KR101650330B1 - 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 루코노스톡 속 균주 및 이의 용도 - Google Patents

바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 루코노스톡 속 균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으며, 덱스트란 생산능을 가지는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주 및 상기 균주를 포함하는 식품에 관한 것이다. 본 발명의 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 루코노스톡 속 균주 및 이의 용도{Leuconostoc strains having degradation activity of biogenic amine and uses therof}
본 발명은 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 루코노스톡 속 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으며, 덱스트란 생산능을 가지는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주, 상기 균주 또는 상기 균주 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류의 바이오제닉 아민 분해용 미생물제제 및 상기 균주를 포함하는 식품에 관한 것이다.
장류는 한국인의 필수적인 부식일뿐만 아니라 식품 위생에 관심이 높아지고 있는 식품으로서 안전성 확보는 필수 요건이 되었다. 장류의 발효과정에서 식품안전을 위협하는 대표적인 주요 인자는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)와 같은 유해 미생물, 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus) 등이 생산하는 아플라톡신(aflatoxin), 발효 미생물들에 의해 생산되는 바이오제닉 아민(biogenic amine)으로 요약될 수 있다. 그 중 바이오제닉 아민은 미생물의 아미노산 탈탄산효소(amino acid decarboxylase) 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며 세균에서는 아크로모나스(Acromonas) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 시트로박터(Citrobacter) 속, 클로스트리듐(Clostridium) 속, 에세리키아(Escherichia) 속, 클렙시엘라(Klebsiela) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 프로테우스(Proteus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 등이 아미노산 탈탄산효소를 가지는 것으로 알려져 있다. 이들 바이오제닉 아민은 성장조절 및 염증조절, 신경전달 등의 생리적 기능을 담당하지만, 이들 중 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품을 통해서 섭취하는 경우에는 인체에 유해한 증상이 나타난다. 단백질 함량이 높은 콩과 단백질분해효소(proteases) 활성이 높은 바실러스와 아스퍼질러스 속에 의한 발효, 미혐기적 환경과 적당한 발효 온도를 고려할 때 장류는 바이오제닉 아민을 생산하기 알맞은 환경이라 할 수 있다. 2006년 국내 유통 발효 식품 중에 바이오제닉 아민 분포를 조사한 결과에 따르면 한국인의 주요 부식인 전통 된장에서 푸트레신(putrescine)은 99.6-1453.7(평균 462.6) mg/kg, 히스타민(histamine)은 260.1-952(평균 569.4) mg/kg, 티라민(tyramine)은 284.7-1430.7(평균 669.5) mg/kg으로 한국인들이 주로 섭취하는 34종의 식품 가운데 평균적으로 가장 높았으며, 다음으로 멸치 젓갈, 시판 간장, 전통 간장, 현대식 된장 순이었다. 이 결과는 바이오제닉 아민 함량이 가장 높은 식품 7종 중 4종이 장류라는 점과 한국인의 음식 섭취 특성상 젓갈보다 장류를 많이 섭취한다는 점을 고려하면, 장류가 바이오제닉 아민의 주공급원으로 건강에 위해를 줄 수 있는 수준임을 나타낸다. 앞으로 전통 장류의 지향점은 전통적인 장류의 맛과 풍미는 유지하되 발효 미생물 제어를 통한 식품 위생상의 안전성을 동시에 확보할 수 있어야 한다. 이를 위해 발효 동안 유해 균주들의 증식을 억제하며, 바이오제닉 아민을 생산하지 않고 동시에 분해도 가능한 발효 균주의 선발은 필수적이다.
본 발명은 전통 장류에서 우수한 발효능력을 갖는 유산균을 분리하기 위하여 덱스트란 생산능이 좋고 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서 동시에 바이오제닉 아민 분해 능력이 좋은 균주를 선발하는데 목표를 두었다.
한국등록특허 제1338527에는 '천연 추출물을 이용한 발효식품의 생체 아민 저감화'가 개시되어 있고, 한국공개특허 제2009-0040026호에는 '병원성 세균의 생육을 억제하는 김치에서 분리한 신규 류코노스톡 메센트로이드 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 루코노스톡 속 균주 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 전통 장류에서 덱스트란 생산능이 좋고 바이오제닉 아민을 생산하지 않으면서 바이오제닉 아민의 높은 분해 활성을 가지는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주를 분리함으로써, 안전한 장류를 생산할 수 있는 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있고, 바이오제닉 아민을 생산하지 않으며, 덱스트란 생산능을 가지는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 (KCCM 11292P) 균주를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류의 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해용 미생물 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명에서는 전통 장류에서 분리한 루코노스톡 메센테로이데스 균주가 장류의 발효 과정 동안 발생하는 바이오제닉 아민을 효과적으로 분해하는 것을 확인하였다. 본 발명의 균주를 이용하여 독성이 없는 안전한 장류 식품 생산 효과를 가져올 수 있으므로, 산업적으로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
도 1은 바이오제닉 아민을 생산하는 유산균 콜로니 주변의 색 변화를 관찰한 것이다. 바이오제닉 아민을 생산하는 균주들에 의해 노란색의 배지가 보라색으로 변했다.
도 2는 락토바실러스 MRS 배지에서 배양한 SCSB 2219 균주의 형태를 관찰한 것이다. (A); 콜로니, (B); 콜로니 주변의 점액.
도 3은 SCSB 2219 균주를 주사전자현미경으로 관찰한 것이다.
도 4는 SCSB 2219 균주와 다른 연관된 균주들의 관계를 나타내는 16S rRNA 유전자의 분석으로부터 나온 계통수를 나타낸 것이다.
도 5의 (A)는 pH 지시약으로 브로모크레졸 퍼플이 첨가된 합성배지에서 바이오제닉 아민을 생산하는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KTCC 14869와 SCSB 2219의 색변화를 나타낸 것이고, (B)는 합성배지에서 락토바실러스 브레비스 KTCC 14869와 SCSB 2219의 성장을 나타낸 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 장류에서 분리된 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해 활성이 있고, 덱스트란 생산능을 가지는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 (KCCM 11292P) 균주를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주는 전통 장류에서 분리하였으며, 독소 유전자가 없고, 바이오제닉 아민 분해 활성이 있는 균주이다.
본 발명에 있어서, 상기 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주를 한국미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 2012년 7월 24일자로 기탁하였다(기탁번호: KCCM 11292P).
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 바이오제닉 아민은 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 균주에서, 상기 균주는 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바이오제닉 아민(biogenic amine)은 미생물의 아미노산 디카복실라제 작용에 의해 아미노산으로부터 형성되며, 인체의 분해 한도를 넘어서는 바이오제닉 아민을 식품에서 섭취하는 경우에는 발진, 국소적 피부염증, 알레르기, 구토, 오심, 설사 등의 증상을 유발한다.
또한, 본 발명은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류의 바이오제닉 아민(biogenic amine) 분해용 미생물 제제를 제공한다.
상기 미생물 제제는 장류로부터 바이오제닉 아민 분해 활성을 가지는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주를 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명에 의한 미생물 제제는 액상 형태로 제조될 수 있으며 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 포함하는 식품을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 식품은 장류일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 식품에서, 상기 장류는 메주, 한식된장, 된장, 조미된장, 고추장, 조미고추장, 춘장, 청국장, 혼합장, 한식간장, 양조간장 및 혼합간장으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주를 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 균주를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 바람직하게는 식품은 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 균주를 함유하는 형태일 수 있으며, 또한 다른 식품의 첨가물로서도 이용될 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
재료 및 방법
배지 및 배양조건
루코노스톡 속(Leuconostoc sp.) 배양에는 표 1과 같은 루코노스톡 선별 배지가 이용되었으며, 덱스트란(Dextran) 생산 균주를 선발하기 위한 배양에는 표 2와 같은 덱스트란 생산 균주 선별 배지가 이용되었고, 덱스트란 생산량을 확인하기 위하여 표 3과 같은 덱스트란 생산량 확인 배지가 이용되었다.
또한, 바이오제닉 아민 합성 및 분해 유무를 확인하기 위하여 바이오제닉 아민 생산 배지(Bover-Cid and Holzapfel, 1999)와 바이오제닉 아민 분해 배지를 사용하였다(표 4, 표 5).
루코노스톡 속의 배양을 위한 선별 배지
루코노스톡 선별 배지a
반코마이신 저항성 균주 선별 배지
MRS Broth(Difco. USA) 5.5 %
Vancomycin(Duchefa, Netherland) 0.003 %
Tetracycline(Duchefa, Natherland) 0.002 %
Agar(BD, USA) 1.5 %
Final pH 6.5
a중량당 백분율
덱스트란을 생산하는 루코노스톡 속을 선발하기 위한 선별 배지
Dextran 생산 균주 선별 배지a
Tryptone(BD, USA) 1.0 %
Gelatin(Duchefa, Netherland) 0.25 %
Yeast extract(BD, USA) 0.5 %
Sucrose(Kanto, Japan) 10.0 %
Glucose(BD, USA) 0.5 %
Sodium citrate(Kanto, Japan) 0.1 %
Sodium azide(Duchefa, Natherland) 0.0075 %
Agar(BD, USA) 1.5 %
Final pH 6.5
a중량당 백분율
덱스트란 생산량 확인을 위한 배지
덱스트란 생산량 확인 배지a
Tryptone(BD, USA) 1.0%
Gelatin(Duchefa, Netherland) 0.25%
Yeast extract(BD, USA) 0.5%
Sucrose(Kanto, Japan) 20.0%
Glucose(BD, USA) 0.5%
Sodium citrate(Kanto, Japan) 0.1%
Sodium azide(Duchefa, Natherland) 0.0075%
Final pH 6.5
바이오제닉 아민의 합성 확인을 위한 루코노스톡 속 선별 배지
바이오제닉 아민 생산 배지a
Tryptone(BD, USA) 0.5 %
Yeast extract(BD, USA) 0.4 %
Meat extract(Sigma, USA) 0.8 %
L-tyrosine(Junsei, Japan) 0.2 %
L-histidine(Junsei, Japan) 0.2 %
Tween 80(Sigma, USA) 0.05 %
MgSo4(Kanto, Japan) 0.002 %
CaCO3(Duchefa, Netherland) 0.001 %
MnSO4(Kanto, Japan) 0.0005 %
FeSO4(Sigma, USA) 0.0004 %
Bromocresol purple(Junsei, Japan) 0.0006 %
Agar(BD, USA) 1.5 %
Final pH 6.5
a중량당 백분율
바이오제닉 아민 분해 확인을 위한 루코노스톡 속 선별 배지
바이오제닉 아민 분해 배지a
Histamine, Tyramine, Putrescine and Cadaverine(Junsei, Japan) 0.2 %
Glucose(BD, USA) 0.1 %
Tryptone(BD, USA) 1.0 %
Yeast extract(BD, USA) 0.3 %
NaCl2(Duchefa, Natherland) 0.1 %
MgSO4(KANTO, Japan) 0.01 %
FeSO4(SIGMA, USA) 0.0004 %
Agar(BD, USA) 1.5 %
Final pH 6.5
a중량당 백분율
균주의 분리
고추장, 된장, 청국장, 간장에서 유산균을 분리하기 위하여 시중에 판매되고 있는 150종의 재래식의 된장 및 고추장, 청국장, 간장을 구입 후 5g을 취해 락토바실러스 MRS 액체배지에 희석하였다. 락토바실러스 MRS 배지 표면에 희석된 균 액을 각각 200㎕씩 도포하고 28℃에서 24시간 배양 후, 균 집락을 확인하고 모양이 상이한 균주를 분리하였다.
덱스트란 생산능이 있는 균주를 분리하기 위하여 락토바실러스 MRS 배지에서 자란 집락들을 이쑤시개로 찍어 미리 만들어둔 반코마이신이 첨가된 루코노스톡 선별 배지와 수크로오스가 함유된 덱스트란 생산 균주 선별 배지에 접종하여 28℃에서 24시간 배양 후 루코노스톡 선별 배지에서 활성을 보이면서 덱스트란을 생산하는 균주를 선별하였고 이를 SCSB 2219 균주로 명명하였다.
균주의 동정
SCSB 2219 균주의 생화학적 동정을 위해서 API 50 CHL 키트(BioMerieux, Marcy, 프랑스)를 사용하였다. 그 결과 얻어진 생화학적 특성들은 동정 프로그램인 apiweb™ Software 데이터베이스의 분류군 생화학적 특성과 비교하여 확인하였다. 16S rRNA 유전자 염기서열에 의한 균 동정을 위해 유니버셜 프라이머로서 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'; 서열번호 1)와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'; 서열번호 2)을 사용하여 16S rRNA 유전자를 중합효소연쇄반응으로 증폭 후, 빅 다이 터미네이터 v3.1 시퀀싱 키트(Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit)를 이용하여 염기 서열을 해독하였다. NCBI 데이터베이스로부터 BLASTN program(Zhang et al., 2000)과 리보솜 데이터베이스 프로젝트(Ribosomal Database Project, RDP)의 Seqmatch 프로그램(version 3)을 사용하여 표준균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 얻고, SCSB 2219 염기서열과의 상호비교를 위해 CLUSTAL W를 사용하였다. 계통도 분석은 균주들의 16S rRNA 유전자 염기서열들을 정렬하고 시각적 관찰과 수작업으로 갭(gap)이 최소화 되도록 보정한 후 기무라의 투-파라미터 방법(Kimura’s two-parameter method)과 맥시멈 팔시모니 방법(maximum parsimony method)을 사용하여 작성하였다. 산출한 각각의 계통수에서 각 분지에 대한 통계학적 신뢰도를 산출하기 위해 부트스트랩(Bootstrap) 분석을 1,000회 실행하였으며 계통분석과 부트스트랩 분석은 PAUP(version 4.0b)을 사용하였다.
형태학적인 동정을 위하여 균주를 MRS 액체배지에 28℃에서 21시간 배양하고 1,000rpm에서 3분간 원심분리 후 상등액을 제거하였다. 상등액이 제거된 균체에 0.9% NaCl로 2번 펠렛을 세척한 뒤 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 1차 고정시키고 1% 4산화오스뮴(osmium tetroxide)으로 2차 고정시킨 후, 에탄올을 이용한 탈수과정을 거쳤다. 100% 에탄올에 탈수된 균을 커버글라스 위에 떨어뜨린 뒤 80℃에서 12시간 건조시키고, 이온 스퍼터(ion sputter)로 20분간 오스뮴을 코팅시켜 전계 방사형 주사 전자현미경(SUPRA 40VP, Carl Zeiss, Germany)에서 관찰하였다.
덱스트란 생산량 확인
선발 균주의 덱스트란 생산량을 확인하기 위하여 수크로오스(sucrose)가 첨가된 덱스트란 생산량 확인 배지 50㎖에 균을 접종하여 37℃에서 21시간 동안 진탕배양하였다. 35,000rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액 5㎖을 사용하여 덱스트란 정량분석을 하였다. 상층액에 10배의 고농도 에탄올을 첨가하여 강하게 섞어준 후, 정치키셔 침전물이 가라앉도록 하였다. 무게가 일정한 알루미늄 접시에 침전물을 받아내어 건조시켜 건중량을 재고 빈 알루미늄 접시의 무게를 빼 생산량(㎎/㎖)을 확인하였다. 본 실험은 2회 반복하여 평균을 내었다.
바이오제닉 아민( Biogenic amines ) 생산 및 분해 유무 확인
선발 균주의 바이오제닉 아민 합성 유무를 확인하기 위하여 바이오제닉 아민 전구물질인 티로신(tyrosine)과 히스티딘(histidine), pH 지시약인 브로모크레졸 퍼플(bromocresol purple 0.005%)이 함유된 바이오제닉 아민 생산 배지에 균을 접종한 후 28℃에서 21시간 동안 배양하고 색의 변화가 없는 균주만을 우선적으로 분리하였다. 분리된 균주를 다시 배지안의 탄소원이 바이오제닉 아민인 히스타민(histamine)과 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine), 카다베린(cadaverin)으로 치환된 바이오제닉 아민 생산 배지에 접종하고 28℃에서 21시간 동안 배양 후 활성을 갖는 균주를 최종 선발하였다.
HPLC 를 이용한 바이오제닉 아민 분해율 확인
선발 균주의 바이오제닉 아민 분해 능력을 관찰하기 위해 HPLC를 수행하였다. 증기 멸균한 삶은 콩가루 0.3g에 각각 16mg의 히스타민과 티라민, 퓨트레신 그리고 카다베린을 녹인 MRS 액체배지를 0.8㎖ 첨가하고, 활성화시킨 선발 균주 배양액 0.2㎖를 접종하였다. 대조군은 히스타민과 티라민이 없는 MRS 액체배지를 대신 첨가하였다. 28℃에서 21시간 배양 한 후 10,000×g에서 10분간 원심분리하여 얻은 0.1㎖ 상층액과 80㎕ 아세톤 용해 1% 댄실 클로라이드(dansyl chloride), 50㎕ 포화 Na2CO3, 50㎕ 내부 표준 용액을 섞어 45℃에서 1시간 유도체화 시켰다. 유도체화한 시료용액에 50㎕ 10% 프롤린(proline)을 넣어 여분의 댄실 클로라이드를 제거한 뒤 0.5㎖ 에테르를 넣고 완전히 섞어 주었다. 5분 동안 실온에 방치하여 유도체화시킨 시료 용액층과 완전히 분리된 상층액 에테르층만을 모아 에테르를 완전히 증발시킨 후 0.1㎖ 아세토니트릴에 녹여 최종 시료로 사용하였다. HPLC 조건은 표 5와 같으며 시료 주입 후 표준물질인 히스타민, 티라민, 퓨트레신, 카다베린의 각 머무름 시간을 확인하였고, 반응시킨 시료의 면적 값을 비교하여 바이오제닉 아민 분해율을 측정하였다.
바이오제닉 아민 분해율(%)=시료 peak 면적값 / 대조군 peak 면적 값 × 100
HPLC 분석 조건
HPLC Shimadzu LC-10AT
Column Capcell pak C18 reversed-phased column
(Shinseido Fine chemical, Japan)
150×4.6mm, 5μm column
Detector Polymer Laboratories LC 1200 UV/VIS detector
Mobile phase A: 0.1% Formic acid in H2O
B: 0.1% Formic acid in Acetonitrile
Gradient A:B = 45:55, 0~10 min.
A:B = 35:65, 10~15 min.
A:B = 20:80, 15~25 min.
A:B = 10:90, 25~30 min.
A:B = 10:90, 30 min. over
Flow rate 1 ㎖/min.
Sample injection volume 10㎕
실시예 1. 시료 선별 및 균주의 분리
시중에 판매되고 있는 150종의 재래식의 된장 및 고추장, 청국장, 간장 중 바실러스 세레우스(Bacillus cereus) 선별 배지인 CPMA(Oxoid, UK) 배지에서 집락 수의 비율이 매우 낮았던 24종의 장류를 선발하였으며, 장류시료 희석액을 락토바실러스 MRS 배지에 도말하고 배양 후 생산되는 상이한 균 집락을 선발하였다. 선발된 균주들을 다시 덱스트란 생산 균주 선별 배지와 루코노스톡 선별 배지에 접종하였으며, 상업용 용도를 위해 배양 후 루코노스톡 선별 배지에서 덱스트란을 많이 생산하고 덱스트란 생산량이 21.7㎎/㎖(표 7)로 많은 SCSB 2219 균주(도 2B)를 최종 선발하였다.
덱스트란 생산량 확인
1회(㎎/㎖) 2회(㎎/㎖) 평균(㎎/㎖)
SCSB 2219 27.6 15.8 21.7
실시예 2. SCSB 2219 균주의 동정
SCSB 2219 균주는 락토바실러스 MRS 배지에서 배양시 크림색의 광택 환(도 2A)을 형성하였고 그람 염색에서 양성을 보였으며, 50,000배로 확대한 주사전자현미경으로 관찰 결과 균의 형태는 구균에 가깝고 0.8∼0.9 ㎛ x 0.8∼1.0 ㎛의 크기를 보임을 확인하였다(도 3). 당 이용성 검토를 위하여 API 50 CHL 키트 테스트를 실시하여 표준 균주들의 생화학적 특성들과 비교한 결과 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)와 95%의 상동성을 보였으며, 글루코오스, 프록토오스, 말토오스, 수크로오스 등을 탄소원으로 이용할 수 있었다(표 8).
또한 Genomic BLAST 및 RDP에 등록된 모든 유산균 표준 균주들을 사용하여 계통도를 분석한 결과 분리균주는 루코노스톡 메센테로이데스 아종 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides) ATCC 8293과 가장 가까운 근연관계(도 4)로 16S rDNA 유전자 서열 상동성은 98%(1455/1481)를 보였다. 생화학 분석과 계통학적 분류 결과로부터 SCSB 2219 균주를 루코노스톡 메센테로이데스로 최종 동정하였다.
API 50 CHL 키트를 사용한 균주의 탄수화물 활용 시험
Substrate SCSB 2219 Substrate SCSB 2219
Glycerol - Salicin +
Erythritol - Cellobiose +
D-Arabinose - Maltose +
L-Arabinose + Lactose -
Ribose + Melibiose +
D-Xylose + Sucrose +
L-Xylose - Trehalose +
Adonitol - Inulin -
β Methyl-D-xyloside - Melezitose -
Galactose + Raffinose +
Glucose + Starch -
Fructose + Glycogen -
Manose + Xylitol -
Sorbose - Gentiobiose +
Rhamnose - D-Turanose +
Dulcitol - D-Lyxose -
Inositol - D-Tagatose +
Mannitol - D-Fucose -
Sorbitol - L-Fucose -
α Methyl-D-mannoside + D-Arabitol -
α Methyl-D-glucoside + L-Arabitol -
N Acetyl glucosamine + Gluconate -
Amygdalin + 2 Keto-gluconate -
Arbutin + 5 Keto-gluconate -
Esculin +
실시예 3. 바이오제닉 아민 생산 및 분해 유무 확인
SCSB 2219 균주의 바이오제닉 아민 생산 유무를 확인하기 위하여 아미노산인 티로신과 히스티딘, pH 지시약인 브로모크레졸 퍼플(0.005%)이 함유된 바이오제닉 아민 생산 배지에 균을 접종한 후 확인한 결과 배지가 보라색으로 변한 표준 균주 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) KTCC 14869와 달리, 분리한 균주들의 배지는 색의 변화가 없었다. 또한, 탄소원 및 질소원으로 2% 바이오제닉 아민인 히스타민과 티라민, 퓨트레신, 카다베린을 사용한 최소 합성 배지에서 선별된 균을 접종한 후 확인한 결과 표준균주 락토바실러스 브레비스 KTCC 14869는 증식하지 못한 반면 SCSB 2219는 증식 활성이 좋았다(도 5).
실시예 4. HPLC 를 이용한 바이오제닉 아민 분해율 확인
선별 배지를 통해서 바이오제닉 아민 분해유무를 확인한 분리 균주의 정확한 분해율을 확인하기 위하여 삶은 콩 g당 각 53mg의 히스타민 및 티라민 그리고, 퓨트레신, 카다베린을 첨가한 배지에 균을 접종하였다. 2일 동안 배양 후 유도체화를 거쳐 HPLC 분석한 결과 히스타민을 58%, 티라민을 55%, 퓨트레신을 82%, 카다베린을 82%을 분해하는 것으로 확인되었다(표 9).
SCSB 2219 균주에 의한 바이오제닉 아민 분해율
Strain Degraded biogenic aminesa(%)
Histamine Tyramine Putrescine Cadaverine
L. mesenteroides 58 55 82 82
a중량당 백분율
한국미생물보존센터(국외) KCCM11292P 20120724
<110> Sunchang Research Center for Fermentation Microbes(SRCM) <120> Leuconostoc strains having degradation activity of biogenic amine and uses therof <130> PN13437 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims (4)

  1. 장류에서 분리된 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine) 분해 활성이 있고, 히스타민, 티라민, 퓨트레신 및 카다베린을 생산하지 않으며, 덱스트란 생산능을 가지는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides) SCSB 2219 (KCCM 11292P) 균주.
  2. 삭제
  3. 제1항의 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 포함하는 장류의 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 퓨트레신(putrescine) 또는 카다베린(cadaverine) 분해용 미생물 제제.
  4. 제1항의 균주를 포함하는 식품.
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