KR20150019435A - 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110, 바실러스 서틸리스 SCK B1108, 바실러스 서틸리스 SCK B1109, 바실러스 서틸리스 SCS B1106 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주 및 상기 균주를 포함하는 식품에 관한 것으로, 본 발명의 전통 장류에서 분리한 5종의 바실러스 속 균주가 장류의 발효 과정 동안 발생하는 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해하는 것을 통해, 본 발명의 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.

Description

바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도{Bacillus strains having degradation activity of biogenic amine and uses thereof}
본 발명은 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110, 바실러스 서틸리스 SCK B1108, 바실러스 서틸리스 SCK B1109, 바실러스 서틸리스 SCS B1106 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주 및 상기 균주를 포함하는 식품에 관한 것이다.
장류는 한국인의 식탁에 필수적인 음식 재료이기 때문에 식품으로서 안전성 확보는 무엇보다 중요한 요소이다. 전통 발효 방식의 장류 발효과정에서 식품안전을 좌우하는 3가지 주요 인자는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 그룹이 생산하는 장 및 구토 독소, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus)나 아스퍼질러스 파라시티쿠스(Aspergillus parasiticus)가 생산하는 아플라톡신(aflatoxin), 발효 미생물들에 의해 생산되는 바이오제닉 아민(biogenic amine) 등으로 요약된다. 이들 중 바이오제닉 아민은 미생물의 아미노산 디카르복실라제 작용으로 아미노산으로부터 생성되며 치즈, 소시지, 포도주 등의 발효나 생선 등의 부패에 관여하는 아크로모나스(Acromonas), 바실러스(Bacillus), 시트로박터(Citrobacter), 클로스트리디움(Clostridium), 에스케리키아(Escherichia), 클렙시엘라(Klebsiela), 락토바실러스(Lactobacillus), 페디오코커스(Pediococcus), 프로테우스(Proteus) 및 슈도모나스(Pseudomonas) 속의 세균들이 가지는 것으로 알려져 있다. 바이오제닉 아민은 인체의 생리 기능을 유지하기 위한 필수 물질로서 미량이 대사 과정을 통해 균형을 이루고 있지만 식품에서 과량 섭취 시에는 독성을 나타낸다. 특히 아미노산과 단백질 함량이 높은 콩 또는 우유 함유 식품에서는 발효 과정 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민이 생성될 수 있다. 이들 중 히스타민(histamine)의 과잉 섭취는 혈압강하와 알레르기를, 티라민(tyramine)은 혈압 상승 및 두통을, 카다베린(cadaverine)과 퓨트레신(putrescine)은 장에서 강력한 발암물질인 니트로사민(nitrosamines), 니트로소피페리딘(nitrosopiperidine) 및 니트로소피롤리딘(nitrosopyrrolidine)을 생성할 수 있다. 이런 위해성 때문에 유럽연합(EU)은 2008년부터 2011년까지 치즈, 포도주, 소시지 등의 유럽 전통 발효 식품들을 대상으로 바이오제닉 아민을 감소시키기 위한 프로젝트를 수행하였다.
전통 장류의 발효 과정은 주로 바실러스(Bacillus), 아스퍼질러스(Aspergillus), 유산균 및 효모들의 복합적인 대사 과정으로 이루어져 있다. 장류 제조는 프로테아제(proteases) 활성이 높은 바실러스와 아스퍼질러스 속으로 단백질 함량이 높은 콩을 가수분해하는 과정을 거치며, 적절한 증식 온도와 여러 미생물들의 상호 작용에 의한 발효가 이루어지기 때문에 바이오제닉 아민이 생산되기 적당한 조건이다. 실제로 2006년 국내 유통 발효 식품 중에 바이오제닉 아민 분포를 조사한 결과에 따르면 전통 된장의 퓨트레신 함량은 99.6~1453.7(평균 462.6) mg/kg, 히스타민은 260.1~952(평균 569.4) mg/kg, 티라민은 284.7~1430.7(평균 669.5) mg/kg으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았고, 그 다음으로 멸치 젓갈, 현대식 간장, 재래식 간장, 현대식 된장 순이었다. 한국인 식단 중 바이오제닉 아민 함량이 가장 높은 식품 7종 중 4종이 장류이고, 식단 특성상 장류 사용량이 젓갈보다 더 많다는 것을 고려하면, 한국인은 식사를 통해 건강에 해로운 수준까지도 바이오제닉 아민을 섭취할 수 있다. 현재까지 아미노산 디카르복실라제 활성을 지녀 바이오제닉 아민을 생성할 수 있는 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens ), 바실러스 서틸리스( Bacillus subtilis ), 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)가 청국장에서 동정되었으며, 히스타민 디카르복실라제(histamine decarboxylase) 유전자는 결손 되었지만 티로신 디카르복실라제(tyrosine decarboxylase) 유전자를 함유한 2종의 바실러스 서틸리스 균주들이 바이오제닉 아민 함량이 낮은 청국장에서 분리되었다.
바이오제닉 아민은 모노아민 옥시다제(monoamine oxidase)와 폴리아민 옥시다제(polyamine oxidase)에 의해 분해되며 현재까지 이들 효소 활성은 마이크로코커스(Micrococcus ), 나트리네마( Natrinema ), 브레비박테리움(Brevibacterium ), 락토바실러스( Lactobacillus ), 스타필로코커스( Staphylococcus ), 아쓰로박터( Arthrobacter ), 클렙시엘라(Klebsiella ), 슈도모나스( Pseudomonas ), 세라티아( Serratia ), 살모넬라( Salmonella ) 속에서 발견되고 있다(Naila et al., 2010 J. Food Sci . 75, 139-150). 그러나 한국 전통 장류 발효에서 가장 핵심적인 역할을 하는 바실러스 속의 바이오제닉 아민 분해 능력은 바실러스 리케니포미스를 제외하고는 전혀 알려져 있지 않았다. 또한 바실러스 리케니포미스는 한국식품의약품안전청(KFDA)에서 식품 첨가물로서 현재까지 사용이 허용된 상태가 아니기 때문에 실제 장류에 적용할 수는 없는 실정이다. 이에 따라 우리는 KFDA에 GRAS (generally recognized as safe) 균주로서 장류 제조에 허용될 수 있는 바실러스 서틸리스 균주들을 대상으로 바이오제닉 아민 분해능을 조사하였다. 앞으로, 전통 장류는 전통적인 장류의 풍미는 유지하되 바이오제닉 아민 저감화를 통한 식품 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이러한 점을 고려해 본 발명에서는 전통 장류의 주 발효 세균인 바실러스 서틸리스와 바실러스 아밀로리퀘파시엔스를 중심으로 유해 물질인 바이오제닉 아민 분해능력을 가지면서 안전성 확보를 위해 독소 유전자를 함유하지 않는 균주들의 분리에 목표를 두었다.
한편, 한국등록특허 제0506721호에는 '바실러스 리케니포미스 N1 및 이를 포함하는 식물병원성 진균 방제용 미생물 제제'가 개시되어 있으나, 본 발명의 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 바실러스 속 균주 및 이의 용도에 대해서는 개시된 바가 전혀 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 전통 장류에서 바이오제닉 아민을 생산하지 않으며 바이오제닉 아민의 높은 분해 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110, 바실러스 서틸리스 SCK B1108, 바실러스 서틸리스 SCK B1109, 바실러스 서틸리스 SCS B1106 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주를 분리하였다. 상기 균주를 장류에 처리한 경우 바이오제닉 아민이 효과적으로 분해되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110 (KCCM 11312P), 바실러스 서틸리스 SCK B1108 (KCCM 11313P), 바실러스 서틸리스 SCK B1109 (KCCM 11314P), 바실러스 서틸리스 SCS B1106 (KCCM 11315P) 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주 (KCCM 11316P)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류의 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명에서는 전통 장류에서 분리한 5종의 바실러스 속 균주가 장류의 발효 과정 동안 발생하는 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해하는 것을 확인하였다. 본 발명의 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다.
도 1은 바이오제닉 아민 생성으로 인해 pH 변화가 생겨 히스티딘, 티로신 및 pH 지시자인 크레졸 레드(cresol red)가 포함된 합성 배지에서의 발색 반응을 나타낸다. A, KACC 10001; B, KACC 11240; H, KACC 13069; I, KACC 13752. C, D, E, F, G는 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 본 발명에서 분리된 바실러스 균주들임. C, 바실러스 서틸리스 SCS B1106; D, 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SCS B1307; E, 바실러스 서틸리스 SCK B1108; F, 바실러스 서틸리스 SCK B1109; G, 바실러스 서틸리스 SCC B1110.
도 2는 본 발명에서 분리한 균주의 주사 전자현미경 사진을 나타낸다. (A) 바실러스 서틸리스 SCS B1106, (B) 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SCS B1307. 막대(bar)는 1 ㎛를 나타낸다.
도 3은 바실러스 세레우스 독성의 검출을 위한 PCR 생성물의 전기영동 결과를 나타낸다. 균주: A, SCS B1106; B, SCS B1307; C, SCK B1108; D, SCK B1109; E, SCC B1110; F, 바실러스 세레우스 KACC 10097. 레인: 1, nheA; 2, nheB; 3, nheC; 4, hblA; 5, hblC; 6, hblD; 7, cytK; 8, plcR - papR; 9, cesA; 10, cesB; 11, 양성 대조구인 부분적 16S rRNA 유전자 (282bp)
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110 (KCCM 11312P), 바실러스 서틸리스 SCK B1108 (KCCM 11313P), 바실러스 서틸리스 SCK B1109 (KCCM 11314P), 바실러스 서틸리스 SCS B1106 (KCCM 11315P) 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주 (KCCM 11316P)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주를 제공한다.
상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110 (KCCM 11312P), 바실러스 서틸리스 SCK B1108 (KCCM 11313P), 바실러스 서틸리스 SCK B1109 (KCCM 11314P), 바실러스 서틸리스 SCS B1106 (KCCM 11315P) 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주 (KCCM 11316P)는 전통 장류에서 분리하였으며, 독소 유전자가 없고, 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 균주이다.
상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110, 바실러스 서틸리스 SCK B1108, 바실러스 서틸리스 SCK B1109, 바실러스 서틸리스 SCS B1106 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2012년 10월 19일자로 각각 기탁하였다(상기 균주의 기탁번호는 순서대로 각각 KCCM 11312P, KCCM 11313P, KCCM 11314P, KCCM 11315P, KCCM 11316P임)
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 미생물의 아미노산 디카복실라제 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며, 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류의 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 장류로부터 바이오제닉 아민 분해 활성을 가지는 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110, 바실러스 서틸리스 SCK B1108, 바실러스 서틸리스 SCK B1109, 바실러스 서틸리스 SCS B1106 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens ) SCS B1307 균주를 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 식품은 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110, 바실러스 서틸리스 SCK B1108, 바실러스 서틸리스 SCK B1109, 바실러스 서틸리스 SCS B1106 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens ) SCS B1307 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110, 바실러스 서틸리스 SCK B1108, 바실러스 서틸리스 SCK B1109, 바실러스 서틸리스 SCS B1106 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens ) SCS B1307 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 균주 선발 및 배양
균주 배양은 전통 방법에 따라 제조한 83종의 된장 고추장, 청국장들을 구입 후 5g을 취해 0.3 mM 인산 완충액(pH 7.2)으로 희석하였다. NA (Nutrient agar)와 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 선택 배지(chromogenic polymyxin B-methoprim agar (CPMA)) 표면에 희석된 균액을 각각 200 ㎕씩 도포하고 30℃에서 24시간 배양 후, NA에서 자란 집락 수에 비해 CPMA에서 자란 집락 수의 비율이 낮았던 장류들을 선발하였다. 선발된 장류로부터 NA 배지에 형성된 집락들을 이쑤시개로 찍어 미리 만들어둔 NA와 CPMA 배지의 같은 위치에 각각 접종하여 24시간 후 CPMA에 자라지 않은 균들만을 수집하였다.
발효 숙성 동안 바이오제닉 아민 저감화를 위한 가장 효율적인 균주 선발 전략은 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서 동시에 바이오제닉 아민을 분해하는 균을 찾는 방법이다. 이 특성들을 갖는 균주 선발을 위해 히스티딘, 티로신 및 크레졸 레드가 함유된 선발 배지를 사용해 바이오제닉 아민을 분비하지 않는 장류 균주들을 1차적으로 선발하였다. 선발 균주들은 히스티딘과 티로신을 히스타민과 티라민으로 전환시키지 못해 집락 주위의 색 변화가 없었던 반면, 바이오제닉 아민을 생성하는 대조 균주들의 집락 주위는 보라색으로 변화되었다(도 1).
실시예 2. 바이오제닉 아민 분해능이 있는 균주의 선발
바이오제닉 아민 분해 능력을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1의 균주들을 탄소 및 질소원으로 2% 히스타민과 티라민만 함유한 최소합성배지에 배양하여 잘 자라는 바이오제닉 아민 분해 균주 5 종을 최종 선발하였다. 이들 균주의 바이오제닉 아민 분해 능력을 정량적으로 분석하기 위해 HPLC를 수행하였다. 증기 멸균한 콩가루 0.3g에 각 16mg의 히스타민, 티라민, 퓨트레신, 카다베린을 녹인 0.8 ml NB(nutrient broth) 배지를 첨가하고 선발된 균주의 배양액 0.2 ml를 접종하였다. 비교를 위해 바이오제닉 아민 없이 NB 배지에 균주만 접종한 대조군과, 균만 첨가하지 않은 대조군을 사용하였다. 47℃에서 배양 후 10,000 x g에서 10분간 원심 분리하여 얻은 0.1 ml 상층액, 80 ㎕ 아세톤 용해 1% 단실 클로라이드(dansyl chloride), 50 ㎕ 포화 Na2CO3, 분석 시 편차를 줄이기 위해 50㎕ 내부 표준 용액(1,7-diaminoheptane)을 섞어 45℃에서 1시간 유도체화 시켰다. 유도체화한 시료용액에 50 ㎕ 10% 프롤린을 넣어 여분의 단실 클로라이드를 제거한 뒤 0.5 ml 에테르를 넣고 3분 후 분리된 상층액을 모아 증발 후 0.1 ml 아세토니트릴에 녹였다. HPLC 분석으로 역상 칼럼은 C18 (Capcellpak, 4.6 mm x 150 mm, 5 ㎛), 이동상은 H2O에 녹인 0.1% 포름산 (A)과 아세토니트릴에 녹인 0.1% 포름산 (B), 농도 구배는 0~10 분, A:B=45:55; 11~15분, A:B=35:65; 16~25분, A:B=20:80; 26~30분, A:B=10:90, 30분 유속은 1 ml/min이었으며 10㎕ 시료를 주입하였다.
분석 결과 균주에 따라 27-92%의 바이오제닉 아민을 분해하였으며(표 1), 바실러스 서틸리스 균주들의 경우 디아민인 퓨트레신(putrescine)과 카다베린(cadaverine)의 분해율은 78-92%, 모노아민인 히스타민과 티라민은 27-59%로서 디아민 분해율이 더 높았으며, 같은 바실러스 서틸리스 종이라도 균주에 따라 그 분해 정도는 차이를 보였다. 그러나 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SCS B1307의 경우 모노아민과 디아민의 분해율은 70-78% 범위로 비슷하였다.
전통 장류 제조는 삶은 콩을 성형하고 미생물 접종원으로 볏짚을 접촉시켜 메주 발효를 하며, 이 동안 형성된 메주 내 미생물 우점종들이 발효 및 장류 숙성 후에도 그대로 우점을 유지한다고 보고되었다(Kim et al., 2011 Korean J. Microbiol . 47, 275-280). 따라서 메주 제조시 바이오제닉 아민 분해 균주들의 접종량을 늘려 우점종이 되게끔 조정하면 발효 및 숙성과정 동안 다른 미생물들에 의해 생성되는 바이오제닉 아민을 효율적으로 제거할 것으로 보인다.
본 발명에서 분리된 균주의 바이오제닉 아민 분해능 분석
Strain Degraded biogenic amines (%a)
Histamine Tyramine Putrescine Cadaverine
B. amyloliquefaciens SCS B1307 71 70 78 73
B. subtilis SCC B1110 45 59 85 78
B. subtilis SCK B1108 27 44 88 78
B. subtilis SCK B1109 36 42 92 86
B. subtilis SCS B1106 46 51 88 93
각각의 바이오제닉 아민을 5.3%를 첨가시킨 삶은 콩의 10일 발효 후 분해된 정도를 측정한 값
a% (w/w)
실시예 3. 본 발명에서 선발된 균주의 전자현미경 관찰
바이오제닉 아민 분해 균주들은 NA에 배양시 백색의 집락 주위로 반투명의 광택 환을 형성했으며, 1,500 x 배율의 광학 현미경하에서 관찰하였을 때 움직임이 매우 활발했고 그람 염색은 모두 양성을 나타냈다. 이들 균주 중 바실러스 서틸리스 SCS B1106과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 SCS B1307의 주사전자현미경 관찰을 위해 30℃에서 21시간 배양한 균 배양액을 1,000 rpm에서 3분간 원심 분리 후 상등액을 제거하고 0.9% NaCl로 2번 펠렛을 세척한 뒤 2.5% 글루타르알데히드 1차 고정, 1% 오스뮴 테트록시드(osmium tetroxide) 2차 고정, 에탄올 탈수과정을 거쳤다. 100% 에탄올에 탈수된 균을 커버 글라스 위에 떨어뜨린 뒤 80℃에서 12시간 건조시키고, 이온 스퍼터(ion sputter)로 20분간 오스뮴을 코팅시켜 주사 전자현미경(SUPRA 40 VP, Carl Zeiss, Germany)에서 관찰하였다. 5,000 x 배율로 확대한 주사전자현미경으로 관찰 결과 모두 전형적인 간균 형태로 0.8~0.9 ㎛ x 2.0~3.0 ㎛의 크기를 보였다(도 2).
실시예 4. 본 발명에서 선발된 균주의 동정
본 발명의 분리 균들의 생화학적 동정을 위해 집락을 NA 배양액에 희석 후 46종 건조 배지 및 생화학 반응물로 구성된 바실러스 동정 카드 (BCL ID card; bioMerieux Vitek Inc., Hazelwood, USA)에 주입하였다. 결과들은 15분 간격으로 VITEK 2 Compact™ software (bioMerieux Vitek)에 통합적으로 저장 분석되어 14시간 후 동정이 완료되었다. BCL ID 카드를 이용한 46 종류의 생화학적 검사 결과 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(동정 확률 99%)로, 분류된 SCS B1307 (GenBank accession no. JX041905)를 제외한 균주 SCC B1110 (JX041908), SCK B1108 (JX041906), SCK B1109 (JX041907), SCS B1106 (JX041904)들은 모두 바실러스 서틸리스로 분류(각각 98%, 97%, 97%, 99%)되었다.
16S rRNA 유전자의 염기서열에 의한 균 동정을 위해 유니버셜 프라이머로서 27F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3': 서열번호 1)와 1,492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3': 서열번호 2)을 이용, 16S rRNA 유전자를 PCR로 증폭한 후, 동정에 중요한 가변 염기 영역을 포함하는 1,528 bp를 BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems Inc., USA)를 사용하여 해독하였다(Chakravorty et al., 2007. J. Microbiol . Methods 69, 330-339). 이 염기 서열들을 BLASTN search (Zhang et al., 2000 J. Comput . Biol. 7, 203-214)의 참고 RNA 시퀀스 데이터베이스와 리보솜 데이터베이스 프로젝트(Ribosomal Database Project, RDP)의 Seqmatch program (version 3)에서 서열 일치도가 높은 표준 균주의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 얻었고, 이들 염기 서열 간의 상호 비교를 위해 CLUSTALW (Thompson et al., 1994 Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680)를 사용하였다. 계통도 분석은 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 갭(gap)이 최소화되도록 보정한 후 Kimura's two-parameter method (Kimura, M. 1980 J. Mol . Evol . 16, 111-120)와 maximum parsimony method (Fitch, W.M. 1971 Syst . Zool. 20, 406-416)를 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 부트스트랩(Bootstrap) 분석을 1,000회 실행하였으며 계통 분석과 부트스트랩 분석은 PAUP(version 4.0b)을 사용하였다(Swofford, D.L. 1998 Associates, Sunderland, MA, USA).
그 결과 SCS B1307은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스 ATCC 14589와 가장 가까운 근연 관계로 16S rDNA 유전자 서열 상동성은 99%였고, SCC B1110, SCK B1108, SCK B1109, SCS B1106들은 각각 99% 이상의 서열 상동성으로 바실러스 서틸리스 DSM10과 가장 가까운 근연 관계를 보였다. 생화학 분석과 계통학적 분류 결과를 바탕으로 SCS B1307은 바실러스 아밀로리퀘파시엔스로, 나머지 균주들은 바실러스 서틸리스로 동정하였다.
실시예 5. 본 발명에서 선발된 균주를 대상으로 독소 유전자 검출을 위한 PCR 수행
식품 안전성 확보를 위하여 이들 균주들이 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 설사 독소 유전자(nheABC , hblACD , cytK), 구토 독소인 시레울리드(cereulide) 합성 효소 유전자(cesA 및 cesB), 설사 독소 발현 전사조절 유전자(plcR - papR)을 갖는지 확인을 위해 PCR을 수행하였다. 이들 독소 유전자 검출을 위한 프라이머 서열들은 김 등(Kim et al., 2012 Korean J. Microbiol . 48, 163-170)이 설계한 것과 같았으며, 이들 검출을 위한 PCR은 94℃에서 2분간 초기 변성 후, 94℃ 1분간 변성, 56℃ 1분간 결합, 72℃ 1분간 증폭 과정을 30회 반복하고 72℃에서 5분간 마지막 증폭을 실시하였다. 그 결과 이들 균주들 모두 바실러스 세레우스 독소유전자들을 전혀 함유하지 않았다(도 3).
전통 발효 장류의 맛과 풍미를 유지하면서 동시에 위생상의 문제점을 해결하는 일은 발효 과정에 참여하는 수많은 미생물들의 대사 제어와 상호 간 길항 특성을 이해해야 하기 때문에 쉽지 않다. 이들 업체들이 위생적인 관점에서 우선적으로 해결해야 할 과제는 장류 주 발효균의 바이오제닉 아민의 생성 억제이다. 그러나 HACCP (Hazard Analysis & Critical Control Points) 설비 기준을 갖추기 어려운 영세 전통 장류 공장들은 시설의 현대화와 제조 공법의 혁신적인 전환 없이는 현실적으로 바이오제닉 아민 감소를 위한 미생물 제어가 불가능하다. 전통 장류 제품에서 빈번한 바이오제닉 아민 생성 문제를 해결하기 위해 우리는 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서 이들에 대해 높은 분해 능력을 보이는 균들을 전통 장류에서 분리하고자 하였고, 장류 발효 및 숙성에 관여하는 주 세균인 바실러스 서틸리스와 바실러스 아밀로리퀘파시엔스가 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해할 수 있음을 최초로 밝혔다. 이 균들을 배양하여 발효 시작 단계에서 스타터로 접종하는 경우 바이오제닉 아민을 저감화 할 수 있기 때문에 전통 장류 업체가 직면하고 있는 바이오제닉 아민 문제 해결에 효과적인 대처 방안이 될 수 있다. 현재 이 균주들을 유해균을 억제하는 다른 우수 발효균들과 함께 복합 접종하여 전통 장류를 재현하는 실증 실험을 준비 중이다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM11312P 20121019 한국미생물보존센터(국외) KCCM11313P 20121019 한국미생물보존센터(국외) KCCM11314P 20121019 한국미생물보존센터(국외) KCCM11315P 20121019 한국미생물보존센터(국외) KCCM11316P 20121019
<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) SUNCH'ANG <120> Bacillus strains having degradation activity of biogenic amine and uses thereof <130> PN13268 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (6)

  1. 바실러스 서틸리스(Bacillus subtilis) SCC B1110 (KCCM 11312P), 바실러스 서틸리스 SCK B1108 (KCCM 11313P), 바실러스 서틸리스 SCK B1109 (KCCM 11314P), 바실러스 서틸리스 SCS B1106 (KCCM 11315P) 및 바실러스 아밀로리퀘파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) SCS B1307 균주 (KCCM 11316P)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주.
  2. 제1항에 있어서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine)인 것을 특징으로 하는 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주.
  3. 제1항에 있어서, 상기 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것을 특징으로 하는 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있는 균주.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류의 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해용 미생물 제제.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 균주를 포함하는 식품.
  6. 제5항에 있어서, 상기 식품은 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 장류인 것을 특징으로 하는 식품.
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