CN105255748A - 一株高产谷胱甘肽的果酒酵母及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株高产谷胱甘肽的果酒酵母及其应用，属于生物工程技术领域。本发明的酵母，已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC？NO:M2015544。本发明的酵母产谷胱甘肽能力可达106mg/L，其中胞外产量达到70mg/L以上，具有抑制发酵过程中苹果酒或山楂酒褐变性能的菌株。本发明的酿酒酵母发酵酿造果酒GSH含量最高可达到14-18mg/L，约为对照成品酒的5-9倍，具有降低果酒色度，提高果酒抗氧化性，减少SO₂等抗氧化剂使用的性能。本发明利用生物方法减少褐变对果酒品质的影响，为高品质果酒的开发提供参考，在提高果酒安全性的前提下降低成本，具有广阔的研究前景。

Description

一株高产谷胱甘肽的果酒酵母及其应用

技术领域

本发明涉及一株高产谷胱甘肽的果酒酵母及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

我国是世界上最大的水果生产国，而水果深加工业一直很薄弱，为发展果酒产业开辟了良好时机。作为发酵酒，果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质，适量饮用，可舒筋活络，调整新陈代谢，促进血液循环，同时具有控制体内胆固醇水平，利尿、激发肝功能和抗衰老等功效，具有较强的保健作用。

果汁褐变是苹果汁或山楂汁生产中面临的四大技术难题之一。褐变不仅影响果汁的外观、风味，而且还会造成营养物质丢失，甚至变质。酶促褐变主要发生于果汁生产初期，苹果经过破碎及榨汁工序，多酚物质与PPO充分接触，引起果汁酶促褐变。苹果酒或山楂酒氧化褐变是苹果酒或山楂酒生产与贮存过程中的一个重要问题，既影响色泽，又影响风味，重者出现混浊与沉淀，造成质量不稳定问题。果酒褐变极易发生在加工及储藏过程中，会使果酒颜色加重，从金黄色变为砖红色、氧化感增强、果香变淡等问题。褐变不仅影响产品色泽，影响销量，另外也造成一些营养物质的损失。目前对果酒褐变的主要抑制方法是抗氧化剂的添加，如二氧化硫、抗坏血酸、茶多酚、L-半胱氨酸、柠檬酸等，但各有弊端。二氧化硫是果酒酿造及贮存过程中应用的一种化学添加剂，具有很好的抗氧化及抗菌的作用。但大量研究结果表明，二氧化硫对人体健康会产生很大的危害。在我国，按照GB/T15037的规定，游离二氧化硫被划为B类不合格，当一个果酒中其他项目完全合格而仅仅游离二氧化硫超标时，该酒将被划为不合格。而抗坏血酸极易氧化分解，可与游离氨基酸反应，生成红色素及黄色素，造成褐变。为此，找到替代二氧化硫的抗氧化及抗菌作用的物质或其他方法，已经成为果酒行业的研究热点。

作为发酵酒，果酒富含多种氨基酸、维生素及矿物质等营养成分，还含有丰富的生理活性物质。随着人们对食品安全及功能性了解和认识的深入，果酒广受消费者喜爱和认可，也必将在国内形成一个巨大的消费市场，而果酒抗氧化剂的添加也日益成为市场关注的焦点。谷胱甘肽是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成具有重要抗氧化性的三肽化合物，具有重要的生理功能。因此，筛选一株高产谷胱甘肽的酵母菌，抑制果酒在发酵过程中的氧化褐变，降低二氧化硫等抗氧化剂的使用，提高苹果酒或山楂酒的抗氧化性。本发明利用生物方法减少褐变对果酒品质的影响，在不引入外源物质的前提下减少褐变对果酒品质的影响，为高品质果酒的开发提供参考，在提高果酒安全性的前提下降低成本，具有广阔的研究前景。

发明内容

为了克服上述问题，本发明得到了一株高产谷胱甘肽(GSH)的果酒酵母，达到抑制果酒在发酵过程中发生氧化褐变，增强果酒的抗氧化性的目的，为高品质果酒的生产提供思路。

本发明的高产谷胱甘肽的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNO:M2015544。

所述酿酒酵母是从山楂皮中分离后的酿酒酵母CCTCCNO:M2015119经诱变筛选得到的。与出发菌株相比，本发明的酿酒酵母的GSH胞外分泌量得到显著提高，发酵酿造的苹果酒或山楂酒GSH含量是出发菌株的5-9倍。

所述酿酒酵母，具有如下性能：

(1)发酵生产谷胱甘肽，含量可达106mg/L，其中胞外产量达到70mg/L以上，占总含量的66％以上；

(2)可耐受1.4～1.6g/L的氯化锌；

(3)发酵果酒酒精度可达到12％vol；

(4)该菌株可在12-14％乙醇含量的培养基中生长；可耐受14％的乙醇；

(5)该菌株可耐受pH为2的酸性环境；

(6)用于发酵生产果酒，可以抑制发酵过程中果酒的氧化褐变。

所述酿酒酵母是从CCTCCNO:M2015119的酿酒酵母紫外诱变得到的，诱变方法具体如下：诱变出发株在YPD培养基中活化14～18h，接入液体培养基，培养至对数生长期(14h)，取对数生长期菌液5mL，离心并以无菌生理盐水洗两次，还原至原体积，转入直径9cm培养皿中，磁力搅拌，在紫外灯(功率15w，距离30～35cm)照射50～60s(致死率控制60～70％左右)。

本发明还提供了一种利用所述酿酒酵母生产谷胱甘肽的方法。

所述方法是将酵母以8-10％接种量接种于发酵培养基中，温度25-30℃，转速150-200r/min，培养24-30h。

所述发酵培养基含有：葡萄糖30g/L，酵母提取物10g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，pH3.5，糖度为15°Brix。

本发明还提供了所述酵母在生产果酒方面的应用。

所述应用，在本发明的一种实施方式中，是调节果汁还原糖量为160-200g/L，pH3.2-3.6，然后按6-10％(v/v)的接种量将酵母种子液接入果汁中，在温度20-25℃下发酵5-10d。

在本发明的一种实施方式中，所述应用包括如下步骤：(1)将原料清洗、去核、榨汁、离心得到果汁；(2)调整成分；(3)接种保藏编号为CCTCCNO:M2015544的酵母；(4)酒精发酵；(5)陈酿；(6)过滤；(7)除菌。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)的调整成分是指调整pH为3.2-3.6，还原糖量为160-200g/L；不经任何其它成分调节，直接用来发酵。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中酵母的接种量为6-10％(v/v)。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中酒精发酵的温度为20-25℃，发酵时间为5-10d。

在本发明的一种实施方式中，所述果酒是以苹果汁或山楂汁为原料的苹果酒或山楂酒。

在本发明的一种实施方式中，所述应用还包括杀菌之后的灌装步骤。

本发明的有益效果主要体现在：

(1)本发明的酿酒酵母菌是从山楂皮中分离，经紫外诱变筛选得到的，其发酵生产谷胱甘肽，含量可达106mg/L，其中胞外产量达到70mg/L，占总含量的66％左右；该菌株可在12-14％乙醇含量的培养基中维持一定生长，且对pH的耐受性较强，对酸性环境的适应能力较强于其它菌株；

(2)本发明的酿酒酵母适合在酸度较高、不经任何成分调节的苹果汁或山楂汁中进行正常的酒精发酵，产谷胱甘肽能力显著高于对照组酵母菌株；用于发酵生产果酒，可以抑制发酵过程中果酒的氧化褐变；

(3)由本发明菌株发酵酿造的苹果酒或山楂酒GSH含量最高可达到14-18mg/L，约为对照组苹果酒或山楂酒的5-9倍；得到的苹果酒或山楂酒澄清度较高，抗氧化性较高，褐变值显著低于对照组果酒。酒香和果香醇厚，口味柔和纯正，具有苹果酒或山楂酒的典型性，适用于高品质果酒的生产。

生物材料保藏：

酿酒酵母CCTCCNO:M2015544，分类学命名为酿酒酵母Y18SaccharomycescerevisiaeY18，于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNO:M2015544。

附图说明

图1：生长曲线；

图2：酵母菌株发酵力比较；

图3：酵母菌株耐乙醇能力比较；

图4：酵母菌株耐pH能力比较；

图5：发酵过程中谷胱甘肽含量变化；

图6：发酵过程中色度变化；

图7：发酵过程中抗氧化能力变化。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方法不限于此。

培养基的配方：

YPD培养基：酵母粉10g/L，鱼粉蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，0.1MPa高压灭菌15min。固体培养基添加琼脂20g/L。

苹果汁或山楂汁活化培养基：调节苹果汁或山楂汁还原糖量为160-200g/L，然后用柠檬酸调整到pH3.5，按6％(v/v)的接种量接入培养基，在25℃下发酵培养24h。

苹果汁或山楂汁发酵培养基：调节鲜榨苹果汁或山楂汁还原糖量为160-200g/L，然后用柠檬酸调整到pH3.2-3.6，按6-10％(v/v)的接种量接入培养基，在20-25℃下发酵。

实施例1：酵母菌株生长曲线测定

向100mL灭菌的YPD液体培养基中接入一环酵母菌，28℃下，150rpm振荡培养24h，每隔2h取样5mL，用分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光值(以未接菌的YPD培养液做空白试验)，若菌体浓度过大，用蒸馏水进行适量稀释后再进行测定。以培养时间为横坐标，OD₆₀₀为纵坐标，绘制出生长曲线图，确定对数生长期，如图1所示。

实施例2：酵母菌诱变

(1)诱变时间确定

诱变出发株在YPD培养基中活化18h，接入液体培养基，培养14h，取对数生长期菌液5mL，离心并以无菌生理盐水洗两次，还原至原体积，转入有磁力搅拌的无菌培养皿中，在功率15W紫外灯下，距离35cm，照射一定时间。将照射后的菌悬液在无菌室避光(在红光下操作)条件下适当稀释后涂1.0g/L氯化锌平板。平板倒置于30℃恒温箱中，避光培养2d。待平皿长出菌落后，根据菌数计算紫外诱变各时间致死率，致死率70％时诱变时间为60s。

(2)氯化锌浓度确定

将紫外诱变后的菌体系列稀释后分别涂布于培养基上，计算其菌数与乙醇浓度的关系，根据菌数确定致死率在70％左右时，氯化锌浓度为1.6g/L。

实施例3：酵母性能比较

将菌株接种于种子培养基中，摇床培养24h后，以10％接种量接种于发酵培养基中，温度30℃，转速150-200r/min，培养30h。以酵母菌的生物量及胞外GSH含量为指标，比较了诱变后筛选的不同酵母菌的产谷胱甘肽能力，结果如表1所示。编号Y-11，即为本发明的酿酒酵母，保藏编号为CCTCCNO:M2015544，其GSH总量可达106mg/L，且胞外含量达到了总量的66％，胞外分泌越多则表明发酵液中含量越大，以充分发挥发酵液中谷胱甘肽的抗氧化作用。

同时本发明还比较了产谷胱甘肽能力相对较高的菌株的发酵力、乙醇耐受性、pH耐受性等，结果如图2、图3、图4所示。

发酵力测定方法：取500mL三角瓶，加入400mL苹果汁，按5％的接种量接入酵母种子液，在25℃下恒温发酵，发酵初期微晃瓶体，使附着在瓶壁的酵母脱落，在发酵过程中每天取样测定理化指标，当渣完全沉淀且无气泡产生时则认为发酵结束。

耐受性测定方法：分别以不同乙醇浓度和pH值作为酵母菌生长和发酵的影响因素，通过测定发酵24h后发酵液的OD₆₀₀值，比较14株酵母菌在不同影响因素中的耐受性。

对14株酵母菌的生物量和产GSH能力进行测定，结果发现不同酵母菌产GSH能力有较大差别。结果如表1所示，本发明的酵母(Y11)不仅GSH总量达到最大，而且胞外分泌比例达66％左右，远远高于其他菌株。同时本发明的菌株，在pH3.5条件下的发酵液中的GSH含量显著高于pH6.5时的GSH含量，说明本发明的酵母向胞外分泌GSH受到酸性环境的刺激。

表1菌株产GSH能力比较

酵母菌的发酵力是反映酵母对各种糖类的发酵能力的重要指标，以CO₂失重量为指标衡量酵母菌的发酵速率，是衡量酵母产酒能力的一个重要指标。14株酵母菌株发酵力结果见图2，由图可见，14株酵母菌的发酵能力有显著差别，试验菌株Y-11、Y-8、Y-1的发酵力较强于其它菌株，且在第4dCO₂失重量达到最大，之后趋于平缓。

一般来说，酵母细胞的发酵能力与菌株对酒精的耐性成正相关。由图3可知，不同酵母菌对乙醇的耐受性不同，随着培养基中乙醇浓度的增加，酵母菌发酵液的OD₆₀₀值不断降低，在乙醇浓度大于10％时，酵母细胞的生长受到了很大抑制。Y11可在12-14％乙醇含量的培养基中生长，可耐受14％的乙醇。

从图4可以看出，随着培养基pH值的降低，14株酵母菌的生长能力整体呈下降趋势，Y-11对pH的耐受性较强，OD值的波动较平缓，这说明Y-11菌株对酸性环境的适应能力较强于其它菌株，可以耐受pH为2的酸性环境。

综上，本发明的酿酒酵母谷胱甘肽产量106mg/L，其中胞外产量占66％以上，可耐受1.4～1.6g/L的氯化锌，该菌株可在12-14％乙醇含量的培养基中生长，该菌株可耐受pH为2的酸性环境，具有优良的发酵性能，适合用于果酒发酵。

实施例4苹果酒酿造工艺

(1)苹果汁的制备与处理：选择成熟度较高、无病虫、无霉烂的脆性红富士苹果，清

洗干净后去核，用破碎机破碎(粒度为0.3cm左右)后，放入榨汁机中压榨取汁，为防止苹果榨汁前与空气接触而褐变，将捣碎的苹果立即放入榨汁机。及时向鲜榨果汁中添加40mg/L果胶酶(酶活力20000U/g)，充分混合均匀，静置24h澄清。

(2)调整成分：苹果汁中糖、酸含量分别用白砂糖、柠檬酸调节，调节果汁的糖还原糖量为200g/L，调节pH3.5，总酸度0.45g/100mL。

(3)发酵：将酵母菌CCTCCNO:M2015544于苹果汁活化培养基中培养24h，按10％(v/v)的接种量接入培养基，在25℃下发酵8d，此时苹果汁中残糖降为5g/L以下，分离出酒脚等沉淀物，转为后发酵。

(4)陈酿：苹果原酒经半年以上的密封陈酿后，需进行糖、酒、酸的调配，使各成分保持适当比例，酒体协调，典型性好，达到质量标准的要求。

(5)冷冻：为使苹果酒的口感柔和，使酒液中某些苹果酸盐等低温不溶物质析出，从而提高成品苹果酒的稳定性，可将苹果酒在-4℃冷冻7d，并趁冷采用0.8μm和0.45μm的微孔核膜过滤机过滤，经2次过滤以除去低温沉淀物及微生物。

(6)无菌灌装。

实施例5苹果酒酿造工艺

(1)苹果汁的制备与处理：选择成熟度较高、无病虫、无霉烂的脆性红富士苹果，清洗干净后去核，用破碎机破碎(粒度为0.3cm左右)后，放入榨汁机中压榨取汁，为防止苹果榨汁前与空气接触而褐变，将捣碎的苹果立即放入榨汁机。及时向鲜榨果汁中添加40mg/L果胶酶(酶活力20000U/g)，充分混合均匀，静置24h澄清。

(2)调整成分：苹果汁中糖、酸含量分别用白砂糖、柠檬酸调节，调节果汁的还原糖量为160g/L，调节pH3.2，总酸度0.45g/100mL。

(3)发酵：将酵母菌CCTCCNO:M2015544于苹果汁活化培养基中培养24h，按6％(v/v)的接种量接入培养基，在25℃下发酵10d，此时苹果汁中残糖降为4g/L以下，分离出酒脚等沉淀物，转为后发酵。

(4)陈酿：苹果原酒经半年以上的密封陈酿后，需进行糖、酒、酸的调配，使各成分保持适当比例，酒体协调，典型性好，达到质量标准的要求。

(5)冷冻过滤：为使苹果酒的口感柔和，使酒液中某些苹果酸盐等低温不溶物质析出，从而提高成品苹果酒的稳定性，可将苹果酒在-4℃冷冻7d，并趁冷采用0.8μm和0.45μm的微孔核膜过滤机过滤，经2次过滤以除去低温沉淀物及微生物。

(6)无菌灌装。

实施例6山楂酒酿造工艺

(1)原料挑选与处理：选用果实呈亮红色、完全成熟的山楂，破碎前经浸泡洗涤，除去泥土、杂物、农药等残留物，控干水分后将山楂破碎。添加适量果胶酶，搅拌均匀，果胶酶添加量(g)＝山楂量(g)×果胶酶添加比例。

(2)调整成分：发酵前进行糖分调整，用白砂糖及柠檬酸调节山楂浆的还原糖量为180g/L，调节pH3.4。

(3)发酵：将酵母菌CCTCCNO:M2015544于活化培养基中培养24h，按8％(v/v)的接种量接入培养基，在25℃下发酵10d，此时苹果汁中残糖降为5g/L以下，分离出酒脚等沉淀物，转为后发酵。

(4)冷冻过滤：为使山楂酒的口感柔和，将山楂酒在-4℃冷冻7d，并趁冷采用0.8μm和0.45μm的微孔核膜过滤机过滤，经2次过滤以除去低温沉淀物及微生物。

(5)无菌灌装。

实施例7成品酒理化指标分析

苹果酒或山楂酒的制作工艺同实施例3及实施例5，用本发明的酵母(Y11表示)与商业酵母菌株2.2076(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)、2.2084(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)、31906(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)相比：

发酵的苹果酒色泽金黄，酒体清亮，口感柔和协调，香气浓郁。其中pH为3.75，滴定酸3.35g/L，还原糖含量为2.4g/L，总酚含量为285mg/L，酒精度为11.8％vol。

发酵得到的山楂酒pH3.67，酒精度为11.8^。vol，总糖为4.6g/L，总酸13.4g/L(以酒石酸计)，总酚含量为274mg/L。色泽呈深橙红色，澄清透明，有光泽，有明显的山楂果实香气，醇味突出。

通过测定发酵过程中苹果酒色度、谷胱甘肽含量与抗氧化性变化，比较本发明菌株与对照商业酵母菌株在降低果酒褐变，提高抗氧化能力方面的差异，见图5、图6、图7。由图可以看出，筛选菌株在抑制果酒褐变、提高其抗氧化性方面效果突出，其发酵结束后苹果酒中GSH含量约为对照商业菌株的1.5-2倍，褐变度显著低于对照菌株，而抗氧化性与对照相比，提高了10-30％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一株高产谷胱甘肽的果酒酵母，其特征在于，所述酵母为酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，已于2015年9月15日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCCNO:M2015544。

2.权利要求1所述酵母在生产谷胱甘肽方面的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用是将酵母以8-10％接种量接种于发酵培养基中，温度25-30℃，转速150-200r/min，培养24-30h。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基含有：葡萄糖30g/L，酵母提取物10g/L，硫酸铵6g/L，磷酸氢二钾3g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，硫酸镁0.1g/L，pH3.5。

5.权利要求1所述酵母在生产果酒方面的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是先制备果汁，然后调节果汁还原糖量为160-200g/L，pH3.2-3.6，再按6-10％(v/v)的接种量将酵母种子液接入果汁中，在温度20-25℃下发酵5-10d。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用包括如下步骤：(1)将原料清洗、去核、榨汁、离心得到果汁；(2)调整成分；(3)接种保藏编号为CCTCCNO:M2015544的酵母；(4)酒精发酵；(5)陈酿；(6)过滤；(7)除菌；

其中步骤(2)的调整成分是指调整pH为3.2-3.6，还原糖量为160-200g/L。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述酵母的接种量为6-10％(v/v)；所述酒精发酵的温度为20-25℃，发酵时间为5-10d。

9.根据权利要求5-8任一所述的应用，其特征在于，所述果酒是以苹果汁或山楂汁为原料的苹果酒或山楂酒。