KR101712981B1 - 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말의 제조방법 - Google Patents
산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발효산양유분말 16중량%와, 망고분말 48중량%와, 비타민C 0.8중량%와, 폴리덱스트로오즈(polydextrose) 15.2중량% 및 말토덱스트린(maltodextrin) 20중량%로 구성되는 것을 특징으로 하는 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말에 관한 것이다.
Description
본 발명은 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 발효산양유분말 16중량%와, 망고분말 48중량%와, 비타민C 0.8중량%와, 폴리덱스트로오즈(polydextrose) 15.2중량% 및 말토덱스트린(maltodextrin) 20중량%로 구성되는 것을 특징으로 하는 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말에 관한 것이다.
유산균은 미생물 중에서 가장 유익한 종류로서 오랜 역사를 두고 발효 유제품을 중심으로 인류의 생활에 직간접적으로 밀접한 관계를 맺고 있다.
현재 유산균은 대표적인 프로바이오틱스(probiotics) 균주로 장내 미생물의 균형을 개선함으로서 숙주인 사람에 대하여 유익하게 작용한 균주로 GRAS(Generally Recognized As Safe)로써 오랜 역사를 두고 각종 발효식품(유제품, 장류, 김치, 발효소세지) 등으로 인류가 꾸준하게 섭취하고 있으며, 프로바이오틱스 균주는 인류생활에 광범위하게 적용되고 있다.
프로바이오틱스(Probiotics) 균주는 기존에는 정장작용 또는 변비예방 등의 효능이 주로 이뤄지고 있으나 현재 다양한 효능이 검증되고 있으며, 특히 유산균을 대상으로 유산균이 생성하는 항균성 물질, 콜레스테롤 저하 물질, 골다공증 예방 등 다양한 기능성을 강조한 프로바이오틱스 효능 연구들이 많이 이루어지고 있다.
또한 특정 프로바이오틱스 균주는 면역기능을 증강시키는 다양한 면역물질이 함유되어 있어 이에 대한 연구가 진행 중에 있으며, 최근 들어 비만이나 알러지 예방 등 질병 예방 및 생체 방어기능에 관련된 기능이 관찰되기도 한다.
본 발명은 면역기능이 우수한 유산균주가 접종된 발효산양유분말을 포함하는 면역증진용 프로바이오틱스 분말 제품을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기와 같은 목적을 위하여 본 발명에 따른 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말의 제조방법은 증류수 100중량부에 대하여 산양유 분말 1중량부를 혼합한 다음 90℃로 10분간 살균 후 42℃로 냉각시켜 조성된 산양유 100중량부에 대하여, 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)가 1:1:1:1 비율로 혼합된 유산균 1중량부를 접종한 다음 42℃로 8시간 배양한 후 동결건조하여 발효산양유분말을 제조하는 단계; 및 상기 발효산양유분말 16중량%와, 망고분말 48중량%와, 비타민C 0.8중량%와, 폴리덱스트로오즈(polydextrose) 15.2중량% 및 말토덱스트린(maltodextrin) 20중량%를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
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상기와 같이 이루어지는 본 발명은 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus) 및 락토바실러스 람노수스(L. rhamnosus)중 하나 또는 둘 이상의 유산균이 접종된 발효산양유분말이 첨가되어 면역력이 우수하고, 망고분말과 비타민 C가 첨가되어 색감과 맛이 우수한 장점이 있다.
도 1a 내지 1c은 MRS Broth 배지에 배양한 유산균주 배양액의 Raw 264.7 세포의 생존능.
도 2는 열처리한 유산균주의 추출액에 대한 Raw 264.7 세포의 생존능.
도 3은 MRS Broth 배지에 배양한 유산균주 배양액의 Raw 264.7 세포에서의NO(Nitric Oxide.산화질소) 생성 억제능.
도 4는 유산균체 추출액의 Raw 264.7 세포에서의 NO 생성 억제능.
도 5는 산양유 분말 농도에 따른 선택균주의 생균수 변화.
도 6은 산양유 분말의 농도에 따른 Raw 264.7 세포의 생존율.
도 7은 농도별 산양유 분말 처리시 Raw 264.7 세포에서의 NO 생성 억제능 측정결과.
도 8은 1% 산양유 분말에서 유산균주의 배양시간에 따른 생균수 및 pH 변화.
도 9는 growth factor를 첨가한 산양유 분말에서의 유산균주의 생균수 변화.
도 10은 유산균주의 산양유 분말 배양액 및 MRS Broth 배양액을 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 증식능(P<0.05)
도 11은 유산균주의 산양유 분말 배양액 및 MRS Broth 배양액을 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 증식능.
도 2는 열처리한 유산균주의 추출액에 대한 Raw 264.7 세포의 생존능.
도 3은 MRS Broth 배지에 배양한 유산균주 배양액의 Raw 264.7 세포에서의NO(Nitric Oxide.산화질소) 생성 억제능.
도 4는 유산균체 추출액의 Raw 264.7 세포에서의 NO 생성 억제능.
도 5는 산양유 분말 농도에 따른 선택균주의 생균수 변화.
도 6은 산양유 분말의 농도에 따른 Raw 264.7 세포의 생존율.
도 7은 농도별 산양유 분말 처리시 Raw 264.7 세포에서의 NO 생성 억제능 측정결과.
도 8은 1% 산양유 분말에서 유산균주의 배양시간에 따른 생균수 및 pH 변화.
도 9는 growth factor를 첨가한 산양유 분말에서의 유산균주의 생균수 변화.
도 10은 유산균주의 산양유 분말 배양액 및 MRS Broth 배양액을 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 증식능(P<0.05)
도 11은 유산균주의 산양유 분말 배양액 및 MRS Broth 배양액을 처리한 Raw 264.7 세포의 세포 증식능.
이하, 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말의 제조방법에 대하여 설명하도록 한다.
1. 연구방법.
1) 면역증진 유산균(Lactic acid bacteria) 선정.
(1) 실험에 사용한 유산균주 및 대식세포 배양.
건강기능식품의 기준 및 규격에 프로바이오틱스로 등록되어있는 유산균 11종(Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. longum, Lactobacillus acidophilus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei, L. helveticus, L. plantarum, L. rhamnosus, Leuconostoc lactis 및 Streptococcus thermophilus)을 한국미생물보존센터(Korea)에서 분양받아 실험에 사용하였으며, 면역증진에 미치는 영향을 알아보기 위하여 마우스의 대식세포인 RAW 264.7 세포를 한국세포주은행(Korea)에서 분양받아 이용하였고, 배지로는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum)(FBS, Gibco, USA)과 100U/ml의 스트렙토마이신/페니실린(streptomycin/penicillin)(Gibco, USA)을 첨가한 DMEM 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium)(Gibco, USA)을 이용하여 5% CO2 incubator에서 37℃로 2~3일마다 계대배양하면서 실험에 사용하였다. 유산균은 MRS broth (Oxoid, England)배지를 이용하여 37℃에서 48시간 동안 배양하여 활성화시킨 후 실험에 사용하였다.
(2) 균주의 전처리.
유산균주를 MRS broth 배지에 접종하여 37℃에서 48시간 배양시킨 후 1.08 CFU/ml이 되도록 희석시킨 후 10,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액(supernatant)과 고형분(pellet)으로 분리하였다. 상등액(supernatant)은 0.45㎛ 실린지 필터(syringe filter)로 여과 후 멸균한 증류수를 이용하여 희석하여 시료로 사용하였다. 고형분(pellet)은 멸균 증류수로 2회 세척한 후 증류수 1ml에 현탁한 후 100℃에서 30분동안 열처리 한 후 10,000rpm에서 10분간 원심분리하였고, 상등액을 0.45㎛ 실린지 필터(syringe filter)로 여과 후 -80℃에서 보관하면서 시료로 사용하였다.
(3) 세포 생존능 측정.
유산균주의 배양액과 균체 파쇄액이 Raw 264.7 세포의 성장에 미치는 영향을 측정하였다. 96 well plate에 4x104 cells/well의 수로 계대배양하여 24시간 동안 안정화를 시킨 후 각각의 시료를 처리하여 24시간 동안 반응시켰다. 그 후 PrestoBlueTM 시약(Invitrogen, USA)를 10㎕씩 첨가하여 37℃에서 20분 동안 반응시킨 후 효소결합면역흡착검정 판독기(ELISA reader)(DYEX, USA)를 이용하여 570nm(reference 600nm)에서 흡광도를 측정하였다. 시료를 처리하지 않은 대조군의 흡광도를 100%로 하여 세포 증식정도를 나타내었다.
(4) 산화질소(Nitric Oxide. 이하 NO) 생성 억제능 측정.
지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)(sigma, USA) 자극으로 활성화된 Raw 264.7 세포에서 유산균주의 배양액과 균체 파쇄액이 NO 생성에 미치는 영향을 측정하였다. 96 well plate에 4x104 cells/well의 수로 계대배양하여 24시간동안 안정화를 시켰다. 각각의 시료를 처리하고 2시간 후 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)를 1㎍/mL의 농도로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 상등액 100㎕에 동량의 그리스 시약(Griess reagent)(Promega, USA)를 첨가하여 실온에서 20분 동안 방치한 후 효소결합면역흡착검정 판독기(ELISA reader)로 530nm에서 흡광도를 측정하였다. NO의 농도는 질산나트륨(Sodium nitrate)를 이용하여 표준곡선을 작성하여 계산하였다.
2) 선택된 유산균주의 내산성 및 내담즙성 측정.
(1) 내산성 측정.
내산성 시험은 1N HCl을 사용하여 pH 2.5으로 조정한 MRS broth 배지에 펩신(pepsin) 1%를 첨가하여 준비하고, MRS broth 배지에 37℃에서 48시간 동안 배양한 균주 4종을 각각 2%씩 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 3시간 후 0.85% 생리식염수를 이용하여 십진희석법으로 희석한 후 BCP한천배지를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하여 생균수를 측정하였으며 배양 전 생균수와 비교하여 생존율을 계산하였다.
(2) 내담즙성 측정.
내담즙성 시험은 MRS broth 배지에 0.3% 담즙산염(bile salt)(Sigma, USA)를 첨가하여 멸균한 후, MRS broth 배지에 37℃에서 48시간 동안 배양한 균주 4종을 각각 2%씩 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양하였다. 그 후 0.85% 생리식염수를 이용하여 십진희석법으로 희석한 후 BCP한천배지를 이용하여 37℃에서 48시간 배양하여 생균수를 측정하였으며 배양 전 생균수와 비교하여 생존율을 계산하였다.
3) 면역활성 증진을 위한 배양배지 검토.
(1) 산양유 분말 농도에 따른 유산균 배양.
증류수 100중량부에 대하여 산양유 분말 1중량부를 첨가한 다음 90℃에서 10분간 살균시키고 42℃로 냉각한 후 MRS broth 배지에서 활성화시킨 유산균을 각각 1%씩 접종하여 42℃에서 24시간 배양한 후 BCP 한천배지를 이용하여 유산균수를 측정하였다.
(2) 산양유 분말이 Raw 264.7 세포의 생존율 및 NO 생성 억제능에 미치는 영향.
산양유 분말을 증류수로 희석하여 1%로 제조하고 90℃에서 10분간 살균시킨 후 8,500rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액(supernatant)을 0.45㎛ 필터로 여과한 후 Raw 264.7 세포에 6.25~100㎕/ml의 농도로 시료를 처리한 후 세포생존율 및 NO 생성 억제능을 측정하였다.
4) 산양유 분말에서의 유산균주의 고농도 배양을 위한 연구.
(1) 산양유 분말에서의 유산균 배양 특성 측정.
증류수 100중량부에 산양유 분말 1중량부를 첨가한 다음 90℃에서 10분간 살균시키고 42℃로 냉각한 후 MRS broth 배지에서 48시간동안 배양하여 활성화 시킨 유산균주를 각각 1%씩 단독 및 혼합(4종의 균주를 각각 0.25%씩 총 1%가 되도록 접종)하여 접종한 후 42℃에서 48시간 동안 배양하면서 생균수 및 pH 변화를 측정하였다.
(2) 유산균주의 고농도 배양을 위한 조건 검토.
1% 산양유 분말에 탄소원으로써 포도당(glucose) 및 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide)를 각각 1%, 2% 및 3% 첨가한 후 90℃에서 10분간 살균시킨 후 냉각하였다. MRS broth 배지에서 37℃에서 48시간 동안 활성화 시킨 유산균주 4종을 0.25%씩 총 1%가 되도록 접종한 후 42℃에서 24시간 동안 배양하면서 생균수를 측정하였다.
5) 발효된 산양유 분말의 면역활성 증진효과 측정.
증류수 100중량부에 산양유 분말 1중량부를 첨가한 다음 90℃에서 10분간 살균하여 42℃로 냉각한 후 MRS broth 배지에서 48시간동안 배양하여 활성화 시킨 유산균을 각각 1%씩 단독 및 혼합(4종의 균주 각각 0.25%씩 총 1%가 되도록 접종)하여 접종한 후 42℃에서 유산균수가 108 CFU/ml되도록 배양하였다. 8,500rpm에서 10분간 원심분리한 후 상등액(supernatant)을 취하여 0.45㎛ 필터로 여과한 후 Raw 264.7 세포에 100㎕/ml의 농도로 시료를 처리한 후 세포생존율 및 NO 생성 억제능을 측정하였다.
6) 통계.
데이터는 평균표준편차로 나타내었으며, 통계는 Statistics Base 18(SPSS 18) 프로그램을 이용하여 일원배치분산분석(One-way ANOVA)를 실시한 후 Duncan의 다중범위검정(Duncan's multiple range test)를 이용하여 사후검정을 실시하였으며, 유의수준은 p값(p-value)<0.05로 나타내었다. 또한 독립 t검정(Indepentent t-test)은 유의수준 p값(p-value)<0.05로 데이터를 분석하였다. (여기에서, p값이라 함은 통계학 용어로서 귀무가설(null hypothesis)이 맞다는 전제하에 통계값이 실제로 관측된 값 이상일 확률을 의미한다.)
연구결과.
1) 면역증진 유산균(Lactic acid bacteria) 선정.
(1) 유산균주 배양액 및 균체에 의한 Raw 264.7 세포 생존능 측정.
면역증진 유산균주 선정을 위하여 표준미생물균주 11종을 대상으로 면역활성을 측정하였다. 표준미생물균주는 한국미생물보존센터(KCCM)에서 구입하여 사용하였으며, 표준미생물균주는 건강기능식품공전에 등록되어 있는 Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. longum, Lactobacillus acidophillus, L. delbrueckii subsp. bulgaricus, L. casei, L. helveticus, L. plantarum, L. rhamnosus, Leuconostoc lactis 및 Streptococcus thermophilus 을 우선적으로 선정하여 사용하였다. 면역활성 측정은 Raw 264.7 세포를 사용하여 세포생존능 및 NO 생성 억제능을 측정하였다. 유산균은 1차적으로 MRS broth 배지에서 배양하였고, 실험원료는 배양액과 유산균체를 분리하여 사용하였다. 배양액의 경우 모든 실험구에서 10배 희석시 Raw 264.7 세포의 성장을 억제하는 것으로 나타난 반면, 1000배 이상 희석한 배양액에서는 Raw 세포의 성장을 억제하지 않는 것으로 나타났다. 따라서 Raw 264.7 세포에 독성이 나타나지 않는 1000배 희석한 배양액을 이용하여 NO 생성억제에 미치는 영향을 측정하기로 결정하였다.
유산균체에 대한 면역활성을 확인하기 위하여 열처리를 실시한 균체 추출액을 Raw 세포에 처리하여 세포 생존능을 측정하였다. 모든 실험군에서 Raw 264.7 세포의 성장을 억제하지 않는 것으로 나타났으며, 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus)와 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum)은 대조구 대비 약 13% 및 11% 정도 Raw 264.7 세포의 성장을 촉진시키는 경향으로 나타났다. 따라서 Raw 264.7 세포에 독성이 나타나지 않는 유산균체 추출액을 이용하여 NO 생성억제에 미치는 영향을 측정하였다.
(2) 유산균주 배양액 및 균체에 의한 Raw 264.7 세포의 NO 생성 억제능 측정.
대식세포는 체내에 들어온 이물질을 탐식하거나 NO를 생성함으로써 외부에서 침입한 세균이나 종양세포를 파괴한다. 그러나 과도한 염증반응으로 인해 세포독성물질인 NO가 과다 생성될 시 조직의 손상, 유전자 변이, 신경의 손상 및 혈관 투과성을 증가시켜 부종 등을 일으키는 등 인체에 부정적인 영향을 줄 수 있다. 따라서 대식세포인 Raw 264.7 세포에 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS)를 처리하여 NO 생성을 유도한 후 유산균주의 배양액과 균체가 NO 생성을 억제하는 정도를 확인하였다.
MRS broth 배지에 배양한 유산균주 배양액은 모든 실험군에서 유의하게 NO 생성을 억제하는 것으로 보였다. 그러나 MRS broth 배지 자체에서도 이와 유사하게 나타나 실험군의 NO 생성 억제능은 MRS broth 배지에 의한 것으로 생각되어진다. MRS broth 배지는 식품소재로 직접 사용하기에는 어려움이 있으므로 식품소재로 사용가능한 면역증진 base 소재로 산양유를 이용하고자 하였다.
열처리한 유산균체 추출액의 NO 생성능을 측정한 결과 모든 군에서 유의하게 NO 생성을 억제하는 것으로 보였으며, 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)와 락토바실러스 카세이(L. casei)는 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS) 양성 대조군 대비 30%이상 NO 생성을 억제하는 경향을 나타냈다.
세포 생존율은 1000배 이상 희석한 배양액에서는 Raw 세포의 성장을 억제하지 않는 최대 농도로 나타났으며, 열처리를 한 균체 추출액에서는 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus)와 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum)은 대조구 대비 약 13% 및 11% 정도 Raw 264.7 세포의 성장을 촉진시키는 경향으로 나타났다.
또한 NO 생성 억제능은 배양액에서는 유산균주 배양시 기본배지인 MRS broth 배지 자체에서 NO 생성을 억제하는 것으로 생각되어지며, 균체 추출액에서는 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)와 락토바실러스 카세이(L. casei)가 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS) 양성 대조군 대비 30%이상 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
따라서 세포 생존율과 NO 생성 억제능에 효과가 있는 것으로 나타난 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 4종을 면역활성을 증진시키는 유산균주로 선정하였다.
2) 선택된 유산균주의 내산성 및 내담즙성 측정.
면역활성을 증진시키는 유산균주로 선정한 4종에 대하여 위산과 담즙산에서의 생존율을 측정하였다.(표1 내지 2 참조) 그 결과 모든 균주가 위산 및 담즙산에서 약 95% 이상 및 84% 이상 생존하는 것을 나타낸 것으로 보아 4종 모두 내산성 및 내담증성이 우수한 것으로 나타났다.
| 균주 |
배양 전 (log CFU/mL) |
배양 후 (log CFU/mL) |
생존율(%) |
| pH 7.0 | pH 2.5 | ||
| 비피도박테리엄 비피덤 (B. bifidum) |
7.92 | 7.65 | 96.59 |
| 락토바실러스 카세이 (L. casei) |
7.46 | 7.06 | 94.64 |
| 락토바실러스 헬베티커스 (L. helveticus) |
7.82 | 7.77 | 99.36 |
| 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus) |
7.80 | 7.70 | 98.72 |
| 균주 |
배양 전 (log CFU/mL) |
배양 후 (log CFU/mL) |
생존율(%) |
| 비피도박테리엄 비피덤 (B. bifidum) |
7.45 | 7.32 | 98.26 |
| 락토바실러스 카세이 (L. casei) |
7.10 | 6.82 | 96.06 |
| 락토바실러스 헬베티커스 (L. helveticus) |
7.68 | 6.53 | 85.03 |
| 락토바실러스 람노서스 (L. rhamnosus) |
7.88 | 6.60 | 83.76 |
3) 면역활성 증진을 위한 유산균의 배양배지 검토.
(1) 산양유 분말의 유산균의 배양배지 검토.
선택된 유산균주의 고농도 배양 및 면역활성을 높이기 위해 MRS broth 배지 이외의 배양 배지를 검토하였고, 천연의 배양배지를 이용하기 위하여 산양유 분말을 사용하여 표준균주를 배양하였다. 1%와 5% 농도로 조정한 산양유 분말에 선택균주를 배양한 결과 약 108 CFU/ml 이상의 생균수를 보였으며, 산양유 분말 농도가 높을수록 유산균수가 증가하는 경향을 보였다. 1% 산양유 분말에서 유산균의 성장이 크게 저해되지 않는 것으로 나타난 것으로 보아 산업화시 유산균 배양 비용을 절감하기 위하여 1%의 산양유 분말을 배양배지로 선정하였으며, 이를 이용하여 면역활성 증진 확인 시험을 실시하였다.
(2) Raw 264.7 세포를 이용한 산양유 분말의 면역활성 증진 효과 검토.
1% 산양유 분말을 Raw 264.7 세포에 6.25, 12.5, 25, 50 및 100㎕/mL로 처리하였고, MRS broth 배지는 앞선 실험에서 세포생존율에 독성을 보이지 않았던 10-3 의 농도로 처리한 후 세포생존율 및 NO 생성 억제능을 측정하였다. 세포생존율은 산양유 분말 처리 농도가 증가할수록 증가하였으며, 특히 산양유 분말을 12.5㎕/mL 이상 처리시 세포생존율은 MRS 대비 약 9.7%~16.5%로 유의적으로 증가하였다.
NO 생성 억제능은 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS) 양성대조군과 비교시 모든 실험군에서 유의적으로 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났고, 산양유 분말 농도가 높아질수록 NO 생성 억제능이 약간 증가하는 경향이 나타났으며, MRS broth 배지 대비 약 2.5~10.1%로 NO 생성을 억제하는 경향을 나타내었으므로 산양유 분말은 면역활성이 있을 것으로 예상되어졌다.
4) 산양유 분말에서의 유산균주의 고농도 배양을 위한 연구.
(1) 산양유 분말에서의 유산균주의 배양 특성.
선택된 유산균주의 1% 산양유 분말에서의 생육특성을 확인하기 위하여 1% 산양유 분말에서 유산균주의 배양시간에 따른 생균수 및 pH를 측정하였다. 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 4종 혼합균주는 배양 6시간에 108 CFU/mL에 도달하였으며, 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus)는 12시간 배양시에 108 CFU/ml에 도달하였다가 24시간째에 107 CFU/mL으로 감소하였다. pH는 모든 실험군에서 배양 6시간에 4.0으로 급격히 감소하였으며 그 후에는 pH가 소량 감소하는 것으로 나타났다.
(2) 유산균주의 고농도 배양을 위한 조건 검토.
1% 산양유 분말에서 유산균주의 고농도 배양을 위하여 유산균이 에너지원으로 사용하는 포도당(glucose)와 프리바이오틱스(prebiotics) 효능을 가지는 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide)을 농도별로 첨가하여 유산균주의 생균수를 측정하였다. 산양유 분말에 포도당(glucose) 첨가시 배양 12시간에 109 CFU/ml로 성장하였으나 농도에 따른 차이는 없었다. 프락토올리고당(Fructo-oligosaccharide) 첨가시에는 1% 첨가구에서는 배양 12시간에 생균수는 109 CFU/ml에 도달하였고, 2% 및 3% 첨가구는 배양 8시간에 108 CFU/ml의 생균수에 도달하였으며 프락토올리고당( fuctooligosaccharide) 첨가농도가 증가할수록 생균수가 감소하는 경향을 보였다.
5) 선택된 유산균주로 발효된 산양유 분말의 면역활성 증진효과 측정.
1% 산양유 분말 발효시 유산균수가 108 CFU/ml에 도달하였을 때 면역활성 측정 시료로 사용하였다.사전연구에서 Raw 264.7 세포에서 독성을 나타내지 않는 산양유 분말 및 발효된 산양유 분말의 농도는 100㎕/ml 이였으며, 이를 세포에 처리하여 세포생존율을 측정하였다. 세포생존율은 락토바실러스 카세이(L. casei)와 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus)는 비발효 산양유 분말 처리구에 비하여 유의적으로 증가하였으며, 특히, 비발효군 대비 약 11.4% 및 15.2% 정도 세포 성장을 유도하는 것으로 나타났다. 또한 MRS 배양액과 산양유 분말 배양액과 비교시 산양유 분말 배양액 처리구에서 더 높은 세포생존율을 보였으며, 특히 락토바실러스 카세이(L. casei)는 MRS 배양액과 비교시 약 14.5%로 유의적으로 더 높게 세포의 성장을 유도하는 것으로 나타났다.
1% 산양유 분말에 유산균을 접종하여 NO 생성 억제능을 측정한 결과, 지질다당류(lipopolysaccharide: LPS) 양성대조군에 비하여 모든 군에서 유의적으로 NO 생성을 억제하는 것으로 나타났으며, 비발효 산양유 분말과 비교시 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus), 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus) 및 4종 혼합 배양한 산양유 분말 배양액에서 유의적으로 NO 생성 억제능이 더 높은 것으로 나타났다. MRS broth 배양액과 산양유 분말 배양액의 NO 생성 억제능을 비교한 결과 산양유 분말 배양액이 NO 생성 억제능이 더 큰 것으로 나타났으며, 특히 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum)과 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)로 발효한 산양유 분말 배양액은 5.6% 및 17.4%로 유의적으로 높은 NO 생성 억제능을 보였다.
본 발명에 따른 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말은 상기 발효산양유분말 16중량%와, 망고분말 48중량%와, 비타민C 0.8중량%와, 폴리덱스트로오즈(polydextrose) 15.2중량% 및 말토덱스트린(maltodextrin) 20중량%로 구성된다.
망고는 항산화 활성을 가지는 카로테노이드, 아스코르빈산 및 퀘르세틴, 캠퍼롤과 같은 폴리페놀을 가지고 있으며, 특히 비타민 A로서 가장 활성이 높은 베타카로틴(β-carotene)이 풍부하다. 이는 활성산소를 제거하며, 시각형성, 피부재생 및 면역 기능의 증진에 도움이 된다. 따라서, 상기 망고분말을 첨가함으로써 면역기능 증진에 대한 시너지 효과 및 망고 자체의 색감과 단맛 등의 기호도를 향상시킨다.
다음으로, 비타민 C는 괴혈병 예방, 콜라겐 형성, 철분 흡수 촉진 및 면역시스템 강화 뿐만 아니라 산화적 스트레스 관련 질병을 예방하는 장점이 있다. 본 발명은 이러한 효과를 갖는 비타민 C를 첨가함으로써 면역증진 활성과 신맛을 증진시킨다.
다음으로, 폴리덱스트로오즈(polydextrose)는 난소화성 다당류로서 저에너지를 내는 수용성 식이섬유이며, 배변활동을 원활하게 돕는 장점이 있다. 또한, 말토덱스트린(maltodextrin)은 주로 옥수수로부터 생산되는 것으로, 저흡습성으로 수분 흡수가 바람직하지 않은 식품에 이용된다. 상기 폴리덱스트로오즈(polydextrose) 및 말토덱스트린(maltodextrin)은 자체적인 장점과 함께 증량제의 용도로서 사용된다.
실시예.
증류수 100중량부에 대하여 산양유 분말 1중량부를 혼합한 다음 90℃로 10분간 살균 후 42℃로 냉각시켜 산양유를 조성하였다. 이후, 상기 산양유 100중량부에 대하여 유산균 1중량부를 접종한 다음 42℃로 8시간 배양한 후 동결건조하여 발효산양유분말을 조성하였다.
여기에서, 상기 유산균은 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)를 각각 0.25중량%씩 혼합하였다.
다음으로, 상기 발효산양유분말 16중량%와, 망고분말 48중량%와, 비타민C 0.8중량%와, 폴리덱스트로오즈(polydextrose)15.2중량% 및 말토덱스트린(maltodextrin) 20중량%를 혼합하여 본 발명에 따른 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말을 조성하였다.
Claims (4)
- 증류수 100중량부에 대하여 산양유 분말 1중량부를 혼합한 다음 90℃로 10분간 살균 후 42℃로 냉각시켜 조성된 산양유 100중량부에 대하여, 비피도박테리엄 비피덤(B. bifidum), 락토바실러스 카세이(L. casei), 락토바실러스 헬베티커스(L. helveticus) 및 락토바실러스 람노서스(L. rhamnosus)가 1:1:1:1 비율로 혼합된 유산균 1중량부를 접종한 다음 42℃로 8시간 배양한 후 동결건조하여 발효산양유분말을 제조하는 단계; 및
상기 발효산양유분말 16중량%와, 망고분말 48중량%와, 비타민C 0.8중량%와, 폴리덱스트로오즈(polydextrose) 15.2중량% 및 말토덱스트린(maltodextrin) 20중량%를 혼합하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 산양유가 함유된 면역증진용 프로바이오틱스 분말의 제조방법.
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