KR20190052438A

KR20190052438A - 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 생성 저해 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ny12-2 균주 및 이를 포함한 조성물

Info

Publication number: KR20190052438A
Application number: KR1020170148122A
Authority: KR
Inventors: 김소영; 박신영; 조용식; 길나영; 최보영
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2017-11-08
Filing date: 2017-11-08
Publication date: 2019-05-16
Also published as: KR102000475B1

Abstract

본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로 상기 균주 또는 이의 배양액은 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 생성 저해 활성이 우수하므로, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 및 이의 배양액은 발효식품 제조용 미생물 제제, 발효 식품의 스타터, 바실러스 세레우스에 대한 항균용 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

바실러스 세레우스에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민 생성 저해 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 및 이를 포함한 조성물{Bacillus amyloliquefaciens NY12-2 strain having antibiotic activity against Bacillus cereus and inhibitory activity on biogenic amine and compositions thereof}

본 발명은 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(biogenic amine)의 생성 저해 활성을 가지는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.

한국의 장류 식품인 청국장, 된장 및 간장은 우리 조상으로부터 수백 년 동안 섭취해온 음식으로서 특별한 부작용이 없는 식품이며, 항산화 효과, 혈전 용해 효과, 혈압강하 효과 등을 유발하는 각종 유익한 생리활성 물질들이 포함된 것으로 알려져 있다. 장류는 한국인의 식탁에 필수적인 부식으로서 식품으로 안전성 확보는 무엇보다도 중요한 과제이다. 장류의 발효과정에서 식품 안전을 좌우하는 주요 인자로는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 그룹이 생산하는 장 및 구토 독소, 발효 미생물들에 의해 생산되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)이 있다(Shalaby, A. R., 1996 Food Research Int. 29, 675-690).

전통 방식에 의해 제조하는 장류는 필연적으로 자연환경에 노출되는 상태로 발효가 이루어지기 때문에 발효나 숙성과정 동안 토양이나 대기의 유해 미생물들에 의해 독소가 생성될 가능성이 높다. 장의 발효에 관여하는 주된 미생물 중의 하나는 바실러스(Bacillus) 속이다. 세균으로서 바실러스 서브그룹(Bacillus subgroup)에 속하는 바실러스 마이코이드(Bacillus mycoides), 바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis)는 유해균으로 알려져 있다. 특히 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)는 중온성, 그람양성, 호기성, 내염성 및 내열성 균으로, HBL(haemolysin BL), NHE(non-hemolytic enterotoxin) 및 cytK(cytotoxin K)와 같은 설사나 장염을 일으키는 단백질을 생산할 수 있다. 또한 식품에 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 균이 오염 및 증식하여 독소(cereulide)를 생산하며, 구토를 일으키는 펩티드 형태의 안트락스(anthrax)와 유사한 호흡 질환을 유발하는 세트락스(certhrax)를 생산한다.

바실러스(Bacillus)의 감염량은 환자의 면역상태에 따라 다르나 다른 식중독균에 비해 매우 높기 때문에 정성보다는 정량이 우선시 되어 세계 각국은 바실러스(Bacillus)에 대한 정량 기준을 가지고있다. 한국에서도 바실러스(Bacillus)의 정량기준이 있어서 분유나 유아용 식품 등에서는 100 CFU(colony forming unit)/g이하, 무순이나 샐러드 등에서는 1000 CFU(colony forming unit)/g 이하, 된장 및 고춧가루 등의 조미식품에서는 10000 CFU(colony forming unit)/g 이하의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 기준을 가지고 있다.

바이오제닉 아민(biogenic amine)은 아미노산의 탈탄산 작용, 아미노기 전이작용 등의 화학적 작용에 의해 주로 생성되는 질소화합물로서, 단백질 함유 식품 내에서 미생물 또는 생화학적 활성에 의해 발생된다. 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 유리아미노산에 미생물의 아미노산 디카복실라제(amino acid decarboxylase)가 작용하여 아민(amine) 형태로 변형되면서 생성되며 세균에서는 아크로모나스(Acromonas), 바실러스(Bacillus), 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 크렙시엘라(Klebsiela), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 프로테우스(Proteus) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속 등이 아미노산 디카복실라제(amino acid decarboxylase)를 가지는 것으로 알려져있다(Taylor et al., 1983 Mar. Fish. Rev. 45, 35-39).

대표적인 바이오제닉 아민(biogenic amine)으로는 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine) 및 세로토닌(serotonin) 등이 있다. 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 인체의 생리 기능을 유지하기 위한 필수 물질로, 체내에서 신경전달 물질로 직간접적으로 작용하고 혈압조절 및 혈류 등의 심혈관계 질환에도 영향을 미치므로, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 함유 식품의 섭취로 여러가지 약리적인 현상이 나타날 수 있다. 상기와 같은 효과를 가지는 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 체내에서 미량이 대사 과정을 통해 균형을 이루고 있지만 식품에서 과량 섭취시에는 독성을 나타낸다. 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 히스타민(histamine)의 과잉 섭취는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등을 유발하며, 티라민(tyramine)은 혈압 상승, 동공과 눈꺼풀 조직을 확장시켜 눈물의 분비 촉진, 타액의 과다분비 및 편두통을 유발하고, 카다베린(cadaverine)과 퓨트레신(putrescine)은 장에서 강력한 발암물질인 니트로사민(nitrosamines), 니트로소피페리딘(nitrosopiperidine) 및 니트로소피롤리딘(nitrosopyrrolidine)을 생성할 수 있다. 이런 바이오제닉 아민의 위해성 때문에 유럽연합(EU)은 2008년부터 2011년까지 치즈, 포도주, 소시지 등의 유럽 전통 발효 식품들을 대상으로 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 감소시키기 위한 프로젝트를 수행하였다.

단백질 함량이 높은 콩, 프로테아제(proteases) 활성이 높은 바실러스(Bacillus) 및 아스퍼질러스(Aspergillus)속에 의한 발효, 미혐기적 환경 및 적당한 발효 온도를 고려할 때, 장류는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하기 적당한 환경이라고 할 수 있다. 실제로 2006년 국내 유통 발효 식품 중에 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분포를 조사한 결과에 따르면 전통 된장의 퓨트레신(putrescine) 함량은 99.6~1453.7(평균 462.6)mg/kg, 히스타민(histamine)은 260.1~952(평균 569.4)mg/kg, 티라민(tyramine)은 284.7~1430.7(평균 669.5)mg/kg으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았고, 그 다음으로 멸치 젓갈, 현대식 간장, 재래식 간장, 현대식 된장 순이었다. 한국인 식단 중 바이오제닉 아민(biogenic amine) 함량이 가장 높은 식품 7종 중 4종이 장류이고, 식단 특성상 장류 사용량이 젓갈보다 더 많다는 것을 고려하면, 장류는 식품 섭취 시 바이오제닉 아민(biogenic amine)의 주 공급원으로 건강에 위해를 줄 수 있는 수준임을 나타낸다. 앞으로 전통 장류는 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들에 대한 항균활성이 있으며, 바이오제닉 아민(biogenic amine) 저감화를 통한 식품 안전성을 동시에 확보할 수 있는 균주의 개발이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 KFDA에 GRAS (generally recognized as safe) 균주로서, 장류의 제조에 허용될 수 있는 저영양성 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 장류로부터 분리하고, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주가 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 생성 저해 활성이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 전통 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 생성 저해 활성이 우수한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주 및 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 (Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 발효식품 제조용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법으로 제조된 발효식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 제어방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주 또는 이의 배양액은 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)에 대한 생성 저해 활성이 우수하므로, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 및 이의 배양액은 발효식품 제조용 미생물 제제, 발효 식품의 스타터, 바실러스 세레우스에 대한 항균용 조성물 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 접종하여 제조한 된장과 대조군 된장의 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 균 계수 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 접종하여 제조한 된장과 대조군 된장의 NF-κB 활성을 측정한 결과이다.
도 3은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 접종하여 제조한 된장과 대조군 된장의 산화질소 활성을 측정한 결과이다.
도 4는 자연 발효시킨 팥 메주 및 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 접종하여 발효시킨 팥메주를 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주(이하 12-2 균주)를 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 된장으로부터 시료를 채취하고, 바실러스 세레우스 항균 활성 및 바이오제닉 아민 생성 저해 활성을 가지는 균주를 선별한 후, 16S rRNA 분석을 수행하였다. 그 결과를 NCBI 젠뱅크(Genebank) 데이터베이스의 염기서열과 비교하여 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(99% 일치)임을 확인하였다. 상기 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주로 명명하고 국립농업과학원(KACC)에 2017년 9월 21일자로 기탁하여 수탁번호 KACC 92193P를 부여받았다.

상기 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 가질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 바실러스 세레우스와 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 혼합 배양한 실험에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주가 바실러스 세레우스를 저해함을 확인하였다(표 1 및 표 2 참조).

또한, 본 발명자들은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 접종하여 제조한 된장에서 균주를 접종하지 않고 제조한 된장(대조군)보다 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성이 더 우수함을 확인하였다(도 1 참조).

상기 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine) 생성 저해 활성을 가질 수 있다. 상기 바이오제닉 아민은 퓨트레신(putrescine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 카다베린(cadaverine), 스퍼미딘(spermidine), 세로토닌(serotonin)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나의 바이오제닉 아민인 것이 바람직하며, 히스타민 또는 티라민인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 히스타민과 티라민의 전구체인 히스티딘(histidine) 또는 티로신(tyrosine)이 포함된 배지에서 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 배양하는 경우, 균주를 처리하지 않은 무처리 배지보다 히스타민과 티라민의 함량이 감소하는 것을 확인함으로써 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주는 바이오제닉 아민 생성 저해 활성을 가짐을 확인하였다(표 3 및 표 4 참조).

또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 발효식품 제조용 미생물 제제를 제공한다.

본 발명의 미생물 제제은 통상적인 미생물 제제 제조방법에 따라 제조될 수 있으며, 일반적으로, 배양현탁액이나 건조분말 형태일 수 있다. 또한, 주성분인 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주, 또는 이의 배양액의 유효량에 1종 또는 2종 이상의 약제학적으로 허용 가능한 통상적인 담체 또는 1종 또는 2종 이상의 첨가제를 선택하여 통상적인 제형의 조성물로 제조할 수 있다.

담체는 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 방부제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 항산화제 중에서 1종 또는 2종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 사용이 가능하며, 구체적으로는 희석제로는 유당(lactose monohydrate), 옥수수 전분(cornstarch), 콩기름(soybean oil), 미결정 셀룰로오스(microcrystalline cellulose) 또는 만니톨(D-mannitorl)이 좋고, 활택제로는 스테아린산 마그네슘(magnesiumstearate) 또는 탈크(talc)가 바람직하며, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈(PVP: polyvinyipyrolidone) 또는 하이드록시프로필셀룰로오스(HPC: hydroxypropylcellulose) 중에서 선택함이 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메칠셀룰로오스칼슘(Ca-CMC: carboxymethylcellulose calcium), 전분글리콜산나트륨(sodium starchglycolate), 폴라크릴린칼륨(polacrylin potassium) 또는 크로스포비돈(cross-linked polyvinylpyrrolidone)중에서 선택함이 바람직하고, 감미제로는 백당, 과당, 소르비톨(sorbitol) 또는 아스파탐(aspartame) 중에서 선택되고, 안정제로는 카르복시메칠셀룰로오스나트륨(Na-CMC: carboxymethylcellulose sodium), 베타-싸이크로덱스트린(β-cyclodextrin), 백납(white bee's wax) 또는 잔탄검(xanthan gum) 중에서 선택되며, 방부제로는 파라옥시안식향산메칠(methyl p-hydroxy benzoate, methlparaben), 파라옥시안식향산프로필(propyl p-hydroxybenzoate, propylparaben), 또는 소르빈산칼륨(potassium sorbate) 중에서 선택하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법 및 상기 방법으로 제조된 발효식품을 제공한다.

본 발명에서 용어 "스타터(starter)"란 식품의 발효에 관여하는 미생물을 포함하는 제제로, 발효식품 제조 시 첨가함으로써 숙성된 식품에서 지배적으로 생장하는 미생물을 말한다.

상기 발효식품은 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 식품인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.

상기 발효식품은 더덕 분말, 도라지 분말, 팥 분말 또는 쌀 분말을 더 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 또는 이의 배양액을 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 제어방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 또는 이의 배양액을 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 면역 증강용 발효식품의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물을 제공한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 접종하여 된장을 제조한 결과, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성과 면역 활성과 관련있는 NF-κB 및 산화질소(NO)의 활성이 균주를 접종하지 않고 제조한 된장(대조군)보다 우수함을 확인하였다(도 2 및 3 참조).

따라서, 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 또는 이의 배양액을 발효식품에 처리함으로써, 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)를 제어할 수 있으며, 면역 증강용 발효식품을 제조할 수 있다.

또한, 기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 신규한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 또는 이의 배양액은 바실러스 세레우스에 대한 항균 용도로 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 바실러스 세레우스( Bacillus cereus )를 저해하는 균주 선별

시판 된장 1 g을 채취하여 TSA 배지에 도말하고 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 전형적인 바실러스(Bacillus) 속으로 판단되는 탈수되어 있는 집락을 형성한 균을 기준으로 하여 총 62종의 균을 선별하였다.

< 실시예 1-1> 1차 선별

선별된 균주 62종을 LB배지(Luria-Bertani broth)에 접종하여 30℃에서 O.D 값 0.5가 되도록 배양하였다. 바실러스 세레우스는 LB 배지에 접종하여 30℃에서 O.D 값 0.5가 되도록 배양한 후, 배양액을 10배 희석하였다. 10배 희석된 배양액을 TSA(Tryptic soy agar) 배지에 도포하였다. 선별 균주 62종 각각을 페이퍼 디스크(paper disc)에 70 ㎕씩 로딩하고, 이를 TSA 배지 위에 올린 후 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 바실러스 세레우스의 성장이 저해되는 구역(Clear zone)을 확인하고, 저해하는 구역이 나타나지 않을 경우 -, 저해하는 구역이 나타나면서 면적의 지름이 1.0 cm 이하일 경우 +, 1.0 ~ 1.3 cm 일 경우 ++, 1.3 cm 이상 일 경우 +++로 나타내었다(표 1).

62종 균주 중 바실러스 세레우스를 저해하는 것으로 확인된 16종(6-1, 12-2, 15-1, 19, 25, 31, 45, 54-1, 55-1, 62-1-1, 62-1-2, 62-2, 82-1, 95-1-1, 95-1-2 및 95-2)의 균주를 선별하였다.

균주 시료명	실시예 1-1 (disc법)
균주 시료명	1회	2회	3회
4	-
5	-
6-1	+	++	+
6-2	-
10-1	-
10-2	-
12-1	-
12-2	++	++	+
15-1	+	++	++
15-2	-
15-3	-
19	+	+	+
23	-
25	++	+	+
30-1	-
30-2	-
31	+	-	+
32	-
35	-
39-1	-
39-2	-
41	-
42-1	-
42-2	-
44	-
45	+	-	-
46-1	-
46-2	-
48	-
50	-
54-1	++	++	+
54-2	-
55-1	+	-	-
55-2	-
55-3	-
56	-
60-1	-
60-2	-
61	-
62-1-1	++	-	+++
62-1-2	++	-	++
62-2	++	-	-
63-1	-
63-2	-
64	-
65-1	-
65-2	-
66	-
68-1	-
68-2	-
70-1	-
70-2	-
70-3	-
71-1	-
71-2	-
78	-
82-1	++	-	-
82-2	-
82-3	-
95-1-1	++	++	++
95-1-2	++	++	-
95-2	++	++	++

<실시예 1-2> 2차 선별

바실러스 세레우스 5%(O.D=0.5)와 16종의 선별 균주 10%(O.D=0.5)를 TSB(Tryptic soy broth) 배지에 혼합 접종하였다. 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 바실러스 세레우스 선택배지(CHROMagar)에 분주하여 이를 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후, 공동배양한 배지에서의 바실러스 세레우스 균수와 바실러스 세레우스만 단독 배양한 배지에서의 바실러스 세레우스 균수를 계수하여 바실러스 세레우스의 감소율을 계산하였다.

실시예 1-2를 통해 바실러스 세레우스 균주의 감소율이 높은 상위 5개의 12-2, 25, 31, 45 및 62-1-2 균주를 선별하였다.

균주 시료명	실시예 1-2
균주 시료명	공동배양 시 바실러스 세레우스 감소율(%)
6-1	9.11
12-2	48.56
15-1	-13.19
19	-2.87
25	48.56
31	48.56
45	48.56
54-1	-25.18
55-1	-30.34
62-1-1	-1.21
62-1-2	48.56
62-2	-1.21
82-1	-1.21
95-1-1	-16.21
95-1-2	-13.19
95-2	-24.39

< 실시예 2> 바이오제닉 아민 ( biogenic amine) 생성을 저해하는 균주 선별

< 실시예 2-1> 1차 선별

선별된 균주 62종을 TSB 배지 또는 LB 배지에 접종하여 30℃에서 O.D 값 0.5가 되도록 배양하였다. 1% 히스티딘(histidine) 및 1% 티로신(tyrosine)을 각각 첨가한 모엘레르 디카르복실라아제 평판 배지(Moeller decarboxylase agar)를 준비하고, 62종의 균주 배양액을 각각 10 ㎕씩 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 보라색으로 변한 부분이 없거나 색이 변화된 구역의 지름이 1.0 cm 이하인 경우 +로 표시, 1.0 cm 이상인 경우 -로 표시하였다(표 3).

각각의 히스티딘과 티로신 배지에서 모두 +로 결과가 나타난 상위 5개 균, 6-1, 12-2, 15-1, 62-2 및 63-1 균주를 선발하였다.

균주 시료명	히스티딘 배지	티로신 배지
4	-	-
5	-	-
6-1	+	+
6-2	-	-
10-1	-	-
10-2	-	-
12-1	+	-
12-2	+	+
15-1	+	+
15-2	-	-
15-3	-	-
19	-	-
23	-	-
25	-	+
30-1	-	-
30-2	-	-
31	-	-
32	-	-
35	-	-
39-1	-	-
39-2	-	-
41	-	-
42-1	-	-
42-2		-
44	-	-
45	-	+
46-1	-	-
46-2	-	-
48	-	-
50	-	-
54-1	-	-
54-2	-	-
55-1	-	-
55-2	-	-
55-3	-	-
56	-	-
60-1	-	-
60-2	-	-
61	-	-
62-1-1	-	+
62-1-2	-	+
62-2	+	+
63-1	+	+
63-2	-	-
64	-	-
65-1	-	-
65-2	-	-
66	-	-
68-1	-	-
68-2	-	-
70-1	-	-
70-2	-	-
70-3	-	-
71-1	-	-
71-2	-	-
78	-	-
82-1	-	-
82-2	-	-
82-3	-	-
95-1-1	-	-
95-1-2	-	-
95-2	-	-

< 실시예 2-2> 2차 선별

2차 선별은 실시예 2-1에서 선별한 균주 5종과 실시예 1-2에서 최종적으로 선별한 바실러스 세레우스를 저해하는 균주 5종을 대상으로 수행하였다. 중복되는 균주 1종을 제외하면 총 9개의 균주에 대하여 바이오제닉 아민의 생성 저해 활성을 평가하였다.

9 종의 균주를 각각 TSB배지 또는 LB배지에 접종하여, 30℃에서 O.D 값 0.5가 되도록 배양하였다. 1% 히스티딘(histidine) 및 1% 티로신(tyrosine)을 각각 첨가한 모엘레르 디카르복실라아제 배지(Moeller decarboxylase broth)에 각 균주를 5% 접종하여 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 흡광도(540 nm)를 측정하여 히스타민과 티라민의 양을 확인하였고, 히스티딘 및 티로신 배지에 균주를 처리하지 않은 무처리 배지와 비교하여 감소율을 산출하였다(표 4). 최종 선별된 12-2 균주는 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성을 가지면서 히스타민 감소율이 가장 높은 균주인 것으로 나타났다(표 2 및 4 참조).

아래 표 4는 균주 9종에 대한 히스타민과 티라민의 감소율을 나타낸 것이다.

균주 시료명	히스타민 감소율 (%)	티라민 감소율 (%)
6-1	62.50	19.85
12-2	81.73	13.74
15-1	75.24	-14.50
25	-26.67	32.33
31	30.77	12.98
45	54.37	25.76
62-1-2	30.77	28.79
62-2	26.92	19.85
63-1	64.15	12.31

< 실시예 3> 12-2 균주의 동정

실시예 2에서 최종 선별된 12-2 균주를 확인하기 위하여, 16s rRNA 염기서열 분석을 수행하였다.

구체적으로, 16s rRNA의 유니버설 프라이머(universal primer)인 서열번호 1의 염기서열을 갖는 27F 프라이머(5'-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3') 및 서열번호 2의 염기서열을 갖는 1492R 프라이머(5'-GGATACCTTGTTACGACTT-3')를 이용하여 분리 균의 16S rDNA 유전자 단편을 중합효소 연쇄반응(PCR)으로 증폭시켰다. PCR 산물의 염기서열(서열번호 3)을 분석하고, NCBI/젠뱅크 뉴클레오티드 데이타베이스(GeneBank Nucleotide Database)를 통해 상동성을 비교하여 12-2 균주를 동정하였다.

그 결과, 본 발명의 12-2 균주는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스와 99%의 상동성을 나타내는 균주로 확인되어, 본 발명의 12-2 균주를 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주로 명명하였다.

< 실시예 4> 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 발효식품 제조

< 실시예 4-1> 팥 메주 제조

쌀, 콩 및 팥을 물에 약 15시간 동안 침지하였다. 이 후 쌀은 분쇄하여 200℃에서 20분 동안 찌고, 콩과 팥은 200℃에서 60분 동안 삶았다. 상기의 방법으로 제조된 찐쌀가루 2 kg, 삶은 콩 4 kg 및 삶은 팥 3 kg을 혼합하고 분쇄한 후, 황국균(Aspergillus oryzae, 10⁷ spore/mL)과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주(O.D 값 = 1.0)를 상기 쌀, 콩 및 팥의 혼합물 대비 1.5 내지 3.0 %로 접종하였다.

접종 후 상기 혼합물을 지름 7 cm의 구 형태로 성형하고, 건조기를 이용하여 18시간 동안 겉말림하였다. 그 다음 7 내지 8일 동안 온도 30℃, 상대습도 70%에서 발효시켜 팥 메주를 제조하였다(도 4의 (B)).

도 4의 (A)는 자연 발효시킨 팥 메주를 나타낸 것이고, 도 4의 (B)는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2(Bacillus amyloliquefaciens NY12-2) 균주를 접종하여 발효시킨 팥메주를 나타낸 것이다.

< 실시예 4-2> 팥 메주 고추장 제조

실시예 4-1에서 제조된 팥 메주를 분쇄하여 얻은 메주가루 2 kg에 고두밥 2 kg, 엿기름 0.75 kg, 고두밥 대비 0.5%의 액화효소(비전바이오) 및 물 7.5 L를 가하여 당화하였다. 상기 당화액에 소금 1.2 kg, 고춧가루 2.5 kg 및 물 3 L를 넣고 혼합하여 팥 메주 고추장을 제조하였다.

< 실시예 4-3> 된장 제조

메주가루 600 g에 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주(O.D 값 1.0)를 메주가루 대비 1% 로 접종하고, 더덕분말 30 g, 도라지분말 30 g, 소금 200 g, 물 860 mL을 첨가하여 30℃에서 56일(8주) 동안 발효시켰다. 발효가 완료된 후 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 첨가한 된장을 얻었다.

< 실시예 5> 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 된장의 바실러스 세레우스 저해 활성 평가

실시예 4-3에서 제조한 된장과 균주를 처리하지 않은 된장(대조군)을 각각 1 g 채취하여, 이를 10진 희석하여 CHROMagar Bacillus cereus 배지에 도말하고 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 바실러스 세레우스를 계수하였다. 도 1은 발효 0주차와 2주차에 각 된장에서 채취한 바실러스 세레우스의 균 계수 결과를 나타낸 것이다. 실시예 4-3의 된장(12-2로 표시)의 경우, 대조군보다 0주차에서부터 바실러스 세레우스를 저해하는 것으로 나타났으며, 발효가 진행됨에 따라 저해 효과가 증가하는 경향을 보였다.

< 실시예 6> 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 된장의 바이오제닉 아민 생성 저해 활성 평가

실시예 4-3에서 제조한 된장과 균주를 처리하지 않은 된장(대조군)을 각각 1 g 채취하여, 바이오제닉 아민 생성 저해 활성을 평가하였다. 바이오제닉 아민 저감율은 1% 히스티딘(histidine) 및 1% 티로신(tyrosine)을 각각 첨가한 모엘레르 디카르복실라아제 평판 배지(Moeller decarboxylase agar)에 된장 추출액을 각각 10 ㎕씩 접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양하였다. 대조군으로는 히스티딘 및 티로신 배지에 균주를 처리하지 않은 무처리 배지로 설정하였다.

배양 후, 배지에 보라색으로 변한 부분이 없거나 색이 변화된 구역의 지름이 1.0 cm 이하인 경우 +로 표시, 1.0 cm 이상인 경우 -로 표시하였다(표 5). 대조군과 실시예 4-3에서의 된장의 바이오제닉 아민 감소율은 큰 차이를 보이지 않았다.

시료명	히스티딘 배지	티로신 배지
대조군	+	+
12-2 균주	+	+

< 실시예 7> 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 된장의 NF -κB 활성 평가

실시예 4-3에서 제조한 된장과 균주를 처리하지 않은 된장(대조군)을 각각 20 g 채취하고 증류수로 10배 희석하여 균질, 여과, 멸균한 후 대식세포(RAW Blue cell, 인비보젠)와 함께 DMEM(dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양 후, Quanti-blue 지시약을 처리하여 NF-κB 활성을 평가하였다.

도 2는 발효 0주차와 4주차 된장을 대상으로 평가한 대식세포의 NF-κB 활성을 나타낸 것이다. 발효 0주차에서는 대조군과 실시예 4-3의 된장(12-2로 표시)과의 NF-κB 활성에 큰 차이가 없었으나, 발효 4주차에서는 실시예 4-3의 된장에서의 NF-κB 활성이 크게 증가하여, 양성 대조군인 LPS(Lipopolysaccharide)와 유사한 수준인 것으로 나타났다.

< 실시예 8> 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 된장의 산화질소(Nitric oxide, NO) 활성 평가

실시예 4-3에서 제조한 된장과 균주를 처리하지 않은 된장(대조군)을 각각 20 g 채취하고 증류수로 10배 희석하여 균질, 여과, 멸균한 후 대식세포(RAW Blue cell, 인비보젠)와 함께 DMEM(dulbeco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였다. 배양 후, Griess 시약을 첨가하여 산화질소 활성을 평가하였다.

도 3는 발효 0주차와 4주차 된장을 대상으로 평가한 대식세포의 산화질소 활성을 나타낸 것이다. 발효 0주차에서는 대조군과 실시예 4-3의 된장(12-2로 표시)과의 산화질소 활성에 큰 차이가 없었으나, 발효 4주차에서는 실시예 4-3의 된장에서의 산화질소 활성이 크게 증가하였다.

농업생명공학연구원

KACC92193P

20170921

<110> REPUBLIC OF KOREA (MANAGEMENT: RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> Bacillus amyloliquefaciens 12-2 strain having antibiotic activity against Bacillus cereus and inhibitory activity on biogenic amine and compositions thereof <130> 2017P-09-042 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA universal primer 27F <400> 1 agagtttgat catggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16s rRNA universal primer 1492R <400> 2 ggataccttg ttacgactt 19 <210> 3 <211> 1396 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefaciens <400> 3 caggacgaac gctggcggcg tgcctaatac atgcaagtcg agcggacaga tgggagcttg 60 ctccctgatg ttagcggcgg acgggtgagt aacacgtggg taacctgcct gtaagactgg 120 gataactccg ggaaaccggg gctaataccg gatggttgtt tgaaccgcat ggttcagaca 180 taaaaggtgg cttcggctac cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga 240 ggtaacggct caccaaggcg acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg 300 ggactgagac acggcccaga ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga 360 cgaaagtctg acggagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg 420 ttgttaggga agaacaagtg ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga 480 aagccacggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg 540 gaattattgg gcgtaaaggg ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg 600 ctcaaccggg gagggtcatt ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat 660 tccacgtgta gcggtgaaat gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc 720 tctggtctgt aactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 780 tggtagtcca cgccgtaaac gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc 840 tgcagctaac gcattaagca ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag 900 gaattgacgg gggcccgcac aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag 960 aaccttacca ggtcttgaca tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg 1020 cagagtgaca ggtggtgcat ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc 1080 ccgcaacgag cgcaaccctt gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga 1140 ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac 1200 ctgggctaca cacgtgctac aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc 1260 caatcccaca aatctgttct cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg cgtgaagctg 1320 gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380 accgcccgtc acacca 1396

Claims

기탁번호 KACC 92193P로 기탁된 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY12-2 균주.
청구항 1에 있어서,
상기 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균 활성을 가지는 균주.
청구항 1에 있어서,
상기 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine) 생성 저해 활성을 가지는 균주.
청구항 3에 있어서,
상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 균주.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 발효식품 제조용 미생물 제제.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 스타터(starter) 균주로 이용하여 발효식품을 제조하는 방법.
청구항 6의 방법으로 제조된 발효식품.
청구항 7에 있어서,
상기 발효식품은 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 발효식품.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 제어방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 발효식품에 처리하는 단계를 포함하는 면역 증강용 발효식품의 제조방법.
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)에 대한 항균용 조성물.