KR102351877B1 - 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ny12-2 균주를 이용한 기능성 장류의 제조방법 - Google Patents

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 ny12-2 균주를 이용한 기능성 장류의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 기능성 메주의 속성 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 의하면, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용함으로써 속성으로 메주, 된장 등의 장류를 제조하여 제조기간을 단축함에도, 전통 메주 및 된장 등의 장류의 특유의 맛과 향미를 유지할 수 있고, 나아가 생산되는 제품의 기능성을 개선시킬 수 있다.

Description

바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 기능성 장류의 제조방법{Preparation method for functional soybean paste using Bacillus amyloliquefaciens NY12-2 strain}
본 발명은 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용한 기능성 장류의 제조방법에 관한 것이다.
메주는 대두를 주원료로 하여 찌거나 삶은 후 성형하여 발효시킨 한식 메주와 대두를 주원료로 하여 원료를 찌거나 삶은 후 선별된 종균을 접종하여 발효시킨 개량 메주로 분류되며(식품공전, 2014년 10월 21일 고시), 전통 발효식품인 간장, 된장, 고추장 등 각종 장류의 원료이다. 메주 제조에 사용되는 대두는 수분 8.6 ％, 단백질 40 ％, 지방 18 ％, 섬유질 3.5 ％, 회분 4.6 ％, 펜토산 4.4％ 및 당분 7％ 등이 함유되어 있어 영양적으로 매우 우수할 뿐만 아니라, 양질의 식물성 단백질을 다량 함유하고 있기 때문에, 동맥경화, 심장질환이 염려되는 사람도 먹을 수 있으며, 혈액의 흐름을 원활하게 하는 등 기능성도 매우 뛰어나다. 대두에 함유되어 있는 이소플라본(isoflavon) 중 제니스타인(genistein) 등은 암세포의 증식을 감소시키고, 정상 세포의 분열을 촉진하는 항암작용을 나타내며, 이소플라본의 유도체인 이프리플라본(iprifiavone)은 뼈의 재흡수를 저해하고 동시에 뼈의 밀도를 높여 골다공증을 예방하는 효과를 나타내는 것으로 알려졌다. 대두의 이러한 유효성분들은 메주를 띄워 된장, 간장 등으로 발효되는 과정에서도 그대로 잔존하게 되며, 여기에 덧붙여 황국균(A. oryzae)등 여러 미생물의 작용으로 단백질이 분해되어 각종 아미노산이 생성되며, 일부 아미노산류와 당류와의 반응에 의해 멜라노이딘(melanoidin) 상의 물질 등 새로운 항산화성 물질이 생성된다. 대두의 폴리페놀류와 발효과정 중에 생성되는 멜라노이딘 상의 물질들은 간장, 된장 내에 존재하는 리놀레산(linoleic acid) 등의 불포화 필수지방산의 산패를 방지한다.
기존의 재래식 전통 메주 제조방법은 먼저 콩을 증자한 다음 파쇄하고 일정한 모양으로 성형하여 띄우는 것이다. 이러한 과정에서 공기 중 부유균의 오염으로 인하여 푸른 곰팡이, 검은 곰팡이 등의 유해 곰팡이와 각종 유해 세균이 생육하여 메주의 품질을 저하시킬 수 있는 등의 문제점이 있었다.
또한, 상기 재래식 전통 메주 및 이를 활용한 장류 제조 방법은 일반적으로 증자된 대두를 벽돌모양이나 타원형으로 크게 성형하여 볏짚으로 엮어서 대기중에 1~3개월 정도 매달아 방치하고, 2~3개월 정도 소금물에 염지한 후 장가름을 하여 건더기는 된장으로 소금물은 간장으로 만드는 방법으로, 이는 최소 1년 이상의 제조기간이 소요된다.
그리고, 식중독균인 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)가 볏짚으로 묶어서 발효를 한 전통 장류에서 법적 규격(1×104 미만) 이상으로 증식하는 문제점이 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 장류의 제조 과정에서 발효 및 숙성기간을 단축하면서도 장류의 품질 및 관능성을 유지시킬 수 있는 방법을 개발하고자 노력한 결과, 대두를 바실러스 균주, 특히 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주로 발효시키는 경우에, 발효 및 숙성기간을 단축하면서도 식품의 안전성을 유지할 수 있고 맛품질의 편차가 최소화되며 장류의 기능성을 유지할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
KR 10-2000475 B
본 발명은 생산되는 제품마다 기능성 및 향미를 일정 수준 이상으로 유지시키면서도 메주, 된장 등의 장류를 속성으로 제조하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (1) 증숙한 대두에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY12-2 균주(수탁번호 KACC 92193P)를 접종하는 단계; (2) 상기 균주를 접종한 대두를 쵸핑한 후 성형하는 단계; (3) 상기 성형된 메주를 30 내지 65 ℃에서 5 내지 24 시간 동안 겉말림하는 단계; 및 (4) 상기 겉말림한 메주를 25 내지 35 ℃에서 2 내지 10일 동안 발효하여 메주를 수득하는 단계;를 포함하는 기능성 장류의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 상기 증숙한 대두의 총중량 대비 0.1 내지 3 중량%가 되도록 접종할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (3) 단계는 상기 성형된 메주를 40 내지 50 ℃에서 2 내지 20 시간 동안 1차 겉말림하는 단계; 상기 1차 겉말림한 메주를 55 내지 65 ℃에서 0.5 내지 4 시간 동안 2차 겉말림하는 단계; 상기 2차 겉말림한 메주를 30 내지 35 ℃에서 0.5 내지 4 시간 동안 3차 겉말림하는 단계; 및 상기 3차 겉말림한 메주를 40 내지 50 ℃에서 2 내지 20 시간 동안 4차 겉말림하는 단계;를 포함하는 방법으로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (4) 단계에서 수득한 메주에 염수를 첨가한 후 10 내지 40 ℃에서 2 내지 20주 동안 숙성시켜 된장을 수득하는 단계;를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 염지한 메주 100 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량부의 고추씨 분말을 더 추가하여 숙성시킬 수 있다.
본 발명에 의하면, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용함으로써 속성으로 메주, 된장 등의 장류를 제조하여 제조기간을 단축함에도, 전통 메주 및 된장 등의 장류의 특유의 맛과 향미를 유지할 수 있고, 나아가 생산되는 제품의 기능성을 개선시킬 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 (1) 증숙한 대두에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY12-2 균주(수탁번호 KACC 92193P)를 접종하는 단계; (2) 상기 균주를 접종한 대두를 쵸핑한 후 성형하는 단계; (3) 상기 성형된 메주를 30 내지 65 ℃에서 5 내지 24 시간 동안 겉말림하는 단계; 및 (4) 상기 겉말림한 메주를 25 내지 35 ℃에서 2 내지 10일 동안 발효하여 메주를 수득하는 단계;를 포함하는 기능성 장류의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명자들은 장류를 속성으로 제조하면서도 기능성 및 관능성을 유지시킬 수 있는 방법을 모색한 결과, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용하면 메주의 제조 과정에서 발효 및 숙성기간을 대폭 단축하여도 기능성 및 관능성 등의 품질 저하가 나타나지 않음을 발견하였고, 또한, 바실러스 세레우스와 같은 식중독균의 증식이 억제되어 제품의 안전성에도 문제가 없음을 확인하였다. 또한, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용하여 제조한 메주로 장류를 제조하는 과정에서 발효 및 숙성기간을 대폭 단축하여도 장류의 기능성 및 관능성 등의 품질 저하가 유의적으로 나타나지 않음을 발견하였다.
본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY12-2 균주(수탁번호 KACC 92193P)는 전통 장류의 발효시 문제되는 독소 생산 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)균의 증식을 효율적으로 억제하고, 발효과정 중 생성되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)의 생성을 저해하는 활성이 우수하다(한국등록특허공보 제10-2000475호 참조).
일 구현예에서, 상기 장류는 메주, 된장, 청국장, 간장, 고추장 등의 발효식품이 포함될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계에서는 증숙한 대두에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY12-2 균주(수탁번호 KACC 92193P)를 접종한다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주는 균주 자체로 첨가되거나 배양액으로 첨가될 수 있다. 상기 배양액은 균주를 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 농축한 농축액 등을 포함할 수 있다.
상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주는 상기 증숙한 대두의 총중량 대비 0.1 내지 3 중량%, 바람직하게는 0.5 내지 2 중량%, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.5 중량%가 되도록 접종될 수 있다.
균주의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 상기 균주의 접종으로 인해 기대되는 효과가 미미해지고, 상기 상한치 초과인 경우에는 장류의 관능성이 저하될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (2) 단계에서는 상기 균주를 접종한 대두를 쵸핑한 후 성형한다.
본 발명에서, 쵸핑(Chopping)은 대두를 작은 크기로 분쇄하는 공정을 의미하며, 그 크기는 특별히 제한되지 않는다.
상기 쵸핑을 통해 발효 및 숙성시키는 단계에 소요되는 기간을 단축하고 장류 제조 공정을 간소화할 수 있다.
메주의 성형 형태는 직육면체, 정육면체, 원기둥 모양, 도너츠 모양, 둥근 타원형, 공 모양 등 덩어리 형태의 입체적인 모양을 모두 포함하는 형태로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 상기 메주는 100g 내지 5kg의 중량을 가지는 직육면체일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (3) 단계에서는 상기 성형된 메주를 30 내지 65 ℃, 바람직하게는 40 내지 50 ℃에서 5 내지 24 시간 동안 겉말림한다.
상기 겉말림은 메주 외부의 수분을 단시간에 건조시킴으로써 발효기간 중 공기 중의 유해 미생물에 의한 외부 오염 및 증식을 억제하는 효과가 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 겉말림 단계는, 상기 성형된 메주를 40 내지 50 ℃, 바람직하게는 45 내지 50 ℃에서 2 내지 20 시간 동안 1차 겉말림하는 단계; 상기 1차 겉말림한 메주를 55 내지 65 ℃, 바람직하게는 60 내지 65 ℃에서 0.5 내지 4 시간 동안 2차 겉말림하는 단계; 상기 2차 겉말림한 메주를 30 내지 35 ℃에서 0.5 내지 4 시간 동안 3차 겉말림하는 단계; 및 상기 3차 겉말림한 메주를 40 내지 50 ℃, 바람직하게는 45 내지 50 ℃에서 2 내지 20 시간 동안 4차 겉말림하는 단계;를 포함하는 방법으로 수행하는 것이 메주의 기능성 및 관능성 개선 면에서 더욱 바람직하다. 상기 방법으로 겉말림한 메주로 장류를 제조하는 경우 장류의 기능성이 증대되고, 이취 및 풍미가 더욱 개선되는 효과가 있다. 상기 1차 내지 4차 겉말림 단계를 순차적으로 수행하지 않거나 하나의 단계라도 수행하지 않는 경우에는 기대하는 효과를 달성하지 못할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (4) 단계에서는 상기 겉말림한 메주를 25 내지 35 ℃, 바람직하게는 25 내지 30 ℃에서 2 내지 10일, 바람직하게는 3 내지 8일, 더욱 바람직하게는 3 내지 6일, 더욱 바람직하게는 4 내지 5일 동안 발효하여 메주를 수득한다. 상기 온도 하한치 미만에서는 발효 균주의 생육이 충분치 못하여 대두의 단백질 및 탄수화물 분해를 통한 아미노태질소 함량 및 산도의 하락이 충분치 못할 수 있고, 상기 온도 상한치를 초과하는 경우에는 발효 균주의 성장 및 발효 속도는 증진되지만 초기 바이오제닉 아민 함량이 증가할 수 있다. 상기 발효 기간의 하한치 미만에서는 발효 균주의 생육이 충분치 못할 수 있고, 상한치를 초과하는 경우에는 이취 성분이 증가할 수 있다.
본 발명은, 상기 (4) 단계에서 수득한 메주에 염수를 첨가한 후 10 내지 40 ℃, 바람직하게는 15 내지 30 ℃에서 2 내지 20주, 바람직하게는 4 내지 18주, 더욱 바람직하게는 8 내지 16주, 더욱 바람직하게는 10 내지 14주 동안 숙성시켜 된장을 수득하는 단계;를 추가로 수행할 수 있다. 상기 온도 하한치 미만에서는 숙성시키는 단계가 길어지고, 전통 된장 고유의 향미의 발현이 충분하지 못할 수 있으며, 상기 온도 상한치를 초과하는 경우에는 바이오제닉 아민의 함량이 증가하고, 이취의 생성이 증가할 수 있다. 상기 숙성 기간의 하한치 미만에서는 전통 된장 고유의 향미의 발현이 충분하지 못할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 메주에 첨가되는 염수는 20 내지 30%(w/w), 바람직하게는 23 내지 26 %(w/w) 농도의 염수일 수 있다.
일 구체예에서, 본 발명은 상기 메주에 1 내지 3배 중량, 바람직하게는 1.5 내지 2.5배 중량의 염수를 첨가하여 염지 없이 숙성시킬 수 있다. 이로써 효소와 지미 성분의 유출이 없기 때문에, 전통의 풍미를 유지하고 숙성 기간을 1/2 ~ 1/3까지 단축시키면서 전통 장류에 비해 지미 성분이 높은 된장을 제조할 수 있게 된다.
다른 구체예에서, 본 발명은 상기 메주에 1 내지 3배 중량, 바람직하게는 1.5 내지 2.5배 중량의 염수를 첨가한 후 5 내지 20일간 염지하고 염수를 분리하는 공정을 수행한 후 숙성시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 염수는 정제염 또는 천일염이 18 ~ 30%(w/w)로 포함된 염수일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기와 같이 제조된 된장은 깊은 풍미를 나타내기 위하여 항아리에 담아 5 내지 30 ℃에서 1 내지 3년 동안 숙성시키는 단계를 추가로 수행할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 메주 100 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량부의 고추씨 분말을 더 추가하여 숙성시킬 수 있다. 고추씨 분말을 상기 함량 범위로 추가하여 숙성시킨 된장은 관능성이 더욱 개선되므로 바람직하다.
상기한 방법에 따라 제조된 메주, 된장 등의 장류는 발효기간을 현저히 단축하여 제조하였음에도 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 접종하지 않고 제조한 장류에 비해 균주의 생육이 현저히 증진되었을 뿐 아니라 아미노태질소 함량이 현저히 증대됨을 구체적인 실험예를 통해 확인하였다. 또한, 본 발명의 메주를 이용하여 제조된 된장은 발효기간을 현저히 단축하여 제조하였음에도 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성 및 바이오제닉 아민(히스타민 및 티라민) 생성 저해 활성을 나타내며, 아미노태질소 함량이 현저히 증대되는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명에 따른 메주, 된장 등의 장류는 발효기간을 현저히 단축하여 제조하였음에도 아미노태질소 함량에 대한 전통식품 인증규격(메주: 110 mg% 이상, 된장: 300 mg% 이상)을 충족한다.
이하, 실시예에 의하여 본 발명을 상세히 설명하겠으나, 다음 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1: 메주의 제조
1-1. 균주의 접종
1) 대두의 이물질을 제거하는 정선단계를 거쳐 대두를 세척하고, 대두 중량의 3배의 물을 가수한 후 14시간 동안 침지하였다.
2) 수침한 대두를 120 ℃의 증자솥에서 2시간 동안 증숙한 다음, 물기를 제거하고 40 ℃까지 식혔다.
3) 농업생명공학연구원으로부터 수득한 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주(수탁번호 KACC 92193P)를 평판배지에 도말한 후 37℃ 배양기에서 48시간 동안 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 분리한 콜로니를 채취하여 액체 MRS 배지에 첨가하고, 37 ℃, 200 rpm 조건에서 16시간 동안 배양하여 NY12-2 균주를 활성화시켰다.
4) 상기 2)에서 준비된 증숙한 대두 100 g에 3)에서 준비된 NY12-2 균주 배양액(2×109 cfu/ml) 1 g을 접종하였다.
1-2. 쵸핑 및 성형
상기 균주를 접종한 대두를 쵸핑한 후 중량 2 kg 내외의 직육면체의 형태로 메주를 성형하였다.
1-3. 겉말림
상기 성형된 메주를 50 ℃에서 24 시간 동안 겉말림하였다.
1-4. 발효
상기 겉말림한 메주를 30 ℃에서 6일 동안 발효하여 메주를 제조하였다.
실시예 2: 메주의 제조
실시예 1과 동일하게 실시하되, 1-3의 겉말림 단계에서, 상기 성형된 메주를 50 ℃에서 4 시간 동안 1차 겉말림단계, 상기 1차 겉말림한 메주를 60 ℃에서 2 시간 동안 2차 겉말림하는 단계, 상기 2차 겉말림한 메주를 30 ℃에서 2 시간 동안 3차 겉말림하는 단계, 및 상기 3차 겉말림한 메주를 50 ℃에서 16 시간 동안 4차 겉말림하는 단계를 순차적으로 수행하여 메주를 제조하였다.
실시예 3: 메주의 제조
실시예 1과 동일하게 실시하되, 1-3의 겉말림 단계를 50 ℃ 대신 60 ℃에서 수행하여 메주를 제조하였다.
실시예 4: 메주의 제조
실시예 1과 동일하게 실시하되, 1-3의 겉말림 단계를 50 ℃ 대신 30 ℃에서 수행하여 메주를 제조하였다.
실시예 5: 메주의 제조
실시예 1과 동일하게 실시하되, 1-3의 겉말림 단계에서, 상기 성형된 메주를 50 ℃에서 4 시간 동안 1차 겉말림단계, 상기 1차 겉말림한 메주를 60 ℃에서 2 시간 동안 2차 겉말림하는 단계, 상기 2차 겉말림한 메주를 50 ℃에서 18 시간 동안 3차 겉말림하는 단계를 순차적으로 수행하여 메주를 제조하였다.
실시예 6: 메주의 제조
실시예 1과 동일하게 실시하되, 1-3의 겉말림 단계에서, 상기 성형된 메주를 50 ℃에서 4 시간 동안 1차 겉말림단계, 상기 1차 겉말림한 메주를 30 ℃에서 2 시간 동안 2차 겉말림하는 단계, 및 상기 2차 겉말림한 메주를 50 ℃에서 18 시간 동안 3차 겉말림하는 단계를 순차적으로 수행하여 메주를 제조하였다.
대조군 : 균주 무첨가 메주의 제조
실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 첨가하지 않고 메주를 제조하였다.
하기 비교예에서는 대두, 메주 또는 된장 발효에 우수한 효과를 나타내는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 균주, 바실러스 서브틸리스 균주 또는 아스퍼질러스 오리재 균주를 한국미생물보존센터 또는 농업생명공학연구원으로부터 분양 받아 메주를 제조하였다.
비교예 1: 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GA98 균주 이용
실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 대신 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GA98 균주(수탁번호: KACC 91776P)를 접종하여 메주를 제조하였다.
비교예 2: 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 J108 균주 이용
실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 대신 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 J108 균주(수탁번호: KCCM 12389P)를 접종하여 메주를 제조하였다.
비교예 3: 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CJ14-6 균주 이용
실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 대신 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CJ 14-6(수탁번호: KCCM 11718P)를 접종하여 메주를 제조하였다.
비교예 4: 바실러스 서브틸리스 CSY388 균주 이용
실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 대신 바실러스 서브틸리스 CSY388 (수탁번호: KACC 91564P)를 접종하여 메주를 제조하였다.
비교예 5: 바실러스 서브틸리스 AFY-2 균주 이용
실시예 1과 동일하게 실시하되, 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주 대신 바실러스 서브틸리스 AFY-2 (수탁번호: KACC 91988P)를 접종하여 메주를 제조하였다.
본 발명의 실시예 및 비교예에서 이용된 균주를 하기 표 1에 정리하여 나타내었다.
구분 균주 균주명 기탁번호 기관명
실시예 1 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 KACC 92193P 농업생명공학연구원
비교예 1 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 GA98 KACC 91776P 농업생명공학연구원
비교예 2 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 J108 KCCM 12389P 한국미생물보존센터
비교예 3 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 CJ14-6 KCCM 11718P 한국미생물보존센터
비교예 4 바실러스 서브틸리스 CSY388 KACC 91564P 농업생명공학연구원
비교예 5 바실러스 서브틸리스 AFY-2 KACC 91988P 농업생명공학연구원
시험예 1: 메주의 특성 분석
실시예 및 비교예에 따라 제조한 메주를 분쇄하여 분말화한 후 하기 방법에 따라 메주의 특성을 분석하여 하기 표 2에 나타내었다.
1-1. pH 측정: pH는 메주분말 5g을 증류수 50 mL에 넣고, 160rpm으로 1시간 동안 진탕 반응시킨 후, 4000rpm으로 10분간 원심 분리하고, 상등액을 pH meter (HI9025C, HANNA, Italy)로 측정하였다.
1-2. Protease 활성 측정: Protease 활성은 Anson (Kim et al., 1998)의 방법을 변형하여 측정하였다. 메주분말 5g을 인산염완충용액(0.1 M phosphate buffer, pH 7.0) 50mL에 넣고, 160rpm으로 30분 진탕 반응시킨 후 여과지(Whatman No. 2)로 여과한 여액을 효소액으로 사용하였다. 효소액 2mL에 0.6% 카제인(casein) 기질 용액(0.1 M phosphate buffer, pH 7.0)을 넣고, 37℃에서 20분 동안 반응시켰다. 반응 후 0.4M 삼염화초산액(TCA; trichloroacetic acid) 10mL를 넣어 반응을 중지시켰다. 이어서 37℃에서 30분간 방치한 다음 여과지(Whatman No. 2)로 여과한 여액 2mL에 0.4M 탄산나트륨(sodium carbonate)용액 10mL와 3배 희석된 Folin reagent 용액 2mL를 넣어 37℃에서 30분간 반응시킨 후, 660nm에서 흡광도를 측정하였다. 1 unit은 1분간 tyrosine 1μg을 유리시키는 양을 환산하여 나타내었다.
1-3. 아미노태질소 함량 측정: 아미노태 질소 함량은 Formal 적정법(Choi et al., 2007)으로 측정하였다. 메주분말 5g을 증류수 50mL에 넣고, 160rpm으로 1시간 동안 추출한 후 여과지(Whatman No. 2)로 여과하였다. 여액 20mL에 증류수 20mL을 넣고, 0.5% 페놀프탈레인(phenolphthalein) 용액 1mL을 가한 후 0.1 N NaOH를 첨가하여 pH 8.4까지 중화하였다. 여기에 중성 포르말린 20mL을 넣고, 다시 0.1 N NaOH로 pH 8.4가 될 때까지 적정하였다. 적정의 종점을 결정하기 위하여 pH meter (HI9025C, HANNA, Italy)를 이용하였다.
1-4. 총균수 측정: 총균수는 메주 시료를 10g을 취하여 10배 희석 후, 희석된 시료 100 ul를 취하여 평판 아가(Difco co.)에 도말하고, 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하여 나온 콜로니 수를 mL당 콜로니 형성 단위(Colony forming unit, CFU)로 표시하였다.
구분 pH 아미노태질소(mg%) 프로테아제 활성(unit/g) 총균수
(cfu/mL)
대조군 6.94 26.3 21 1×103
실시예 1 6.30 124.1 118 3×106
실시예 2 6.24 136.4 123 4×106
실시예 3 6.35 115.7 107 3×106
실시예 4 6.34 112.5 104 3×106
실시예 5 6.31 125.6 118 3×106
실시예 6 6.30 123.2 116 3×106
비교예 1 6.68 46.4 40 3×104
비교예 2 6.60 54.2 44 2×105
비교예 3 6.71 37.6 29 2×103
비교예 4 6.45 64.5 56 7×105
비교예 5 6.51 32.0 28 5×104
상기 표 2를 살펴보면, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용하여 발효시킨 실시예의 메주가 대조군 및 비교예에 비하여 pH가 현저히 낮고, 총균수가 더욱 높게 측정되어 균주의 생육이 더욱 활발한 것을 확인할 수 있다. 또한, 실시예의 메주의 경우 메주의 발효정도를 측정하는데 중요한 지표인 아미노태질소 함량 및 프로테아제 활성이 대조군 및 비교예에 비해 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 실시예의 메주는 발효기간을 현저히 단축하여 제조되었음에도 아미노태질소 함량에 대한 메주 관련 전통식품인증규격(110 mg% 이상)을 충족하는 것으로 확인되었다.
제조예 1: 된장의 제조
실시예 1에서 제조한 메주를 쵸핑하고, 상기 메주 100 중량부에 24%(w/w) 천일염을 함유한 염수를 200 중량부로 첨가한 후 잘 혼합하였다.
상기 혼합물을 25 ℃에서 10주 동안 숙성시켜 된장을 제조하였다.
제조예 7: 된장의 제조 - 고추씨 분말 첨가
제조예 1과 동일하게 실시하되, 상기 메주 100 중량부에 3 중량부의 고추씨 분말을 더 첨가하여 된장을 제조하였다.
대조군: 된장의 제조
제조예 1과 동일하게 실시하되, 균주를 첨가하지 않고 제조한 대조군 메주를 이용하여 된장을 제조하였다.
제조예 2~6 및 비교제조예 1~5: 된장의 제조
제조예 1과 동일하게 실시하되, 실시예 1의 메주 대신 하기 표 3에 따른 메주를 이용하여 제조예 2~6 및 비교제조예 1~5의 된장을 제조하였다.
구분 메주
제조예 2 실시예 2
제조예 3 실시예 3
제조예 4 실시예 4
제조예 5 실시예 5
제조예 6 실시예 6
비교제조예 1 비교예 1
비교제조예 2 비교예 2
비교제조예 3 비교예 3
비교제조예 4 비교예 4
비교제조예 5 비교예 5
시험예 2: 된장의 특성 분석
상기 제조예 및 비교제조예에 따라 제조된 된장의 특성을 시험예 1의 방법과 동일한 방법으로 분석하여 하기 표 4에 나타내었다.
구분 pH 아미노태질소(mg%) 프로테아제 활성(unit/g) 총균수
(cfu/mL)
대조군 5.55 181 92 1×109
제조예 1 5.47 419 201 2×109
제조예 2 5.41 496 224 2×109
제조예 3 5.48 387 193 2×109
제조예 4 5.49 381 191 2×109
제조예 5 5.47 424 204 2×109
제조예 6 5.48 418 199 2×109
비교제조예 1 5.35 353 162 9×108
비교제조예 2 5.45 283 131 2×108
비교제조예 3 5.23 315 154 2×109
비교제조예 4 5.58 235 125 5×108
비교제조예 5 5.62 359 159 1×109
상기 표 4를 살펴보면, 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 이용하여 발효시킨 제조예의 된장이 대조군 및 비교예에 비하여 pH가 현저히 낮고, 총균수가 더욱 높게 측정되어 균주의 생육이 더욱 활발한 것을 확인할 수 있다. 또한, 제조예의 된장의 경우 메주의 발효정도 및 품질을 평가하는데 중요한 지표인 아미노태질소 함량이 대조군 및 비교예에 비해 현저히 높은 것을 확인할 수 있다.
또한, 제조예의 된장은 발효기간을 현저히 단축하여 제조되었음에도 아미노태질소 함량에 대한 된장 관련 전통식품인증규격(300 mg% 이상)을 충분히 충족하는 것으로 확인되었다.
시험예 3: 바실러스 세레우스에 대한 항균 활성
제조예 및 비교제조예에 따른 된장 시료를 각각 1 g씩 채취하였고, 이를 10진 희석하여 CHROM agar Bacillus cereus 배지에 도말한 후 30 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 바실러스 세레우스를 계수하여 하기 표 5에 나타내었다.
구분 바실러스 세레우스 균수
(cfu/g)
대조군 1.2×104
제조예 1 1.4×103
제조예 2 1.2×103
제조예 3 1.4×103
제조예 4 1.5×103
제조예 5 1.4×103
제조예 6 1.4×103
비교제조예 1 2.5×104
비교제조예 2 3.1×104
비교제조예 3 5.4×103
비교제조예 4 1.1×104
비교제조예 5 6.0×104
상기 표 5를 살펴보면, 제조예의 된장은 대조군 및 비교예에 비해 바실러스 세레우스 균주가 현저히 적게 검출되었다. 특히, 식약처 허용기준인 10,000 CFU/g 이하로 검출되어 안전성이 높은 것으로 확인되었다.
시험예 4: 바이오제닉 아민 생성 저해 활성
제조예 및 비교제조예에 따른 된장 시료와 표준 용액을 각각 시험관에 0.5 mL씩 취한 후 1,7-디아미노헵탄(0.1 g/L) 0.25 mL씩 첨가하였다. 포화탄산나트륨 용액 0.25 mL와 1% 댄실염화물 아세톤 용액 0.4 mL를 추가하여 혼합한 후 마개를 하여 45℃에서 1시간 동안 유도체화 하였다. 유도체화 후 10% 프롤린 용액 0.25 mL를 가하여 과잉의 댄실염화물을 제거하고, 시험관에 에테르 2.5 mL를 가하여 3분간 진탕한 후 상등액을 취하여 이를 질소농축기에서 완전히 증발시킨 후 잔사를 아세토나이트릴 0.5 mL에 녹이고 0.45 ㎕ 필터로 여과한 후 표 6의 분석조건으로 HPLC를 이용하여 분석하였다.
Instrument Agilent 1200 series
(Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)
Column CapcellPak C18 Column
Detector DAD detector(254 nm)
Mobile phase A: 0.1% formic acid in H2O
B: 0.1% formic acid in ACN
Gradient condition A:B = 45:55, 0~10 min
A:B = 35:65, 10~15 min
A:B = 20:80, 15~20 min
A:B = 10:90, 20~30 min
A:B = 10:90, 40 min over
Flow rate 1.0 mL/min
Temperature 40 ℃
Injection volume 20 ㎕
제조예 및 비교제조예에 따른 된장의 바이오제닉 아민 함량 분석 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 본 실험에서는 히스타민(histamine), 티라민(tyramine) 등 총 2종의 바이오제닉 아민을 검사하여 총 함량으로 나타내었다.
구분 바이오제닉 함량(ppm)
대조군 121.5
제조예 1 46.2
제조예 2 38.1
제조예 3 48.4
제조예 4 50.6
제조예 5 46.5
제조예 6 47.3
비교제조예 1 88.3
비교제조예 2 73.5
비교제조예 3 97.6
비교제조예 4 84.8
비교제조예 5 105.7
상기 표 7을 살펴보면, 제조예의 된장이 바이오제닉 아민 함량이 대조군 및 비교예에 비해 유의적으로 낮은 함량을 나타내는 것을 확인할 수 있다.
시험예 5: 관능 평가
대조군, 제조예 및 비교제조예에서 제조한 각각의 된장 시료에 대하여 관능평가를 실시하여 하기 표 8에 나타내었다.
관능평가를 위하여 된장 맛 평가 전문가 50명을 패널로 구성하였고, 9점 척도법(강도: 1. 매우 나쁨; 5. 보통; 9. 매우 좋음)에 준하여 평가를 실시하였다. 이때 통계처리는 SPSS 12.0 통계 프로그램을 사용하고 다중범위 검정(DMR-test; Duncan multiple range test)으로 유의수준 p<0.05에서 유의성을 검증하였다.
구분 색 맛 향 종합
기호도
대조군 6.4 5.7 5.6 5.7
제조예 1 6.6 7.1 7.0 6.9
제조예 2 6.5 7.4 7.3 7.3
제조예 3 6.5 6.9 6.9 6.9
제조예 4 6.4 6.8 6.8 6.8
제조예 5 6.5 7.1 7.0 6.9
제조예 6 6.5 6.9 6.9 6.8
제조예 7 6.8 7.5 7.2 7.3
비교제조예 1 6.5 6.2 5.8 6.1
비교제조예 2 6.4 6.5 6.0 6.2
비교제조예 3 6.6 6.6 5.9 6.3
비교제조예 4 6.3 6.2 5.7 5.9
비교제조예 5 6.8 6.5 6.1 6.5
상기 표 8을 살펴보면, 제조예에 따른 된장이 대조군 및 비교제조예에 비해 전체적으로 맛과 향이 우수한 것으로 나타났다. 특히, 제조예에 따른 된장은 잘 익은 전통 된장의 향이 났으며, 풍미가 우수하였다. 특히, 고추씨 분말을 첨가하여 제조한 제조예 7의 된장은 풍미가 더욱 개선되었다. 반면, 비교제조예 1 및 4는 암모니아성 이취가 있었으며, 비교제조예 2 및 3은 덜 익은 콩 냄새가 있었고, 비교제조예 5는 시큼한 향이 있어 제조예에 비해 상대적으로 기호도가 낮았다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims (5)

  1. (1) 증숙한 대두에 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) NY12-2 균주(수탁번호: KACC 92193P)를 접종하는 단계;
    (2) 상기 균주를 접종한 대두를 쵸핑한 후 성형하는 단계;
    (3) 상기 성형된 메주를 30 내지 65 ℃에서 5 내지 24 시간 동안 겉말림하는 단계; 및
    (4) 상기 겉말림한 메주를 25 내지 35 ℃에서 2 내지 10일 동안 발효하여 메주를 수득하는 단계;를 포함하고,
    상기 (3) 단계는,
    상기 성형된 메주를 40 내지 50 ℃에서 2 내지 20 시간 동안 1차 겉말림하는 단계; 상기 1차 겉말림한 메주를 55 내지 65 ℃에서 0.5 내지 4 시간 동안 2차 겉말림하는 단계; 상기 2차 겉말림한 메주를 30 내지 35 ℃에서 0.5 내지 4 시간 동안 3차 겉말림하는 단계; 및 상기 3차 겉말림한 메주를 40 내지 50 ℃에서 2 내지 20 시간 동안 4차 겉말림하는 단계;를 포함하는 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 기능성 장류의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바실러스 아밀로리퀴파시엔스 NY12-2 균주를 상기 증숙한 대두의 총중량 대비 0.1 내지 3 중량%가 되도록 접종하는 것을 특징으로 하는 기능성 장류의 제조방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (4) 단계에서 수득한 메주에 염수를 첨가한 후 10 내지 40 ℃에서 2 내지 20주 동안 숙성시켜 된장을 수득하는 단계;를 추가로 수행하는 것을 특징으로 하는 기능성 장류의 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 메주 100 중량부에 대하여 0.5 내지 5 중량부의 고추씨 분말을 더 추가하여 숙성시키는 것을 특징으로 하는 기능성 장류의 제조방법.
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