 젖산발효를 하였다. 젖산발효 조건으로는 버섯 배양액에 소듐 글루타메이트(sodium glutamate) 2% (w/v)와 스킴 밀크(skim milk) 5% (w/v)를 첨가하였고, MRS broth에 30 ℃에서 24시간 배양한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 스타터를 5% 접종한 후 30℃에서 7일간 배양하였다.

2. 생균수 측정

생균수는 2차 젖산발효한 배양액을 10⁴, 10⁵, 10⁶배로 단계별 희석하여 121℃에서 15분간 멸균한 MRS broth agar 배지에 20 도말한 후, 30℃ 항온배양기에서 24시간 배양한 생균수를 CFU (colony forming unit)/mL로 나타내었다.

3. GABA 및 유리아미노산 함량 분석

2차 젖산발효한 세리포리아 락세라타 배양액의 발효기간에 따른 글루타메이트(glutamate) 잔존량과 GABA 전환율을 TLC(Thin-layer chromatography) 분석을 통해 확인하였다.

TLC 전개는 사각 챔버(chamber) (30×25×10 cm)에서 수행하였고, 실리카겔(silica gel) TLC plate는 10×20 cm의 크기로 잘라서 사용하였다. 전개용매는 n-부틸 알콜(n-butyl alcohol) : 아세트산(acetic acid glacial) : 증류수(distilled water) (3:1:1 - v/v/v)로 혼합하여 실온에서 4시간 이상 포화시켜 사용하였다. 시료는 TLC plate의 끝에서 20 mm 되는 위치에 2 μL를 점적하였고, 시료 간격은 15 mm를 유지하였다. 1시간 이상 점적 후 TLC plate는 50 ℃ dry oven에서 5분간 건조시킨다. 건조된 TLC plate에 발색시약 0.2% 닌하이드린(ninhydrin)을 뿌리고, 100 ℃ dry oven에서 5분간 발색 시킨 후 GABA spot을 확인하였다.

세리포리아 락세라타 배양액의 젖산발효 기간에 따른 유리아미노산 함량을 측정하였다. 건조시킨 시료를 상온에서 30분간 페닐이소티오시아네이트(phenylisothiocyanate; PITC)로 유도체화 시켜 말린 후 A solvent로 녹인다. 원심분리한 상층액을 HPLC(Hewlett packard 1100 series)로 분석하였다.

4. SDS-PAGE 전기영동을 통한 단백질 분해 패턴 확인

2차 젖산발효한 세리포리아 락세라타 배양액의 발효기간에 따른 단백질 분해 패턴을 알아보기 위해 12% 소듐 도데실 폴리아크릴아미드 젤 전기영동(sodium dodecyl sulfate polyacylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE)을 수행하였다.

상기의 발효물을 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한 후, SDS-sample buffer (0.15 M Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 5% β-mercaptoethanol)에 녹인다. 100 ℃에서 5분간 가열하여 단백질의 변성을 유도한 후, 전기영동(Hofer Scientific Instruments, CA)을 실시하였다. Gel의 염색은 Commasie brilliant blue R-250 용액(0.05%, 메탄올(methanol) : 아세트산(acetic acid) : 물(water) = 15:10:65)을 사용하였으며, 표준 단백질은 10, 15, 25, 35, 40, 55, 70, 130, 170 kDa으로 조합되어 있는 마커(marker)를 사용하였다.

5. 결과

(1) 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 pH, 산도 및 생균수 변화

미강 5% 첨가하여 배양한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액 및 세리포리아 락세라타 균사체 배양에 사용된 기본 배지인 GRS [글루코스(glucose) 3%, 미강(rice bran) 5%, 대두분(soybean flour) 3%, MgSO₄ 0.15%) 배지에 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주를 접종하고, 소듐 글루타메이트(sodium glutamate) 2%와 스킴 밀크(skim milk) 5%를 첨가하여 7일간 젖산발효한 후 pH 및 산도를 측정한 결과는 도 9와 같다. 세리포리아 락세라타 균사체 1차 배양액을 이용한 2차 젖산발효물의 pH는 배양 1일째 급격히 감소하여 발효기간 동안 pH 4로 유지하는 경향을 보였다(도 9A). GRS 배지를 이용한 젖산발효물의 pH는 배양 전 5.83, 배양 1일째 4.78, 배양 5일째 4.09로 배양 기간에 따라서 서서히 감소하는 경향이 나타났다. 산도는 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 젖산발효물에서 배양 전에는 0.8%, 배양 1일째 3.4%로 나타나 급격히 증가하여 배양 4일째까지 유지하였으나 배양 5일째 3.2%로 나타나 조금 감소하는 경향이 나타났다(도 9B). GRS 배지의 젖산발효물은 배양 전 0.7%, 배양 1일째 1.27%, 배양 3일째 2.02%, 배양 5일째 2.37%, 배양 7일째는 2.73%로 나타난 것으로 배양기간이 지속될수록 증가하는 경향이 나타났다.

생균수는 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 이용하여 젖산발효를 하였을 때, 배양 1일째 9.74×10⁹으로 매우 높게 나타났으나 배양기간이 지속될수록 감소하는 경향을 보였다(도 10). GRS 배지를 이용하여 젖산발효를 하였을 때는 배양 1일 1.2×10⁹으로 나타났으며, 배양 7일간 생균수가 유지되는 것을 볼 수 있다.

(2) 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 타이로신(tyrosine) 함량 변화

세리포리아 락세라타 균사체 배양액 및 GRS 배지를 이용하여 7일간 젖산발효한 것을 비교하여 타이로신(tyrosine) 함량을 측정한 결과는 도 11과 같다. 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 타이로신(tyrosine) ?량은 배양 전 1065.9 μg/mL, 배양 3일째 1246.42 μg/mL, 배양 5일째 1403.26 μg/mL, 배양 7일째에는 1506.26 μg/mL로 나타나 배양기간이 지속될수록 증가하는 경향을 보였다. GRS 배지를 이용한 젖산발효물은 배양 전 407.68 μg/mL, 배양 3일째 422.42 μg/mL, 배양 5일째 433.08 μg/mL, 배양 7일째는 446.76 μg/mL으로 나타나 배양 기간에 따라서 서서히 증가하는 경향을 보였다. 그러나 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 이용한 젖산발효물보다는 그 함량이 매우 저조하였다. 따라서 세리포리아 락세라타 균사체 배양을 하지 않은 기본 배지인 GRS 배지를 이용하여 젖산발효를 한 경우보다 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 이용하여 젖산발효 시 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주의 단백질 가수분해에 시너지 효과를 주어 펩타이드 생산이 많아진 것으로 추측된다.

(3) 젖산발효물의 GABA 및 유리아미노산 함량 분석

일반 곡류에 존재하는 GABA 함량은 100 g당 일반미 1-40 mg, 현미 4-8 mg, 발아현미 10-100 mg, 녹차 32-205 mg, 뽕잎 56 mg으로 자연 상태에서의 식물체 GABA 함유량으로는 극히 적어 활용이 어려운 실정이라 연구가 활발히 이루어지지 않고 있다. 이의 해결을 위해 MSG를 GABA로 전환시키는 김치, 젓갈 등에 있는 젖산균을 비롯하여 락토바실러스(Lactobacillus)속과 락토코커스(Lactococcus)속 등의 유산균으로 사용한 연구결과 및 콩을 발효시켜 고농도 250-700 mg/100 g의 GABA를 생산한 연구결과에 따라 세리포리아 락세라타 균사체 1차 배양액에 젖산균의 생육과 GABA 생산을 높이기 위해 스킴 밀크(skim milk) 5%와 MSG 2%를 첨가하여 7일간 젖산발효한 배양액을 TLC를 이용하여 GABA 생성능을 분석하였으며, 이 때 세리포리아 락세라타 균사체 배양을 하지 않은 기본 배지인 GRS 배지를 이용한 젖산발효물과 함께 비교하였다.

TLC를 분석한 결과는 도 12에 나타내었다. 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 이용한 젖산발효물의 TLC를 분석한 결과 육안으로 볼 때, 젖산발효 기간이 지속될수록 MSG spot의 크기가 감소하고, GABA spot의 크기가 증가하는 것을 확인하였다(도 12A). 발효 전에 비해 1일간 배양했을 때 GABA spot이 생성되었으며, MSG가 소진되는 것을 볼 수 있다. 또한 2일간 배양했을 때부터 GABA spot이 점차 커지는 것을 볼 수 있으며, 7일간 배양했을 때는 MSG가 대부분 소진되며, GABA 함량이 1%이상 나타나는 것을 확인하였다. 이는 스킴 밀크(skim milk)를 첨가함으로써 젖산균 생육을 높일 수 있고, 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주의 산에 대한 내성 기작의 일환으로서 MSG로부터 글루타메이트 디카복실라제(glutamate decarboxylase; GAD) 효소의 촉매작용에 의해 비로소 GABA 생산이 월등히 높은 것으로 사료된다. 그러나 GRS 배지를 이용한 젖산발효물의 TLC를 분석한 결과, 7일간 배양한 모든 시료에서 MSG를 이용한 GABA spot이 모두 생성되지 않았다(도 12B).

7일간 젖산발효한 세리포리아 락세라타 균사체 배양액의 유리아미노산 성분을 분석한 결과는 표 1과 같다. 글루타메이트(Glutamate) 함량에서 배양 전 14853.36 μg/mL, 배양 1일째 13871.77 μg/mL, 배양 3일째 6448.35 μg/mL로 나타났으며, 7일간 배양하였을 때는 2669.26 μg/mL으로 나타나 배양기간이 지속될수록 점차 감소하여 글루타메이트(glutamate)가 대부분 소진된 것을 확인하였다. GABA 함량에서는 배양 전 65.67 μg/mL, 배양 1일째 3503.43 μg/mL로 나타나 급격히 증가하여 배양 3일째 11522.25 μg/mL로 나타났으며, 7일간 배양하였을 때는 15534.04 μg/mL로 나타났다. 이로써 MSG 2%를 첨가한 것으로부터 GABA 함량이 1.5% 이상 월등히 생성된 것으로 나타났다. 따라서 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 이용하여 젖산발효를 하였을 때 GABA 생산에 매우 유리한 것으로 사료된다. 또한 배양기간이 지속될수록 젖산발효 시 유리되는 총 아미노산 함량이 배양 전에는 18982.24 μg/mL, 배양 1일째 21510.97 μg/mL, 배양 3일째 24097.88 μg/mL으로 나타났으며 7일간 배양하였을 때는 25549.74 μg/mL으로 나타나 증가하는 경향을 보였다.

< 표 1 >

(4) SDS-PAGE 전기영동을 통한 단백질 분해 패턴 확인

세리포리아 락세라타 균사체 배양액 및 GRS 배지를 이용한 젖산발효에 있어서, 젖산발효 기간에 따른 단백질의 가수분해 정도를 확인하기 위해 농도 구배 폴리아크릴아미드 젤(gradient polyacrylamide gel, 4-15%)에서 밴드를 확인하였다(도 13). 세리포리아 락세라타 균사체 배양액을 이용한 젖산발효물의 단백질 가수분해를 확인한 결과, 발효 전에는 10-25 kDa 사이의 밴드가 진하게 나타났으나, 1일 발효하였을 때 큰 분자 단백질의 가수분해가 시작되었으며, 저분자 밴드가 진하게 보이기 시작하였다(도 13A). 발효 2일부터는 발효 전에 존재하는 단백질이 모두 가수분해되는 것을 볼 수 있다. 또한 발효 2일째 40 kDa 밴드가 생성되며, 발효기간이 지속될수록 밴드가 진하게 나타나는 것을 볼 수 있다. GRS 배지를 이용한 젖산발효물의 단백질 가수분해를 확인한 결과 발효 전에 존재하는 스킴 밀크(skim milk)에 함유된 카제인(casein) 밴드가 발효 1일부터 서서히 가수분해되기 시작하였다(도 13B).

Claims

세리포리아 락세라타(Ceriporia lacerata) 균사체를 미강(rice bran)이 함유된 배지에 배양하는 단계;
젖산 발효를 위한 젖산균 스타터를 준비하는 단계; 및
상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에 상기 젖산균 스타터를 접종하고 배양하는 젖산 발효 단계를 포함하는 타이로신(tyrosine) 및 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 미강은 전체 세리포리아 락세라타 균사체 배양액에 대하여 0.1 내지 10 중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 타이로신(tyrosine) 및 GABA가 증진된 발효물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 젖산균은 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P)인 것을 특징으로 하는 타이로신(tyrosine) 및 GABA가 증진된 발효물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 세리포리아 락세라타 균사체 배양 단계는 25 내지 30℃에서, 1일 내지 7일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 타이로신(tyrosine) 및 GABA가 증진된 발효물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 젖산 발효 단계는 25 내지 30℃에서, 1일 내지 7일 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 타이로신(tyrosine) 및 GABA가 증진된 발효물 제조방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 방법에 의해 제조된 타이로신(tyrosine) 및 GABA가 증진된 발효물.