CN108559714B - 一种具有高抗氧化能力的啤酒酵母菌株 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具高抗氧化能力的啤酒酵母菌株，属于生物工程领域。本发明提供的啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)已于2018年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CMCC No.15504，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。该菌株具有较好的生产稳定性，可用于啤酒生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种具高抗氧化能力的啤酒酵母菌株，属于生物工程领域。
背景技术
酵母是一种重要的工业生产菌株，它具有发酵速度快、生长周期短、可进行大规模培养等优点。酵母在工业生产中会受到各种胁迫压力(如氧化胁迫、高渗透压胁迫、低pH值、高酒精度胁迫、冷或热刺激、饥饿、高浓度SO2等)的影响，这些胁迫对酵母的生存能力和发酵效力有很大的影响。其中，氧化胁迫是对酵母发酵过程影响最大的胁迫，它主要是由活性氧簇(ROS)的大量积累引起的。ROS是细胞新陈代谢的主要副产物，它包括过氧化氢、单态氧、羟自由基和超氧化物阴离子等。由于ROS和ATP参与氧化磷酸化过程，这两者在细胞内的存在是必要的。但是，当ROS随时间增加在细胞内累积过多，细胞自身清除内源性ROS的机制已不能将过多的ROS抵消掉，ROS的大量积累损伤胞内大分子物质，使得细胞膜传输、细胞代谢等功能减弱，啤酒酵母的生物活性和发酵能力都会受到严重的影响。
ROS诱发的损伤是复杂的并且通常情况下是不可逆转的。尤其是胞内ROS会直接损害线粒体功能，使得线粒体向着更易于产生ROS的方向变化。线粒体与ROS之间恶性循环更加快了细胞老化的速率。ROS的聚集和细胞氧化压力的增加被认定为细胞衰老的重要特征，因此，提高酵母的抗氧化能力有对提高酵母的发酵性能有重要的意义。
发明内容
本发明用不同浓度的H2O2刺激酵母细胞，在致死浓度条件下以96孔板微型液体培养方法筛选生长速度快、活性高的菌株。然后利用含有不同浓度的H2O2的96孔板微型液体培养方法驯养筛选得到的菌株，最终得到一株抗氧化能力提高的啤酒酵母(Saccharomycespastorianus)。
本发明所述啤酒酵母(S.pastorianus)，已于2018年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CMCC No.15504，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明提供的啤酒酵母(S.pastorianus)的培养方法是将啤酒酵母接种至YPD液体培养基中培养。所述YPD培养基为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，蒸馏水配置，115℃灭菌15min。
本发明提供的啤酒酵母(S.pastorianus)，相较于出发菌株Pilsner酵母，培养到第五天时胞内ROS积累量下降36.4％，传代第5代时胞内ROS含量减少6.5％，传代第5代时胞内ATP含量增加11.9％，传代第5代细胞存活率增加1.6％。可见，本发明提供的啤酒酵母具有更强的抗氧化能力，能够显著避免由于ROS的大量积累所导致的细胞膜传输减弱、细胞代谢减弱等问题，提升啤酒酵母的生物活性和发酵能力。
生物材料保藏
啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)，已于2018年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CMCC No.15504，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1为不同浓度过氧化氢下啤酒酵母的死亡率。
图2为胞内ROS在菌株各生长时期的含量。
图3为各菌株对酒精、渗透压抗性检测，图中两排4列共8幅图，其中，从左向右4列图片分别表示酵母菌株经10％(v/v)乙醇、12％(v/v)乙醇、6％(w/v)KCl、8％(w/v)KCl处理后在YPD平板培养基上的生长状况；每一幅图片中，各菌落从左向右分别对应10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的稀释度。
图4为传代过程中各菌株的活性检测。
图5为传代过程中各菌株的胞内ROS积累情况。
图6为传代过程中各菌株的胞内ATP积累情况。
图7为诱变菌株10-9、12-7(CMCC No.15504)及原出发菌株pilsner YPD平板生长的情况。
图8为诱变菌株10-9、12-7(CMCC No.15504)及原出发菌株pilsner 4mM过氧化氢平板生长情况。
图9为诱变菌株10-9、12-7(CMCC No.15504)及原出发菌株pilsner 6mM过氧化氢平板生长情况。
图10为诱变菌株10-9、12-7(CMCC No.15504)及原出发菌株pilsner 8mM过氧化氢平板生长情况。
图11为诱变菌株10-9、12-7(CMCC No.15504)及原出发菌株pilsner 15％酒精平板生长情况。
图12为诱变菌株10-9、12-7(CMCC No.15504)及原出发菌株pilsner 2mM细胞壁抑制剂平板生长情况。
图13为诱变菌株10-9、12-7(CMCC No.15504)及原出发菌株pilsner 5mM细胞壁抑制剂平板生长情况。
注：图7～13中的“(前)”，“(后)”的含义为利用含有6mM过氧化氢的YPD平板驯化之前，和驯化之后。
具体实施方式
实施例1抗氧化酵母的筛选
(1)过氧化氢对啤酒酵母致死浓度的确定
菌浓为107cfu/mL的出发菌株pilsner酵母以107cfu/mL的菌浓重悬于不同浓度(0，2，4，6，8，10，12mM)过氧化氢溶液中处理1h，洗涤后梯度稀释并接种在含有YPD培养基的96孔板上生长2～3天，得到酵母致死情况如图1所示。当过氧化氢浓度达到10、12mM时，致死率分别达到98.90％和99.35％。这说明当浓度超过10mM时，过氧化氢已对啤酒酵母细胞造成氧化损伤且大部分酵母已无法调控这样高强度的氧化刺激并导致死亡。因此，确定10mM是过氧化氢对pilsner酵母的致死浓度。见图1。
(2)取单细胞酵母在YPD中生长至对数前期，4000r/min离心5min，混悬于PBS缓冲液使细胞浓度达到1～2×107cfu/mL，加入过氧化氢至终浓度为10mM，28℃，180r/min培养1h，再接种于96孔板中，分离单菌落并培养2～3天。挑取生长较快的单菌落接种于斜面保存。
(3)将获得的单菌落菌株进行胞内ROS、线粒体膜电位、ATP活力的检测，筛选胞内ROS积累少，线粒体膜电位高，ATP活力高的菌株。
(4)将获得的单菌落接种于10mM的过氧化氢溶液中进行定向进化，传代培养10代-20代，传代结束后将其接种于含有180μL YPD+致死浓度过氧化氢溶液的96孔板中分离单菌落培养，挑选生长快速的单细胞形成的菌落，挑取单菌落培养并测量其胞内ROS、线粒体膜电位、ATP活力。如图2所示，相较于出发菌，突变菌P_12-7在培养第5天时，胞内ROS减少36.4％。如图5所示，相较于出发菌，突变菌P_12-7在传代培养第5代培养过程中，胞内ROS下降6.5％。如图6所示，相较于出发菌，突变菌P_12-7在传代培养第5代培养过程中，胞内ATP上升11.9％。如图4所示，相较于出发菌，突变菌P_12-7在传代培养第5代培养过程中，存活率上升1.6％。
将获得的单菌落分别接种于10％(v/v)乙醇、12％(v/v)乙醇、6％(w/v)KCl、8％(w/v)KCl溶液中，28℃，180r/min培养1h。收集菌体，洗涤后梯度稀释并接种在含有YPD培养基的96孔板上生长2～3天。如图3所示，相较于出发菌，突变菌株P_12-7的抗酒精毒性以及渗透压耐受性提高。
最终筛选获得啤酒酵母P_12-7(即为CMCC No.15504)，其具有较高的抗氧化能力，长期传代培养积累ROS少，ATP活力高，且具有较高的抗自溶能力。
从细胞死亡率、胞内ROS稳定程度和ATP变化可以得出，在0代到3代的发酵过程中各个菌株的活性变化没有明显差异。说明酵母菌株在发酵到第三代的时候活性还是比较稳定，胞内代谢调控还在可控的范围内，绝大多数酵母细胞还没有发生衰老损伤的情况，因此表现出来的活性基本相同。各个菌株从第三代开始活性变化出现差异，从活细胞率来讲pilsner酵母最早出现死亡率上升加快的现象，且其胞内ROS水平和ATP含量从第三代开始变化更为显著，说明从第三代开始明显出现细胞老化损伤，因此从第三代开始比较各菌株的活性和稳定性更有意义。
从第三代开始，菌株10-9的活细胞率变化最小，发酵到第五代时，它的死亡率和Pilsner酵母发酵到第三代时死亡率基本相同。从图5可以看出，菌株10-9的胞内ROS水平比其他菌株都要稳定，它的变化量是原出发菌株的一半。另外由图6可以得出，菌株10-9的ATP含量一直处于较高状态，且其含量的变化量也是原出发菌株的一半。见图4、5、6，分别为传代过程中各菌株的活性检测，传代过程中各菌株的胞内ROS积累情况，传代过程中各菌株的胞内ATP积累情况。
实施例2抗氧化酵母的驯化
对实施例1中得到的诱变菌株10-9及P-12-7(即为CMCC No.15504)在96孔板中进行驯化。将诱变得到的菌株10-9及P-12-7分别以1％接种于YPD培养基中，28℃，180rpm培养约10小时，细胞浓度达到1～2×107cfu/mL，再接种于96孔板中。每孔菌液20μL，含有180μL6mM和8mM过氧化氢的YPD培养基96孔板中，每行排孔以10倍逐级稀释。28℃静置培养1～2天，待长出单菌落。驯化后，P-12-7长势较好。
实施例3抗氧化能力啤酒酵母发酵指标测试
对实施例1中筛选出的具有高抗氧化能力的啤酒酵母菌株P-12-7(即为CMCCNo.15504)与原出发菌株Pilsner的进行300mL 12oP麦汁发酵，发酵时间为5d，发酵指标如表1所示。
表1 12-7与出发菌株发酵指标
由表1可看出在经过一定浓度过氧化氢刺激后，诱变菌株的发酵性能并没有受到负面影响，其发酵数据与原始菌株没有较大差异且都在正常范围内。对于啤酒风味物质分析可以看出诱变菌株P-12-7与原出发菌株的乙醛、双乙酰、高级醇酯和有机酸含量没有太大差别，啤酒风味基本没有变化，适用于工业啤酒的生产。
为考察诱变菌株P-12-7内ROS水平的稳定性，分别将Pilsner和P-12-7进行连续5次的传代发酵实验，测定每代发酵结束后酵母细胞的死亡率、胞内ROS和ATP的含量。发现诱变菌株P-12-7相较于原出发菌株Pilsner细胞活性和稳定性都比较好。死亡率在传代到第五代时下降了6.6％，胞内ROS的增加量为57.6％，ATP含量降低了35.2％。而出发菌株死亡率在传代到第五代时下降了8.2％，胞内ROS的增加量为93.7％，ATP含量降低了38.3％。将诱变菌株P-12-7与原出发菌株Pilsner置于自溶液中，96小时后，诱变菌株P-12-7的死亡率略小于原出发菌株Pilsner，且原出发菌株ATP值下降到35％，而诱变菌株ATP值仅下降到75％，说明诱变菌株的细胞活性较高，细胞活力稳定性更高。
实施例4抗氧化能力啤酒酵母耐受性测试
对实施例1中筛选出的抗氧化能力啤酒酵母菌株P-12-7(即为CMCC No.15504)，10-9在含有过氧化氢的平板(培养基组成：1％酵母粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖，6mM过氧化氢)上进行驯化。驯化后的诱变菌株P-12-7、10-9及原出发菌株Pilsner对过氧化氢，酒精，渗透压及细胞壁抑制剂的耐受性在平板上进行了测试。
如图7所示，诱变菌株P-12-7的YPD平板的生长能力和原出发菌株基本相近。从图8～10可以看出驯化后的诱变菌株P-12-7在含有不同浓度的过氧化氢平板中，对于过氧化氢的耐受性明显提高。图11中可看出，驯化后诱变菌株P-12-7的酒精耐受性也比原出发菌株pilsner略有提高。在图12～13中也不难看出在含有不同浓度的细胞壁抑制剂calcoflourwhite的平板上，诱变菌株P-12-7的耐受性也更好。因此，在酒精与渗透压高浓度的情况下，驯化后的诱变菌株P-12-7的生长能力与原出发菌株相近或者更好。说明氧化刺激并没有改变啤酒酵母菌株这些生理特性，因此啤酒酵母菌株P-12-7适用于工业生产。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (8)
1.啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)，已于2018年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CMCC No.15504，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.培养权利要求1所述啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)的方法，其特征在于，是将啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)接种至YPD液体培养基中，于28℃～30℃、180～220r/min培养。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述YPD培养基为：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L，pH自然，蒸馏水配置，115℃灭菌15min。
4.权利要求1所述啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)在酿造啤酒中的应用。
5.权利要求1所述啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)在制备发酵食品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述发酵食品包括以谷物为原料发酵得到的食品、酒精饮料。
7.含有权利要求1所述啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)的生物制品。
8.含有权利要求1所述啤酒酵母(Saccharomyces pastorianus)的发酵剂。
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