CN105962343A - 一种猕猴桃酵素及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制备方法，该配方以新鲜猕猴桃为原料，清洗去毛后保留果皮进行打浆，加入复合酶制剂（包括果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶）对猕猴桃浆进行酶解，以提高出汁率及生产效率，然后采用多菌株共生发酵技术及分级接种工艺，依次接入酵母菌、醋酸菌、乳酸菌对产品进行发酵、陈酿。最后通过硅藻土过滤、膜过滤等工艺以达到除菌目的，终止产品继续发酵，保证货架期稳定，同时最大限度保持活性成分及酶的活性。该法制得的酵素具有高抗氧化活性、酶类丰富、酶活高的特征。外观澄澈透明，风味酸甜柔和、果香清雅。
Description
技术领域
本发明涉及一种酵素的加工生产方法，属于发酵制品加工领域。
背景技术
酵素又称为酶, 是生物体中所产生的具有催化作用的活性大分子。生物体内的各种生理生化反应, 几乎都要在酵素的催化作用下进行, 人体的新陈代谢、能量摄取、成长和繁殖等生命现象,都必须通过酵素的帮助才能完成。
猕猴桃是一种高级的营养保健水果,含有大量抗衰老物质、多种氨基酸、矿物质、猕猴桃碱活性物质和维生素等，其VC含量达200mg/100g以上，是“果中之王”。猕猴桃酵素是以新鲜猕猴桃浆为原料, 经多菌株分级共生发酵而产生的, 其代谢产物中含有丰富的超氧化歧化酶、蛋白酶、多酚类物质、有机酸等活性成分，具有抗氧化、消炎抗菌、提高体液免疫、美容养颜、促进新陈代谢等功效。
目前市场上酵素种类繁多，如水果酵素、蔬菜酵素、综合酵素等，但制作工艺大致相同。各类酵素依靠原材料表面携带的微生物或人为添加菌种，在发酵过程中繁殖形成一定菌落结构、初级和次生代谢产物，其代谢产物中由于含有多种类、高活性的酶类而具有相应功效。但市售酵素多为常温储藏，为了保证货架期产品未定，通常在产品出厂前需有灭菌环节以终止发酵，常见灭菌方式为巴氏杀菌、UHT（高温瞬时杀菌）等，经杀菌后的产品，其酶活大部分或者几乎全部丧失，同时也失去了其相应功效，因此，市售酵素实则多为发酵液或者发酵调配饮料。但酵素产品若不杀菌，产品后期稳定性则无法控制，或只能通过冷链进行销售，但冷链产品生命周期短，实现难度较大。
发明内容
针对以上问题，本发明的目的是提供一种不需巴氏以及UHT（高温瞬时杀菌）杀菌，同时具有高抗氧化活性、酶类丰富、酶活高、稳定性高的猕猴桃酵素及制备方法，该配方以新鲜猕猴桃为原料，清洗去毛后保留果皮进行打浆，加入复合酶制剂（包括果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶）对猕猴桃浆进行酶解，以提高出汁率及生产效率，然后采用多菌株共生发酵技术及分级接种工艺，依次接入酵母菌、醋酸菌、乳酸菌对产品进行发酵、陈酿。最后通过硅藻土过滤、膜过滤等工艺以达到除菌、同时最大限度保持酶活的目的。该法制得的酵素具有高抗氧化活性、酶类丰富、酶活高的特征。
本发明目的的技术由以下措施实现：
一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制作方法包括以下步骤：
（1）预处理
挑选新鲜饱满, 无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆；
（2）酶解
向猕猴桃浆中添加0.1%-0.3%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37-40℃，酶解时间1-2.5h；
（3）成分调整
猕猴桃浆在发酵前，应调整其成分，以利于糖类物质转化和维生素等多种营养成分的保持，形成独特口味。猕猴桃根据品种及成熟度不同含糖量不同，范围约在5%-15%之间。为了保证初始菌种酵母菌的最适生长条件，以及发酵初始糖度的统一性，向酶解后的猕猴桃浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸将pH值调至4-5；
（4）酒精发酵
称取占猕猴桃浆质量1%-3%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃-40℃活化40min-60min，然后植入猕猴桃浆中，搅拌均匀，密封，酒精发酵这一过程要避免与空气接触，在25℃±2℃条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液；
（5）醋酸发酵
称取占猕猴桃浆质量2%-6%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃-40℃活化40min-60min，然后植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35℃±2℃发酵，醋酸发酵过程中要逐渐加大通风量，后期醋酸菌大量繁殖，氧化酶大量分泌，催化酒精与空气中的氧气结合形成乙酸，发酵至pH为2.2-3时结束，得二级发酵液；
（6）乳酸发酵
称取占猕猴桃浆质量1%-3%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃-40℃活化40min-60min，然后植入猕猴桃二级发酵液中，密封，温度保持30℃±2℃发酵至酸度不再升高时发酵结束，得三级发酵液；
（7）板框过滤
发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果皮果肉浆渣，得发酵液；
（8）陈酿
将发酵液于阴凉处陈酿30-90天；
（9）硅藻土过滤
陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质；
（10）膜过滤
经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜材质为聚偏氟乙烯，孔径为0.1-0.25μm；
（11）灌装、包装
对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。
本发明具有以下优点：
1.本发明解决了酵素制作过程中活性物质难以保留的技术难题（采用常规灭菌方法如巴氏杀菌、UHT杀菌等会破坏活性物质）。膜过滤采用PVDF膜内压式中空纤维超滤系统，孔径为0.1-0.25μm。由于该法过滤于常温下进行，条件温和无成分破坏，因而特别适宜对热敏感的物质，既可有效除菌，终止产品继续发酵，保证货架期产品稳定性，同时又最大限度保持酵素中生物活性成分及酶的活性。
2.本发明解决了猕猴桃果皮废物利用的问题。由于猕猴桃保留了果皮进行打浆，果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶的加入使细胞壁在复合酶制剂的共同作用更易破碎, 低温下快速有效的提高出汁率，增加充填量, 果皮利用率大大提高，同时也使其中的果胶质、淀粉、蛋白质等成分有效地降解, 使微生物更易代谢，加快发酵速率。
3.本发明采用多菌株共生发酵技术，利用酵母菌、醋酸菌和乳酸菌的共生关系进行发酵。首先，酵母菌将糖类物质转化为乙醇，醋酸菌再将乙醇氧化成醋酸，乳酸菌利用葡萄糖生成乳酸。多菌株共生能将猕猴桃中糖类物质转化成人体易于吸收的乳酸、醋酸、葡萄糖酸、柠檬酸等多种有机酸，也可将少量蛋白质转化成人体易于吸收的多肽和氨基酸类物质，营养丰富。较单一菌种发酵而言，发酵产物种类更加丰富，发酵各阶段酶的活性也显著提高。
4.本发明以新鲜猕猴桃为原料，由于猕猴桃中含有多种氨基酸、矿物质、活性物质等，VC含量高。经发酵后的猕猴桃酵素中含有丰富的超氧化歧化酶、多酚类物质，具有高抗氧化活性，同时具有消炎抗菌、提高免疫、促进新陈代谢等功效。风味上具有酸甜爽口、柔和、果香清雅等特点。
附图说明
图1为两种猕猴桃酵素的ABTS自由基清除活性图示。
图2为两种猕猴桃酵素的DPPH自由基清除活性图示。
图3为两种猕猴桃酵素的还原力图示。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员可以根据上述本发明的内容作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制作方法包括以下步骤：
（1）预处理
挑选新鲜饱满, 无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆；
（2）酶解
向猕猴桃浆中添加0.1%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37℃，酶解时间1h；其中，复合酶制剂是由质量比为3:2:2:2:1的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶组成；
（3）成分调整
猕猴桃浆在发酵前，对其进行成分调整，为了保证初始菌种酵母菌的最适生长条件，以及发酵初始糖度的统一性，向酶解后的猕猴桃浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸将pH值调至4；
（4）酒精发酵
称取占猕猴桃浆质量1%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃活化40min，然后植入猕猴桃浆中，酒精发酵这一过程要避免与空气接触，加入活化的酵母菌后搅拌均匀，密封，在25℃条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液；
（5）醋酸发酵
称取占猕猴桃浆质量2%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃活化40min，然后植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35℃发酵至pH为3时结束，得二级发酵液；
（6）乳酸发酵
称取占猕猴桃浆质量1%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃活化40min，然后植入猕猴桃二级发酵液中。密封，温度保持30℃发酵至酸度不再升高时发酵结束，得三级发酵液；
（7）板框过滤
发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果皮果肉浆渣，得发酵液；
（8）陈酿
将发酵液放置于阴凉处陈酿30天，以降低刺激性酸味，使口味更加柔和；
（9）硅藻土过滤
陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质；
（10）膜过滤
经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜材质为PVDF（聚偏氟乙烯），孔径为0.1-0.25μm；
（11）灌装、包装
对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。
实施例2
一种高抗氧化活性的猕猴桃酵素的制作方法包括以下步骤：
（1）预处理
挑选新鲜饱满, 无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆；
（2）酶解
向猕猴桃浆中添加0.1%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37℃，酶解时间1h；其中，复合酶制剂是由质量比为8:4:3:3:2的果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶组成；
（3）成分调整
猕猴桃浆在发酵前，对其进行成分调整，为了保证初始菌种酵母菌的最适生长条件，以及发酵初始糖度的统一性，向酶解后的猕猴桃浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸将pH值调至4；
（4）酒精发酵
称取占猕猴桃浆质量1%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃活化40min，然后植入猕猴桃浆中，酒精发酵这一过程要避免与空气接触，加入活化的酵母菌后搅拌均匀，密封，在25℃条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液；
（4）酒精发酵
称取原料猕猴桃浆1%的酵母粉，用浓度为5%的蔗糖溶液37℃活化40min，然后植入猕猴桃浆中，酒精发酵这一过程要避免与空气接触，加入活化的酵母菌后搅拌均匀，密封，在25℃条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液。
（5）醋酸发酵
称取占猕猴桃浆质量2%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃活化40min，然后植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35℃发酵至pH为3时结束，得二级发酵液；
（6）乳酸发酵
称取占猕猴桃浆质量1%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃活化40min，然后植入猕猴桃二级发酵液中。密封，温度保持30℃发酵70天。当酸度不再升高时发酵结束，得三级发酵液；
（7）板框过滤
发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果皮果肉浆渣，得发酵液；
（8）陈酿
将发酵液放置于阴凉处陈酿90天，以降低刺激性酸味，使口味更加柔和；
（9）硅藻土过滤
陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质；
（10）膜过滤
经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜材质为PVDF（聚偏氟乙烯），孔径为0.1-0.25μm；
（11）灌装、包装
对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。
为进一步验证猕猴桃酵素产品的抗氧化活性，本发明以实施例1制得样品（膜过滤猕猴桃酵素）作为样品1，巴氏杀菌猕猴桃酵素作为样品2，抗氧化剂BHT作为阳性对照。研究其总酚含量、ABTS自由基清除能力、还原力的大小。三者是表征抗氧化能力的重要指标，总酚含量越高，自由基清除能力越强，还原力越强，抗氧化活性越高。
1 总酚含量的测定
(1)测定方法
标准曲线绘制：将没食子酸标准品采用梯度稀释法稀释至不同浓度：0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mg/mL。取各浓度标准溶液0.1 mL，分别加入20 mg/mL的碳酸钠溶液2 mL。2min后，加入0.9 mL对倍稀释的Folin-Ciocalteu溶剂，反应30 min后，测定其在750 nm处的吸光度值。以吸光度值为y，没食子酸浓度为x 绘制总酚含量标准曲线，经线性拟合得回归方程y=1.0082x-0.0131，（R2=0.9997）。 样品测定，计算没食子酸当量。
（2）结果如表1所示：
表1 两种猕猴桃酵素中总酚含量
2 ABTS自由基清除活性测定
（1）测定方法
取19 mg ABTS自由基与3.3 mg过硫酸钾反应，在室温、避光条件下静置过夜。使用前加水稀释使其在734 nm波长下吸光度为0.70±0.02，形成ABTS工作液。将30 ml含不同浓度受试物的溶液与2.97 mL ABTS自由基工作液混合，避光放置30 min后，在734 nm处测定吸光度，计算清除率。以BHT作为阳性对照，同时设立阴性对照。
ABTS自由基清除率S%计算公式如下：
S%=
式中：—待测样品的吸光度值；—阴性对照的吸光度值。
（2）结果
两种猕猴桃酵素及阳性对照BHT对ABTS自由基清除率如图1所示，由图可知，两种酵素虽然自由基清除能力都不及阳性对照BHT，但样品1（膜过滤除菌）的清除能力显著高于样品2（巴氏杀菌），当浓度为1.4mg/mL时，膜过滤除菌酵素清除率超60%，而巴氏杀菌酵素清除率约40%，体现了膜过滤猕猴桃酵素具有较好ABTS自由基清除活性。
2 DPPH自由基清除活性测定
（1）测定方法
取DPPH 1.18 mg溶解于甲醇中，使其终浓度为0.3 mM，避光室温保存。将1.0 mL含不同浓度受试物的溶液与2.0 mLDPPH自由基甲醇溶液混合。避光静置30min后于520 nm下测定各反应液的吸光值，并计算清除率。以BHT作为阳性对照，同时设立阴性对照。
DPPH自由基清除率 S % 计算公式如下：
S % =
式中：—待测样品的吸光度值；—对照组样品的吸光度值。
（2）测定结果
两种猕猴桃酵素及阳性对照BHT对DPPH自由基清除率如图2所示，由图可知，样品1（膜过滤除菌）的清除能力也显著高于样品2（巴氏杀菌），这与ABTS自由基清除能力排序、总酚含量排序一致。体现了膜过滤猕猴桃酵素除对ABTS自由基外兼具较好的DPPH自由基清除活性。
3 还原力测定
（1）测定方法
将样品按照梯度浓度溶解于1 mL甲醇中，依次加入2.5 mL PBS（0.2 M, pH 6.6）溶液和2.5 mL 1%铁氰化钾溶液。混匀后置于50℃水浴中20 min后快速冷却，再加入2 mL 10%三氯乙酸溶液，以2 000 r/min的转速离心15 min，取上清液2.5 mL。依次加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 0.1%三氯化铁溶液，在700 nm 下测定其吸光度值[10],以Vc作为阳性对照，同时设立阴性对照。
（2）结果
两种酵素的还原力情况如图3所示。可见，样品1（膜过滤）的还原力仍明显高于样品2（巴氏杀菌）的还原力。膜过滤除菌猕猴桃酵素具有很好的还原能力,试样浓度在0.9mg/mL~1.5mg/mL范围内时，体现了与Vc相当的还原力。
综上，膜过滤除菌酵素相对于巴氏杀菌酵素，总酚含量更高，自由基清除能力越强，还原力更强强，因此可证明其抗氧化活性越强，活性物质保留得更好。
为进一步验证猕猴桃酵素产品的酶活，本发明以实施例1制得样品（多菌株共生发酵酵素）作为样品1，自然发酵酵素作为样品2，研究其发酵过程中SOD（超氧化物歧化酶）的活性变化。检测依据参照GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶（SOD）活性的测定》，检测结果如表2所示：
表2 不同发酵方式过程中SOD 活性平均变化对比（SOD活性U/100mL）
由表2可知，在猕猴桃浆发酵过程中植入酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物菌的多菌株共生发酵方式其发酵各阶段SOD活性远高于自然发酵，且在共生发酵过程中，SOD呈高活性状态持续时间远长于自然发酵。也进一步验证了该发明酵素的高酶活与高抗氧化活性。
对实施例2所制得产品也做了如实施例1产品同样的抗氧化活性以及酶活性的试验，其试验结果与实施例1实验结果并无明显区别，故在此不作敷述。
由此可知，本发明所制得的产品不需巴氏以及UHT（高温瞬时杀菌）杀菌，同样具有高抗氧化活性、酶类丰富、酶活高、稳定性高等优点。
Claims (2)
1.一种猕猴桃酵素的制备方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）预处理
挑选新鲜饱满, 无虫害腐烂猕猴桃，然后对其进行清洗、脱毛、带皮打浆；
（2）酶解
向猕猴桃浆中添加0.1%-0.3%的复合酶制剂进行酶解，酶解温度37-40℃，酶解时间1-2.5h；
（3）成分调整
向酶解后的猕猴桃浆添加蔗糖，使其含糖量达20%，并用柠檬酸将pH值调至4-5；
（4）酒精发酵
称取占猕猴桃浆质量1%-3%的酵母粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃-40℃活化40min-60min，然后植入猕猴桃浆中，搅拌均匀，密封，在25℃±2℃条件下发酵至酒精度大于3%结束，得一级发酵液；
（5）醋酸发酵
称取占猕猴桃浆质量2%-6%的醋酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃-40℃活化40min-60min，然后植入猕猴桃一级发酵液中，温度保持35℃±2℃发酵，醋酸发酵过程中要逐渐加大通风量，后期醋酸菌大量繁殖，氧化酶大量分泌，催化酒精与空气中的氧气结合形成乙酸，发酵至pH为2.2-3时结束，得二级发酵液；
（6）乳酸发酵
称取占猕猴桃浆质量1%-3%的乳酸菌粉，用质量浓度为5%的蔗糖溶液37℃-40℃活化40min-60min，然后植入猕猴桃二级发酵液中，密封，温度保持30℃±2℃发酵至酸度不再升高时发酵结束，得三级发酵液；
（7）板框过滤
发酵结束后，利用400目板框过滤对三级发酵液进行过滤，除去其中未分解的猕猴桃果皮果肉浆渣，得发酵液；
（8）陈酿
将发酵液于阴凉处陈酿30-90天；
（9）硅藻土过滤
陈酿后利用硅藻土过滤除去陈酿过程中形成的冷凝固物及其他杂质；
（10）膜过滤
经硅藻土过滤后的发酵液继续进一步进行膜过滤，采用内压式中空纤维超滤系统，膜材质为聚偏氟乙烯，孔径为0.1-0.25μm；
（11）灌装、包装
对膜过滤后的发酵液进行无菌灌装、包装，得最终成品猕猴桃酵素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述复合酶制剂由果胶酶、纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶以及淀粉酶组成。
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