KR101729478B1

KR101729478B1 - 면역조절 기능의 유산균 사균체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101729478B1
Application number: KR1020140168383A
Authority: KR
Inventors: 이현준; 김종훈; 김윤아; 박수현; 정성욱; 민병중
Original assignee: 주식회사농심
Priority date: 2014-11-28
Filing date: 2014-11-28
Publication date: 2017-04-25
Also published as: KR20160065280A

Abstract

본 발명은 면역조절 기능이 강화된 유산균 사균체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 특히 김치로부터 분리된 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis, 기탁기관: 한국종균협회부설 한국미생물보존센터, 수탁번호: KCCM11594P, 수탁일자: 2014.10.30.) 유산균의 사균체로, 면역조절 관련 바이오마커의 활성을 조절함으로써 효능을 나타내었다. 특히 본 발명을 통해 개발된 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis)는 김치로부터 분리되는 타 균주에 비해 그 면역조절 효능이 우수하며, 내산성/내담즙산성이 높아 프로바이오틱스로서도 우수하다.
본 발명은 김치로부터 분리된 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis)의 균주 특성, 사균화 시 우수한 면역조절 효능 및 그 효능을 증진시키기 위한 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명을 통해 개발된 사균체는 약품 조성물, 음료수 정장제, 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품첨가제 및 기타 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.

Description

면역조절 기능의 유산균 사균체 및 이의 제조방법{IMMUNE REGULATING TYNDALIZED LACTIC ACID BACTERIA AND A METHOD FOR MANUFACTURING THE SAME}

본 발명은 면역조절 기능이 강화된 유산균 사균체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 특히 김치로부터 분리된 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis, 기탁기관: 한국종균협회부설 한국미생물보존센터, 수탁번호: KCCM11594P, 수탁일자: 2014.10.30.) 유산균의 사균체로, 면역조절 관련 바이오마커의 활성을 조절함으로써 효능을 나타내었다. 특히 본 발명을 통해 개발된 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis)는 김치로부터 분리되는 타 균주에 비해 그 면역조절 효능이 우수하며, 내산성/내담즙산성이 높아 프로바이오틱스로서도 우수하다.

본 발명은 김치로부터 분리된 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis)의 균주 특성, 사균화 시 우수한 면역조절 효능 및 그 효능을 증진시키기 위한 제조방법에 관한 것이다. 또한 본 발명을 통해 개발된 사균체는 약품 조성물, 음료수 정장제, 생균용 조성물, 사료첨가제, 식품첨가제 및 기타 발효제품의 제조에 다양하게 이용될 수 있다.

인체나 동물의 장에 서식하면서 여러 가지 유익한 작용을 하는 미생물들이 있는데 이러한 미생물을 프로바이오틱스(Probiotics)라고 하며, Lactobacillus나 Bifidobacterium으로 대변되는 유산균은 프로바이오틱스의 대부분을 차지하고 있다. 국내에서는 정장작용의 기능성을 가지는 대표적인 건강기능식품으로 인식되어 있다.

유산균은 보통 젖산균이라고도 칭하는 최종 대사산물로 젖산을 만드는 박테리아로, 사람이나 동물의 소화관, 우유, 요쿠르트, 치즈, 김치, 식물 및 토양 등 자연계에 널리 분포되어 있으며, 이들 유산균은 인류의 생활에 직간접적으로 밀접한 관계를 맺고 있는 유익한 공생체이다. 최근에는 유산균에 대한 연구가 활발히 진행되어 일반 식품뿐만 아니라 건강식품 및 약품으로써 이용되는 등 그 응용범위가 넓어지고 있다. 여기에 속하는 유산균은 스트렙토코코스 (Streptococcus)속, 페디오코커스 (Pediococcus)속, 류코노스톡 (Leuconostoc)속, 락토바실러스 (lactobacillus)속, 스포로락토바실러스 (Sporolactobacillus)속과 비피도박테리움 (Bifidobacterium) 등이 있다. 상기 균들은 그람 양성균으로써 혐기성이거나 편성혐기성인 성질을 지니고 있으며, 동물의 장내에 서식한다. 동물이 섭취한 영양분 및 섬유소 등을 분해시켜 에너지원으로 사용하며, 젖산 및 항생물질을 생산하여 장내 유해균의 발육을 억제함으로써 장내 건강유지에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

이러한 프로바이오틱스의 정의는 시대가 흐름에 따라 조금씩 확대되고 있다. 1989년 Fuller는 Probiotcis를 "장내 균종을 개선시켜 줌으로써 숙주에게 유익한 영향을 주는 생균제제"라고 정의하였고, 살아있는 미생물로서의 정립이 이루어졌으나, 1999년 Salminen 등이 "숙주에 유익한 작용을 갖는 미생물 또는 미생물의 성분"으로 정의함으로 Probiotcis의 범위를 사균(死菌) 및 그 균체 성분으로까지 확대시켰다.

유산균 사균체는 생균의 반대되는 개념으로서 발효를 통해 얻어진 생균과 대사산물들을 열처리 등에 의해 균의 성장이 일어나지 못하도록한 형태이다. 세포질 (cytoplasm), 세포벽 (cell wall), 박테리오신 (bacteriocin) 등의 항균활성 물질, 다당류 (polysaccharide), 유기산 등을 포함하는 것을 특징으로 한다. 유산균 사균체라는 용어는 유산균 사균체 (乳酸菌死菌體), 유산균 배양물 (乳酸菌培養物), 유산균 추출물 (乳酸菌抽出物), 유산균 균체성분 (乳酸菌菌體性分) 등의 용어로 사용되고 있다.

국내에서는 사균체가 항균활성을 바탕으로 하여 설사치료를 위한 원료의약품으로 주로 많이 사용되고 있으며 in vitro 및 in vivo 실험을 통해 면역조절기능, 독소제거 등과 같은 다양한 효능을 가지고 있을 가능성이 제시되고 있다.

유산균 사균체 제품은 생균제품과 비교하여 높은 안정성을 가지고 있다. 특히 내열성이 우수하며, 외부 환경에 대한 안정성이 높아 기존 유산균 제품보다 보관이 용이하고 유통기간을 늘일 수 있다는 장점을 가지고 있다. 따라서 사균체 제품은 건강기능식품, 식품첨가제, 의약품, 동물사료 등과 같은 기존의 유산균 생균이 적용되어 온 분야 외에도 화장품 원료로도 적용이 가능하다. 또한 항생제 사용에 대한 규제가 강화되고 있기 때문에 대체제로서의 활용성과 아직 사균체 제품 생산에 본격적으로 뛰어든 업체가 손에 꼽을 정도이기 때문에 시장성과 성장가능성은 크다고 할 수 있다. 특히 일본에서는 이미 사균체 제품이 많이 출시되어 꽃가루 알러지 등 면역 관련 효능을 기반으로 홍보하고 있다. 하지만 국내는 아직 개별인정소재로 인정받은 소재가 없을 뿐 아니라 관련 제품 또한 수입에 의존하고 있다.

유산균 사균체 제품 중 가장 대표적인 예로서 프랑스의 Lacteol사의 "Lacteol Forte"를 들 수 있다. 이 제품은 L. acidophilus 사균체를 포함하고 있으며 장점막세포에 병원성 세균의 부착을 방해하여 정장작용을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 일본 니치니치 제약의 "FK-23"은 유산구균을 열처리한 사균체 제품으로서 면역활성 기능을 규명하여 c형 간염 치료제로 개발하였으며, 또 다른 일본 기업인 칼피스도 L. acidophilus L-92의 사균체가 면역 조절 활성이 있다는 것을 밝힌 바 있다.

면역조절 관련T 림프구 중 싸이토카인(cytokine) 분비 T 림프구인 helper T cell (Th cell)은 Th-1과 Th-2 cell로 나뉜다. Th-1 cell이 분비하는 IFN-γ는 대식세포를 활성화하여 대식세포의 미생물 살해능력을 증가시키며, Th-1 cell의 분화를 촉진하는 IL-12를 만들어내는 역할을 하기도 한다. 그 외에도 IFN-γ는 염증반응을 촉진하여 세포독성 T cell의 생산도 도와주는 역할을 한다. Th2 cell은 IL-4를 분비하여 IgE 생산을 촉진하고 호산구의 활성화를 유도하여 알러지(allergy) 또는 기생충에 대한 면역 반응을 촉진하는 중요한 작용을 한다. Th-1과 Th-2 cell은 원래 시험관에서 (in vitro) 장기간에 걸친 T cell cloning을 통하여 얻어졌으나, 실제로도 (in vivo) 이들 세포들은 특정한 염증성 질환에서 확인되기도 한다. 대부분의 건강한 사람에서는 많은 helper T cell들이 Th-1과 Th-2 cell 중 특정 싸이토카인 생산을 하는 것이 아닌, 이들 두 가지 세포의 싸이토카인을 모두 생산하는 것으로 보여지고 있다.

비록 Th-1과 Th-2 cell이 정확하게 어떻게 얻어지는 지는 밝혀지지 않았지만, 면역반응이 어떠한 형태로 나타나느냐 하는 것은 Th-1 cell이 유도되었느냐 아니면 Th-2 cell이 유도되었는지가 관련이 깊다고 볼 수 있다. 또한 어떤 종류의 helper T cell이 활성화되느냐 하는 것도 싸이토카인에 의하여 영향을 받는 것으로 조사된다. 특히, IL-4는 Th-2 cell의 활성화에 중요하며, IL-12는 Th-1 cell의 활성화에 중요한 것으로 알려져 있다. 세포 내에서 증식하는 미생물에 의하여 활성화된 대식세포는 주요한 IL-12의 생산자로 알려져 있으며, 이들 세포에 의하여 활성화된 T cell은 주로 Th-1 cell로 분화되는 것으로 이해되고 있다. 반면에, IL-4의 생산은 Th-2 cell의 분화에 매우 중요한 것으로 밝혀지고 있다. 실제로 Th-1과 Th-2 cell세포들의 활성화에는 복잡한 싸이토카인 네트워크가 관여하는 것으로 추정되며, 이들 두 그룹의 세포들 간의 균형이 바로 건강한 면역상태를 유지시켜 주는 것이라 볼 수 있다.

실제로 Th-1 cell의 과도한 면역 반응에 의해 염증성 장 질환이 유발되는 것으로 밝혀지고 있으며, Th-2 cell의 과도한 면역 반응에 의해 알러지(allergy)가 유발되는 것으로 알려져 있다. Th-1과 Th-2 cell은 서로 길항 작용을 일으키기 때문에, Th-1 cell의 과도한 면역 반응에 의해 유발되는 질병의 치료는 Th-2 cell에 의한 면역 반응을 유발시켜 병을 치료하려는 치료법이 개발되고 있으며, Th-2 cell의 과도한 면역 반응에 의해 유발되는 질병의 치료는 Th-1 cell에 의한 면역 반응을 유발시켜 병을 치료하려는 치료법이 개발되고 있다.

국내외 출원 및 등록된 사균체 관련 특허를 살펴보면, 식물성 유산균 락토바실러스 플란타룸 피엠오08 사균체를 유효성분으로 포함하는 변비 예방, 치료 또는 개선용 조성물(대한민국특허출원 제 10-2012-0152009) 특허는 사균체의 정장작용 효능에 대해 개시하였다. 틴달화 락토바실루스 아시도필루스 사균체 조제방법(대한민국특허출원 제 10-2012-0066576) 특허는 틸달화 기술에 의한 사균체 제조방법에 대해 개시하였다. 항균용 유산균 사균체 및 이의 제조방법(대한민국특허출원 제 10-2011-0110381)는 사균체의 항균작용에 대해 특화하여 개시하였다. 면역 기능이 강화된 사균화 유산균 제제 및 그 제조방법(일본 특허출원번호 2006-12977)은 배양조건 및 사균화 조건을 최적화함으로 인해 면역기능이 향상됨을 개시하였다. 상기 언급한 사균체 관련 특허는 사균체의 정장작용 효과, 형질전환 또는 배양, 사균화 조건 최적화를 통한 면역증강 효과 등을 강조하고 있다. 특히 상기 특허의 사균화 공정은 틴달화 또는 열처리 공정에만 한정되어 기재되어 있는 한계점이 있다.

본 발명은 면역조절 기능의 유산균 사균체 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 특히 김치로부터 내산성, 내담즙산성 등 프로바이오틱스로써 우수한 균주를 우선 선별하고자 하였다. 본 발명의 핵심은 유산균 사균체이지만, 이 사균체를 생균의 상태로 섭취하였을 때 장 내에서 생존율이 높아지게 되면 정장작용 효능을 기대할 수 있다. 그리고 시간이 지나 사멸하게 되었을 때 사균체로서의 면역조절 효능이 우수하다면 그 기능 또한 기대할 수 있다. 따라서, 프로바이오틱스로써의 효능도 기대할 수 있는 내산성과 내담즙산성이 우수한 균주를 우선 선별하였으며, 이 균주들을 사균화하여 면역조절 효능을 비교, 평가하였다. 또한, 틴달화 등 열처리에 국한된 사균체 제조방법을 개선, 발전시켜 면역조절 효능을 증진시키는 데 목적을 두고 발명하였다.

본 발명은 면역조절 기능의 유산균 사균체 및 이의 제조방법, 특히 김치로부터 내산성, 내담즙산성 등 프로바이오틱스로써 우수한 균주를 선별하는 단계, 1차 선별된 균주의 열처리를 통해 사균화하여 면역효능을 평가 및 선별하는 단계, 선별된 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis)의 균주 특성을 분석하는 단계, 면역증진 공정 개발을 통해 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis) 사균체의 면역조절 효능을 향상시키는 단계를 제공한다.

면역조절 효능이 향상된 유산균 사균체의 제조 프로세스는 도 1과 같다.

도 1은 면역조절 사균체의 제조방법에 관한 것이다.
도 2는 일반적 사균체 제조공정에 관한 것이다
도 3은 싸이토카인 IFN-γ의 분비량 측정결과에 관한 것이다.
도 4는 싸이토카인 IL-4의 분비량 측정결과에 관한 것이다.
도 5는 싸이토카인 IL-12의 분비량 측정결과에 관한 것이다.
도 6은 면역증진공정 적용 후 IFN-γ 분비량 비교결과에 관한 것이다.
도 7은 면역증진공정 적용 후 IL-12 분비량 비교결과에 관한 것이다.
도 8은 면역증진 공정 적용 사균체 제조공정에 관한 것이다.

이하에서는 본 발명을 실시예 및 첨부된 도면에 의하여 보다 구체적으로 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 더 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 락토바실러스 브레비스(L. brevis) NS1401 의 분리 및 동정

전국의 김치를 시료로 사용하여 유산균들을 분리하였다. 구체적으로, 상기 시료를 0.004%의 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple)이 함유된 MRS agar 배지(Difco, 미국)에 도말평판법(streak plate)으로 도말한 후 혐기상태(이산화탄소 5 ~ 15%)에서 37℃, 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 균주 중에서 노란색 집락을 띄는 균주들을 선별하여 그람염색, 카탈라아제 및 옥시다아제 테스트, 가스 형성 등을 조사하였다.

상기와 같은 방법으로 분리되고, 다음 실시예에 나오는 선별 기준에 의해 선발된 락토바실러스 브레비스 NS1401균주의 특성은 하기의 표 1과 같다.

락토바실러스 브레비스 NS1401의 형태학적 및 생리학적 특징

1. 형태적 성질 (MRS 한천 배지에서 성장시켰을 때의 형태)
1) 세포의 모양	간균 (막대형)
2) 세포의 다형성(多形性)	없음
3) 운동성	없음
4) 아포 형성	없음
2. 생리학적 성질
1) 그람 염색(gram staining)	양성
2) 카탈라아제(catalase)	음성
3) 옥시다아제(oxidase)	음성
4) 생육 온도 및 시간	37℃, 24~48시간
5) 산소 요구도	편성 혐기성

상기 균주를 동정하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. 선발 유산균을 MRS broth에 접종한 다음 37℃에서 18시간 2차 계대 배양하여 배양액 2 mL를 3,000 rpm으로 10분 동안 원심분리 하였다. 원심분리 하여 얻은 세포 침전물은 0.85% NaCl로 3회 수세하였다. 수세 후, lysozyme (10 mg/mL) 0.5 mL을 첨가하여 37℃?, 1시간 동안 정치하였다. Protease K (10 mg/mL) 20㎕와 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) 25㎕를 첨가한 후, 60℃? water bath에서 30분 처리한 후 RNase 1㎕ 첨가하여 37℃, 1시간 정치하였다. 동량의 Phenol-Chloroform-Isoamyl alcohol (25:24:1)을 첨가하여 현탁한 후, 14,000 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리 하여 상등액의 1/2 volume의 3 M ammonium acetate (pH 4.8)와 2 volume의 100% alcohol을 첨가하고 -20℃에서 1시간 정치하였다. 14,000 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리 하여 세포 침전물을 확인하고, 상등액을 완전히 제거한 후에 70% ethanol 1 mL를 넣고 다시 14,000 rpm으로 5분 동안 4℃에서 원심분리 하였다. DNA를 추출한 후, 16S rDNA를 증폭시키기 위해 forward primer(27f): (5'-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3')와 reverse(1492r): (5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3')를 사용하였다. PCR premix (Bioneer; Cat No. K-2012)에 17㎕의 증류수와 forward primer 1㎕, reverse primer 1 ㎕, DNA 1 ㎕를 첨가하여 혼합한 후 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 94℃에서 5분간 처리 후, 94℃에서 1분, 62℃에서 40초, 72℃에서 40초로 30 cycles을 반복하였으며, 72℃에서 40초로 반응을 종료하였다. PCR 반응산물을 0.8% agarose gel로 전기영동을 실시하여 확인하였다. 염기서열 분석은 바이오닉스(www.bionicsro.co.kr)에 의뢰 분석하며 NCBI blast search (www.ncbi.nlm.nih.gov)를 통해서 sequence 결과를 확인한 결과 락토바실러스 브레비스로 동정되었다(표 2).

[표2. 락토바실러스 브레비스 NS1401의 염기서열 분석결과]

ACAGAATTGACAGGTGGTTGCATGGATTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGGTTAGTCCCGCACGAGCGCAACCCCTTATAATCAGTGGCCAGCATTCAGCTTGGGTACTCTGGTGGAGACCTGCTGGTGACGATCGAGCAAGTGGGATGACGTCGAAATCCATCATGGCCCCTGTGTATGTCA

[실시예 2] 내담즙산성 평가

여과 제균된 oxgall(Difco, USA) 용액을 oxgall 함량이 0.5% (w/v)가 되도록 첨가한 MRS 배지에 락토바실러스 스피시스 NS1 현탁액을 접종하여 37℃에서 0, 24시간 배양하여 집락수를 평가하였다. 락토바실러스 브레비스 NS1401의 내담즙산성 결과는 표3 와 같다. 결과에서 보는 바와 같이 0.5% oxgall농도에서도 생육을 할 만큼 담즙산에 대한 내성이 우수함을 확인할 수 있다.

락토바실러스 브레비스 NS1401의 내담즙산성 분석결과]

	0.5% oxgall 처리후 생균수(cfu/ml)
초기균수 1회	3.08 x 10⁶
초기균수 2회	3.32 x 10⁶
초기균수 평균	3.20 x 10⁶
24시간 후 1회	6.7 x 10⁶
24시간 후 2회	6.0 x 10⁶
24시간 후 평균	6.35 x 10⁶

[실시예 3] 내산성 평가

상기 실시예 [1]을 통하여 선별된 유산균 중에서 선발된 균주를 MRS broth에 18시간 2차 계대 배양하여 본 실험에 사용하였다. 0.05 M Sodium phosphate 용액을 제조하여 HCl로 pH를 2.0, 2.5, 3으로 조정한 MRS broth에 pepsin (Sigma Co., USA)을 1,000 unit/mL 되도록 첨가하였다. 초기 균 수가 10⁷cfu/ml정도가 되도록 0.05 M Sodium phosphate buffer에 접종하여 37°C에서 2시간 배양한 후 성장한 집락수를 계산하여 내산성을 평가하였다. 락토바실러스 브레비스 NS1401의 내산성 실험 결과는 다음의 표4 와 같다.

락토바실러스 브레비스 NS1401의 내산성 분석결과]

pH	생균수(cfu/ml)
초기균수 (pH 7)	2.62 x 10⁷
pH 3 처리 후 균수	2.5 x 10⁷
pH 2.5 처리 후 균수	2.1 x 10⁷
pH 2.0처리 후 균수	1.2 x 10⁶

그 결과, 본 발명의 김치에서 분리된 유산균 중 락토바실러스 브레비스 NS1401은 pH 2.5, 3에서2시간 처리했을 때에도 대부분 생존하는 것으로 나타나 내산성이 우수함을 확인할 수 있었다.

[실시예 4] 장부착성 평가

Monolayer를 형성한 HT-29 세포를 PBS buffer를 이용하여 5회 세척하고 항생제가 첨가되지 않은 RPMI 1640배지 0.5ml를 첨가하였다. 락토바실러스 브레비스 NS1401을 약 10⁹ CFU/ml의 농도로 RPMI에 현탁한 다음 well palte에 접종하고 37C에서 2시간 배양하였다. 배양이 완료된 후 부착이 되지 않은 유산균의 제거와 세척에 따른 부착능력을 확인하기 위하여 3분씩 200rpm의 속도로 교반하면서 PBS buffer를 사용하여 3회 세척한 다음, 0.2% Trypsin-EDTA를 분주하여 부착되어 있는 세포를 떼어내고 MRS 배지에서 생균수를 평가하였다. 실험 결과, 2시간 후 평균 3.82 x 10⁷ 이상의 균이 부착되어 생존함을 확인하였으며, 이를 통해 락토바실러스 브레비스 NS1401을 섭취하였을 경우 장 상피세포에 부착하여 충분히 정장작용 효능이 있을 뿐 아니라, 사균이 되어서도 면역기능을 발휘할 수 있을 것으로 유추되었다.

락토바실러스 브레비스 NS1401의 장부착성 실험

구 분	생균수(cfu/ml)
0 시간 1회	1.35 x 10¹⁰
0 시간 2회	1.63 x 10¹⁰
0 시간 평균	1.49 x 10¹⁰
2시간 후 1회	4.14 x 10⁷
2시간 후 2회	3.5 x 10⁷
2시간 후 평균	3.82 x 10⁷

[실시예 5] 락토바실러스 브레비스 NS1401의 사균화

락토바실러스 브레비스 NS1401을 비롯한 김치로부터 분리된 유산균 18종을 사균화하여 면역조절 효능평가를 수행하였다. 사균화 하는 방법은 기존의 논문 등을 통해 많이 알려진 열처리 방법만을 사용하여 우수한 균주를 선별하는 방법으로 진행되었다. 사균체 선별을 위한 사균화 공정은 도 2와 같으며, 대상 선별균주는 표 6과 같다.

김치로부터 선별된 우수 유산균 균주명

No.	샘플명	균주명
1	BYB1	*Lactobacillus curvatus*
2	BYB2	*Lactobacillus curvatus*
3	BYB3	*Lactobacillus curvatus*
4	BYB4	*Lactobacillus curvatus*
5	NS1401	*Lactobacillus brevis*
6	OB1	*Lactobacillus brevis*
7	OB4	*Lactobacillus brevis*
8	OB5	*Lactobacillus brevis*
9	OB8	*Lactobacillus brevis*
10	MYA5	*Lactobacillus brevis*
11	MYA9	*Lactobacillus sakei*
12	MYB5	*Lactobacillus sakei*
13	CH3	*Lactobacillus fermentum*
14	CH6	*Lactobacillus acidophilus*
15	GP1B	*Lactobacillus acidophilus*
16	L67	*Lactobacillus plantarum*
17	OY1	*Lactobacillus fermentum*
18	OY2	*Lactobacillus plantarum*

[실시예 6] 면역세포와 사균체 혼합배양을 통한 면역효능평가

1차적으로 선별된 사균체 18종에 의한 면역세포의 싸이토카인 분비능력을 알아보기 위해 면역세포와 선발 사균체를 혼합 배양 하였고, 혼합 배양 후 상층액 50 ?l를 채취하여 면역세포의 싸이토카인 분비 능력을 ELISA에 의해 확인하였다. 우선, 생쥐(B6 mouse) splenocytes를 96 well plate에 well 당 1X10⁶개씩 seeding하여 24시간 incubation 후 선발 유산균과 3일간 혼합 배양(total volume 200 ?l/ well)하였다. 또한 생쥐 대식세포주인 J774 cell의 경우 96 well plate에 well 당 5 X 10⁴개씩 seeding하여 24시간 incubation 후 사균체와 3일간 혼합 배양(total volume 200 ?l/ well)하였다. 이 때 사용 된 배지는 10% 송아지 혈청을 함유한 RPMI 배지이며, 5% CO₂를 함유한 CO₂incubator에 37℃에서 혼합 배양하였다. 혼합 배양 시 각 사균체 샘플은 10⁵ CFU/ml의 농도로 면역세포와 혼합 배양하였다. 싸이토카인 분비능의 양성 대조군으로 사용된 LPS (lipopolysaccharide), Con A (concanavalin A), PHA (Phytohaemagglutinin)는 각각 10㎍/ml의 농도로 splenocytes와 J774 cell의 단독 배양에 처리하였다. 또한 대조군 균주로 면역활성이 입증된 락도바실러스 람노수스(L. rhamnosus GG)와 락토바실러스 플란타럼(L. plantarum)을 동일 농도인10⁵ CFU/ml의 농도로 splenocytes와 J774 cell의 혼합 배양에 처리하여 평가 하였다.

선발 사균체에 의한 면역세포의 싸이토카인 분비능력을 알아보기 위해 sandwich ELISA 방법을 사용하였다. 세포의 배양은 위 조건과 동일하게 실행하였으며, 배양 3일 후 배양액 (상층액)을 가지고 분석을 실시하였다. 이 때 사용된 싸이토카인 ELISA kit는 eBioscience의 제품이며 splenocytes의 싸이토카인 분비능 측정의 경우 IFN-γ(cat # BMS606)와 IL-4 (cat # BMS613)의 분비능을 측정하였고, J774 cell의 경우는 IL-12 (cat # BMS616)의 분비능을 측정하였다.

면역이란 외부 유해한 물질로부터 신체를 보호하는 방어체계를 의미한다. 면역 세포인 Th-1과 Th-2로부터 나오는 싸이토카인의 발현량을 균형있게 조절함으로써 건강을 유지할 수 있다. 면역에 대한 정의와 면역세포가 분비하는 싸이토카인의 이상분비에 의해 발생 가능한 질병은 도 3과 같다.

따라서 본 발명에서는 면역 과민반응과 알레르기 질환 등의 경우를 개선할 수 있는 사균체를 개발하고자 하였다. 이를 위해 IFN- γ, IL-4, IL-12을 도 4와 같이 조절할 수 있는 사균체를 개발하였다.

상기 언급한 실험 방법을 통해 측정한 싸이토카인 IFN- γ의 분비량 결과는 도 5과 같다.

측정 결과 대조군인 사균체 2종보다 우수한 균주는 락토바실러스 브레비스 NS1401을 비롯하여 총 7개가 선정되었다. 참고로 측정한 일본 내 사균체 음료 3종은 저농도와 고농도에서 효과가 없는 것으로 측정되었다.

상기 언급한 실험 방법을 통해 측정한 싸이토카인 IL-4의 분비량 결과는 도 6과 같다.

측정 결과 대조군인 사균체 2종보다 우수한 균주는 락토바실러스 브레비스 NS1401을 비롯하여 총 8개가 선정되었다. 참고로 측정한 일본 내 사균체 음료 3종은 저농도와 고농도에서 효과가 없는 것으로 측정되었다.

상기 언급한 실험 방법을 통해 측정한 싸이토카인 IL-12의 분비량 결과는 도 7과 같다.

측정 결과 대조군인 사균체 2종과 동등 이상 수준의 균주는 락토바실러스 브레비스 NS1401을 비롯하여 총 2개가 선정되었다. 참고로 측정한 일본 내 사균체 음료 3종은 저농도와 고농도에서 효과가 낮은 것으로 측정되었다.

세 가지 면역조절 지표의 분비량을 측정해 본 결과 5번 균주인 락토바실러스 브레비스 NS1401이 가장 면역조절 효능이 우수하였다.

[실시예 7] 선별 사균체 락토바실러스 브레비스 NS1401의 면역증진공정 개발

기존에 알려진 열처리 사균화 공정을 통해 선별된 사균체 락토바실러스 브레비스 NS1401의 면역조절 효능을 향상시키기 위해 면역증진공정을 개발하였다. 우선 상기 사균화 공정에서는 100℃에서 15분 열처리 하는 것으로 진행하였지만, 균주마다 면역에 영향을 주는 세포벽 성분이 다른 만큼 처리 조건을 다양하게 할 경우 면역증진 효과를 기대할 수 이다는 전제하에 발명을 진행하였다.

일반적으로 프로바이오틱스 유산균을 섭취하게 되면 장 속에서 성장을 마친 균주는 사멸 과정을 거치게 된다. 이 과정 중 세포벽 성분이 분해되는 등 다양한 기작에 의해 장 내 면역세포에 영향을 주게 되고 면역반응을 유도하게 된다. 세포벽 성분이 분해된다는 것은 세포벽 내 면역조절 성분으로 알려진 Peptidoglycans 및 LTA(Lipoteichoic acid) 등이 조금 더 흡수되기 쉬운 형태로 변하게 된다는 것으로 유추할 수 있다.

따라서 본 발명에서는 기존 열처리 사균체 공정을 선별 균주인 락토바실러스 브레비스NS1401에 최적화 하는 한편, 단백분해효소와 라이소자임(Lysozyme) 효소를 배양공정 후 적용시킴으로써 면역조절 효능이 향상되는지 확인해 보았다.

면역증진공정을 적용시키는 제조공정은 상기 도 1과 같으며, 상세 실험군은 표 7과 같다. 참고로 일본에서 면역효능으로 현재 판매중인 사균체 원료를 확보하여 대조군으로 비교 평가하였다.

실험군에서 사용된 단백분해 효소의 처리는 유산균 배양액을 50~55℃ 온도에서 1~10시간 처리하였으며, Lysozyme은 20~50℃에서 1~10시간 처리하였다. 효소 처리를 위한 배양액 pH조건은 3~8.5 로 조절 후 진행하였다.

면역증진 공정 개발을 위한 실험조건]

No.	샘플명	균주명
Control		100℃, 15분
1	온도조건	50℃, 30~60분
2		70℃, 30~60분
3		100℃, 30~60분
4		121℃, 30~60분
5	단백분해	Maxazyme 전체 액량 중량부 대비 0.1~3 처리 후 100℃, 15분 열처리
6		Flavorzyme 전체 액량 중량부 대비 0.1~3 처리 후 100℃, 15분 열처리
7		Alcalase 전체 액량 중량부 대비 0.1~3 처리 후 100℃, 15분 열처리
8	Lysozyme	Lysozyme 전체 액량 중량부 대비 0.1~4 처리 후 80~100℃, 15~60분 열처리
9		Lysozyme 전체 액량 중량부 대비 0.1~4 처리 후 100~120℃, 15~60분 열처리
10		Lysozyme 전체 액량 중량부 대비 4~10 처리 후 80~100℃, 15~60분 열처리
11		Lysozyme 전체 액량 중량부 대비 4~10 처리 후 80~100℃, 15~60분 열처리
12	대조군	일본 사균체 샘플 1
13		일본 사균체 샘플 2
14		일본 사균체 샘플 3
15		일본 사균체 샘플 4

상기 언급한 실험 방법을 통해 측정한 싸이토카인 IFN- γ의 분비량 결과는 도 8과 같다.

측정 결과 기존 Control보다 우수한 조건이 3가지 확인되었다. 3번 조건은 100 ℃ 온도에서 30~60분 열처리 하는 것이었으며, 7번 조건은 Alcalase 단백분해효소를 전체 액량 중량부 대비 0.1~3으로 1~10시간 처리 후 100 ℃ 15분 열처리 한 것이었다. 9번 조건은 Lysozyme 전체 액량 중량부 대비 0.1~4로 1~10시간 처리 후 100~120℃?에서 15~60분 열처리 한 것이었다.

즉, 열처리 및 특정 단백분해 효소, 라이소자임 처리시 IFN- γ 분비량이 증진되는 것을 확인할 수 있었다.

상세한 공정 최적화를 위해 다른 면역지표인 IL-12 분비량을 측정하여 비교 평가해 보았다(도 9). 실험 방법은 상기 언급한 것과 동일하다.

측정 결과 기존 Control보다 우수한 조건이 3가지 확인되었다. 4번 조건은 121 ℃ 온도에서 30~60분 열처리 하는 것이었으며, 7번 조건은 Alcalase 단백분해효소를 전체 액량 중량부 대비 0.1~3으로 처리 후 100 ℃ 15분 열처리 한 것이었다. 9번 조건은 Lysozyme 전체 액량 중량부 대비 0.1~4 처리 후 100~120℃에서 15~60분 열처리 한 것이었다.

특히, 9번 조건의 경우 기존 열처리 조건 대비 4배 이상 IL-12 분비량이 획기적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 일본에서 현재 시판중인 사균체 제품보다 더욱 우수한 것으로 판단할 수 있다.

즉, 세포벽 내 면역조절 관련 인자들이 Lysozyme에 분해되어 그 효능이 증진됨을 확인할 수 있었다. 또한 Lysozyme의 농도 의존적인 결과가 아닌 최적 농도에 의한 분해가 중요함을 확인할 수 있었다.

따라서, IFN- γ 및 IL-12 분비량을 Control에 비해 획기적으로 증진시킬 수 있는 Lysozyme전체 액량 중량부 대비 0.1~4를 20~50℃에서 1~10시간 처리 후 100~120℃에서 15~60분 열처리(사균화) 공정을 거치는 것으로 최종 선정하였다(도 8).

그리고 Lysozyme의 최대 효소활성을 보이는 온도는 20~50℃으로 알려져 있으며, 20℃ 이하 또는 50℃ 이상의 조건에서는 면역효능이 증진되지 않는 것을 동일 실험 조건하에서 확인할 수 있었다.

또한 락토바실러스 브레비스 NS1401 사균체는Lysozyme을 1~10시간 사이로 처리하였을 때에는 그 면역활성이 증진되는 것을 확인할 수 있었으나 1시간 이내 또는 10시간 이상 처리시에는 면역효능이 증진되지 않는 것을 동일 실험 조건하에서 확인할 수 있었다.

Lysozyme을 처리하기 위한 pH 조건은 3~8.5 사이가 적절하다. pH가 3 이하 또는 8.5 이상에서는 Lysozyme의 활성이 낮아져 면역효능이 증진되지 않는 것을 동일 실험 조건하에서 역시 확인할 수 있었다.

그리고 원심 분리하여 균체 회수 후 건조방법에 따른 면역조절 효능 차이 변화를 확인해 보았는데, 건조방법에 따른 차이는 발생하지 않았다. 즉 분무건조(Spray dry) 시에도 내열성이 높아 면역조절 성분에 영향이 없음을 유추할 수 있다.

[실시예 8] 사균체 제제의 제조

본 발명의 락토바실러스 브레비스NS1401 사균체를 활용하여 건강기능식품, 정장제 등의 스틱형 제제를 제조하였다. 이를 위하여 락토바실러스 브레비스 NS1401분말 20중량%에 무수결정 포도당 20중량%, 결정과당 7중량%, 과일 분말향 3중량%, 식이섬유 20중량%, 비타민 혼합분말 3중량%, 식물성 분말크림 15중량%, 과일 분말 12중량%를 혼합하였다. 이후 스틱 또는 캡슐 형태로 일정량 분주하여 포장하였다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM11594P

20141030

Claims

20~50℃의 pH 3~8.5 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis NS1401(KCCM11594P)) 배양액에 라이소자임(Lysozyme)을 전체 액량 중량부 대비 0.1~4 중량부 첨가하여 1~10시간 처리하고,
라이소자임(Lysozyme) 처리액을 100~120℃ 온도로 조절하여 15~60분 열처리 하는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 브레비스 NS1401(Lactobacillus brevis NS1401(KCCM11594P)) 사균체의 제조 방법.
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