TWI815042B - 腸膜明串珠菌ｔｃｉ００７的代謝產物用於改善過敏狀況的用途 - Google Patents
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Abstract
一種腸膜明串珠菌TCI007或其代謝產物用於改善過敏狀況的用途，其中腸膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC 910981)、以及寄存於德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM33502)。
Description
本發明關於一種腸膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)或其代謝產物，特別是關於一種腸膜明串珠菌TCI007或其代謝產物用於改善過敏狀況的用途。
益生菌(Probiotics)一般認為是指食入後對宿主(或稱受體，如動物或人類)有正面效益的食入性微生物。其命名源於希臘語「for life」(對生命有益)，又稱為「原生保健性菌種」；並且，益生菌主要是指乳酸菌和部分酵母菌。
一般而言，「乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)」是指能利用碳水化合物進行發酵生產多量乳酸之細菌總稱，為一相當龐雜的菌群。在諸多乳酸菌的菌種中，部分乳酸菌菌種的菌株經研究發現其對於受體健康有益，故此些菌株被視為益生菌。換言之，益生菌大部分是乳酸菌，但乳酸菌中只有少數經研究證明對受體健康有益的菌株能被稱為益生菌。
舉例來說，常見的可作為益生菌的乳酸菌的菌種包括腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、雙岐桿菌屬
(Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等，而可作為益生菌的酵母菌的菌種包括酵母菌屬(Saccharomyces)。
乳桿菌屬是一群具有發酵能力、兼性厭氧、不會產生孢子的革蘭氏陽性桿菌。乳桿菌因能夠將碳水化合物發酵成乳酸而得名，可用於製造液態優酪乳、固態奶酪等各種發酵食品。
本發明之一目的，在於提供一種腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物在製備改善過敏狀況的組合物之用途，其中腸膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910981。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007菌株包含如SEQ ID NO：1所示之序列。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007菌株具有生成多醣之能力。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物用以降低組織胺含量。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物用以改善腸道菌相。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007的有效劑量為5X109cells。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007改善腸道菌相為增加雙歧桿菌(Bifidobacterium)。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007改善腸道菌相為減少嗜血桿菌(Haemophilus)。
本發明之另一目的，在於提供一種腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物在製備免疫調節的組合物之用途，其中腸膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910981。
在一些實施例中，腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物具有提升嗜中性球吞噬作用之功能。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬領域具通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
圖1是細胞實驗中組織胺含量檢測的結果圖；圖2是細胞實驗中IL-8基因相對表現量的結果圖(**表示與空白組比較有顯著差異，p<0.01；#表示與比較組比較有顯著差異，p<0.05)；圖3是細胞實驗中嗜中性球吞噬能力的結果圖(**表示與空白組比較有顯著差異，p<0.01；#表示與比較組比較有顯著差異，p<0.05)；圖4是人體實驗中，第0周、第4周、第8周量測組織胺的結果圖(**表示與第0周有顯著差異，p<0.01)；圖5是人體實驗中，第0周、第4周、第8周檢測雙歧桿菌比例(物種豐富度)的結果圖；圖6是人體實驗中，第0周、第4周、第8周檢測嗜血桿菌比例(物種
豐富度)的結果圖。
為了使本領域具有通常知識者能瞭解本發明的特點，以下就說明書及申請專利範圍中提及術語及用語進行一般性之說明及定義。除非另有說明，否則文中使用的所有技術及科學上的字詞，皆具有本領域技術人員對於本發明所瞭解的通常意義，當有衝突情形時，應以本說明書之定義為準。
本文中所述用語「改善過敏狀況」是指緩解過敏相關症狀，具體來說是降低一或多種過敏反應的指標，例如但不限於降低組織胺、改善腸道菌相、減少流鼻水、鼻塞情況。在較佳的一個具體態樣中，係指降低血清中的組織胺、增加腸胃道的雙歧桿菌以及減少腸胃道的嗜血桿菌。
本文所述的用語「腸道菌相」，是指一個體的腸內的微生物分布情況，包含微生物種類及比例。本文所述的用語「改善腸道菌相」，是指改變一個體的腸內的微生物種類及種類，特別是改變腸道內益生菌的種類及比例，以朝向降低過敏反應的生理狀態。
本文所述的用語「組合物」，組合物為食品、保養品或醫藥品，特別是指食品。
本文所述的用語「吞噬作用」，是指細胞內吞作用的特殊形式，是將周圍環境中的固體顆粒例如細菌等通過小泡的形式吞食進入細胞內部，在較佳的一個具體態樣中，吞噬作用是指嗜中性球(Neutrophil)在人體有外來物入侵時誘發的非專一性吞噬作用。
本案發明人自人體母乳中篩選出一新穎菌株，經16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)序列分析，依親緣關係鑑定為Lactobacillus gasseri(中文名稱為腸膜明串珠菌)，且經命名為Leuconostoc mesenteroides TCI007(以下稱為腸膜明串珠菌TCI007)，其係寄存於財團法人食品工業發展研究所(寄存編號為BCRC910981)、及德國國家菌種保藏中心(DSMZ)(寄存編號為DSM33502)。該腸膜明串珠菌TCI007係具有如SEQ ID NO：1所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。
本案發明人研究發現，腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物係具有改善過敏狀況之功效。因此，本發明係提供一種腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物在製備改善過敏狀況的組合物之用途，其中，該改善過敏狀況所指可為：降低組織胺含量、改善腸道菌相或其組合。
本案發明人研究發現，腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物係具有免疫調節之功效。因此，本發明係提供一種腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物在製備改善免疫調節的組合物之用途，其中，該改善過敏狀況所指可為提升嗜中性球吞噬作用。
根據本發明，所採用之腸膜明串珠菌TCI007之代謝產物可以是透過在適於腸膜明串珠菌TCI007生長的環境下進行培養所產生者。例如：先以適當之培養液對腸膜明串珠菌TCI007進行培養，其後，視需要地去除前述培養液中之菌體等固體物，以獲得含有代謝產物之液體。或例如，先以適當之培養液對腸膜明串珠菌TCI007進行培養，其後，以離心等方法使菌體沉降於底部，再直接吸取上清液所獲得含有代謝產物
之液體。
可選用任意合宜之培養液以進行腸膜明串珠菌TCI007之培養，以提供所欲之代謝產物，只要該培養液可提供腸膜明串珠菌TCI007生長、代謝所需養分(如酵母菌萃取物、蛋白質及葡萄糖)與條件(如酸鹼值)即可。此外，腸膜明串珠菌TCI007之培養時間亦無特殊限制，只要足以使腸膜明串珠菌TCI007完成至少一次代謝循環即可。舉例言之，於本發明一具體實施態樣中，係以MRS培養液對腸膜明串珠菌TCI007進行培養，歷時18小時，使菌株進行代謝作用並產生代謝產物。
於本發明中，係可直接使用經歷腸膜明串珠菌TCI007之代謝循環的含腸膜明串珠菌TCI007與代謝產物的培養液，或使用經移除腸膜明串珠菌TCI007等固體物之含代謝產物的液體。可採用任何合宜之操作以移除固體物，只要對培養後所產生的代謝產物之所欲效益沒有不利的影響即可。一般而言，係採用物理手段以移除固體物，該物理手段包括，例如：離心分離、濾膜過濾、沉澱傾析等操作。視需要地，可重複或合併進行前述物理操作，以盡可能去除培養液中的菌體等固體物。
根據本發明所提供之組合物可為食品組合物，食品組合物係可以為健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、或特殊營養食品，且可製成例如乳製品、肉類加工品、麵包類、麵食類、餅乾、口含錠、膠囊、果汁類、茶類、運動飲料、營養飲料等產品，但不以此為限。
根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、及特殊營養食品係可以一日一次、一日多次、或數日一次
等不同頻率食用，端視投予個體之年齡、體重、及健康狀況而異。亦可針對特定族群之需要，調整據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品、及特殊營養食品中的腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物的含量，例如，調整至每日應服用的量。
針對根據本發明所提供之健康食品、保健食品、機能性食品、營養補充品及/或特殊營養食品，可於其外包裝上標示建議使用量、特定族群(例如高血脂患者、孕婦等)的使用標準及條件、或與其他食品或醫藥共同服用的建議事項等，以利使用者在無醫師、藥師或相關執事人員的指導下自行服用而無安全虞慮。於根據本發明所提供之食品組合物中，有關該腸膜明串珠菌TCI007及/或其代謝產物之態樣，係如上述之說明。
視需要地，可於根據本發明所提供之食品組合物、或飼料組合物中另外含有合宜用量之添加劑，例如可提高該醫藥組合物、食品組合物、或飼料組合物於服用時的口適感及視覺感受之調味劑、調色劑、著色劑等，以及可改善該醫藥組合物、食品組合物、或飼料組合物的穩定性及儲存性之緩衝劑、保存劑、防腐劑、抗菌劑、抗真菌劑等。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[製備實施例]
A：腸膜明串珠菌TCI007之篩選與鑑定
(A-1)篩選
將天然有機無花果(產地：台灣)之全果打碎成黏稠汁液狀後，與MRS培養液(MRS broth)以體積比1：100(無花果體積為1)的比例混合，並置於37℃下進行厭氧培養(氧氣濃度介於10%至1%，較佳為低於5%)，歷時18小時。其後，將前述培養液塗佈於MRS固態培養基(MRS agar)上，並置於37℃下進行厭氧培養，以生成不同的菌落。接著，為確保菌株的單一性，使用無菌接種環挑選一菌落，於固態培養基上進行分區劃線，再置於37℃之厭氧培養箱中培養直到單一菌落(single colony)出現。
(A-2)鑑定
取(A-1)所分離出之單一菌落的菌株後，進行基因族譜分析(phylogenetic analysis)，確認該菌株具有如SEQ ID NO：1所示之16S核糖體核糖核酸(16S rRNA)片段。使用NCBI(National Center for Biotechnology Information)線上資料庫進行比對，將SEQ ID NO：1所示的基因序列分別與其他腸膜明串珠菌亞種之16SrDNA序列進行序列比對後，可知分離菌株的16S rDNA序列與其他腸膜明串珠菌亞種的16SrDNA序列的相似性如表1所示。
因此，將此分離菌株命名為腸膜明串珠菌TCI007(後文以TCI007表示)。將此腸膜明串珠菌TCI007以寄存編號BCRC 910981寄存於財團法人食品工業發展研究所，以及以寄存編號DSM33502寄存於德國國家菌種保藏中心(DSMZ)。
表1
(A-3)保存
使用液態培養的方式將(A-1)所獲得之具單一性之腸膜明串珠菌株培養於MRS培養液中，以提供菌液，接著於菌液中添加25%之甘油，將所得混合液移至冷凍保存管中後，置於-80℃保存。
B. 腸膜明串珠菌TCI007之活化與樣品製備
(B-1)活化
將存有腸膜明串珠菌TCI007菌株之冷凍保存管解凍，以1%之植菌量(約1x104CFU/mL)將TCI007菌株接種於MRS培養液中，並置於37℃下進行厭氧培養，歷時18小時，以提供腸膜明串珠菌TCI007菌液，供後續實驗使用。
(B-2)樣品製備
取(B-1)提供的腸膜明串珠菌TCI007菌液，以1%之植菌
量(約1x104CFU/mL)接種於MRS培養液之中，並置於37℃下進行厭氧培養，歷時18小時。其後，以5000rpm轉速對培養後之菌液進行離心，歷時5分鐘，再使用0.2μm的濾膜對所獲得之上清液進行過濾，所得濾液即為TCI007樣品(含有腸膜明串珠菌TCI007之代謝產物)。
[實驗實施例]
實施例1：腸膜明串珠菌TCI007的多醣含量
以上述製備實施例中(B-1)活化所述步驟將腸膜明串珠菌TCI007活化。接著，將活化後的腸膜明串珠菌TCI007菌液，以1%之植菌量(約1x104CFU/mL)接種於20毫升的液態乳桿菌MRS培養基(BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth)中，然後於37℃下進行厭氧培養，分別在培養12小時、24小時時進行取樣程序，取樣程序包括：取1ml菌液，離心(5000rpm轉速)20分鐘後取上清液(不含菌體，即為腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物或是TCI007的上清液)，此上清液即為本實施例檢測多醣含量的測試樣本。
多醣含量檢測方式如下：本案以D-葡萄糖(D-Glucose)當量作為總多醣相對含量的表示。故以D-葡萄糖(D-Glucose)作為標準品製作標準曲線(Standard curve)。
首先，精密秤取D-葡萄糖(D-Glucose)(購自J.T.Baker，料號：1916-01)10mg，置於10mL容量瓶中，以二次蒸餾水(ddH2O)定量至10mL，配置成1mg/mL濃度之D-葡萄糖溶液。
接著，將上述標準品進行系列稀釋，以二次蒸餾水稀釋為
0,20,50,100,150,200μg/mL之D-葡萄糖溶液。可參酌下表2之方式配置標準溶液：
之後，取標準溶液各100μL放置於玻璃試管中，再各加入500μL濃度為5%的苯酚溶液(Phenol)(購自Merck，料號：1.00206.0250)。
接著緩慢加入2.5mL濃度為95.5%，比重1.84之濃硫酸溶液(H2SO4)(購自Showa，料號：1970-5250)。經由渦旋(vortex)確保無氣泡後，靜置20分鐘。最後，取200μL樣品放入96孔培養盤，於490nm下測定其吸光值，並繪製標準曲線。
將上述的培養12小時及培養24小時所得的TCI007的上清液，以水稀釋20倍至1200ml，並取100μL的體積至玻璃試管中，每組樣品需三重複。之後，加入500μL濃度為5%的苯酚溶液(Phenol)(購自Merck，料號：1.00206.0250)。
接著緩慢加入2.5mL濃度為95.5%，比重1.84之濃硫酸溶液(H2SO4)(購自Showa，料號：1970-5250)。經由渦旋(vortex)確保無氣泡後，靜置20分鐘。最後，取200μL樣品放入96孔培養盤，於
490nm下測定其吸光值，並以內插法算出濃度後再乘回稀釋倍數以取得原TCI007的上清液濃度。
如表3所示，隨著培養時間增加，腸膜明串珠菌TCI007之培養液中的多醣含量提升，可得知腸膜明串珠菌TCI007可分泌或經由其代謝等途徑使其培養液中的多醣含量提升，舉例而言，經12小時培養之腸膜明串珠菌TCI007之培養液經離心後所得的上清液(不含菌體，為腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物)中的多醣含量即為11.15g/L；經24小時培養之腸膜明串珠菌TCI007之培養液經離心後所得的上清液(不含菌體，為腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物)中的多醣含量即為32.8g/L。
實施例2：腸膜明串珠菌TCI007調節過敏相關因子的細胞實驗
(2-1)TCI007抑制組織胺能力實驗
組織胺(histamine)是一種有機含氮的環狀化合物，作為身體內的一種化學傳導物質，可以影響許多細胞的反應，包括過敏、發
炎反應，並具有作為瘙癢介體中心與調節腸道生理功能的作用。因此當過敏反應出現時，降低組織胺也成為改善過敏症狀的重要方式。
在此實施例中，利用DNP-HAS誘發鹼性粒細胞的組織胺的細胞模式，檢測TCI007樣品調節組織胺含量的能力。
A 實驗材料
1. 細胞株：大鼠嗜鹼性粒細胞性白血病細胞RBL-2H3(Rat basophilic leukemia cells，購於ATCC，料號CRT-2256)。
2. 培養液：最小必需培養液(Minimum essential medium)(MEM)(Gibco；Cat.11095080)，加入15%胎牛血清FBS(Gibco；Cat.10437-028)以及1%青黴素-鏈黴素(Gibco；Cat.15140122)。
3. 組織胺檢測試劑套組(購自USCN，型號CEA927Ge)，套組內含有以下溶液：
3-1：標準液(Standard)
3-2：標準稀釋劑(Standard diluent)
3-3：檢測試劑A(Detection reagent A)
3-4：檢測試劑B(Detection reagent B)
3-5：分析稀釋劑A(Assay diluent A)
3-6：分析稀釋劑B(Assay diluent B)
3-7：TMB液(TMB substrate)
3-8：終止液(Stop solution)
3-9：清洗液(Wash buffer)
4. 抗-DNP-IgE(購自Sigma，型號D8406)。
5. DNP-HAS溶液(dinitrophenyl-human serum albumin)(購自Biosearch，型號D-5059)。
實驗前準備
1.1倍DPBS：用滅菌後的dd水將10倍DPBS稀釋10倍；
2.1倍胰蛋白酶：用1X DPBS將10倍胰蛋白酶稀釋10倍；
3. DNP-HAS溶液：用無血清之MEM配置成最終濃度為1μg/ml；
4.1倍清洗溶液：將20ml的30倍清洗液加入580ml的ddH2O，混和均勻備用；
5. 檢測試劑A操作溶液：將檢測試劑A以分析稀釋劑A稀釋100倍。
6. 檢測試劑B操作溶液：將檢測試劑B以分析稀釋劑B稀釋100倍。
7. 標準序列稀釋：以2ml標準稀釋劑回溶，靜置至少10分鐘使其充分溶解，達最終濃度100ng/ml，準備5個新的1.5ml微量離心管，分別加入600μl的標準稀釋劑，接著在第一管加入300μl的標準液，混和均勻後再從第一管取300μl至第二管，依序稀釋至第4管，最後得到濃度為100ng/ml、33.33ng/ml、11.11ng/ml、3.70ng/ml及1.23ng/ml的序列稀釋液。
以下簡述組織胺檢測步驟，詳細操作步驟可參照組織胺檢測試劑內所附的使用說明書執行。
首先，將RBL-2H3細胞以1.5x105個細胞/孔的密度種入24孔細胞培養盤，培養液體積為500μl/孔，於CO2培養箱中培養18小時。待細胞貼附後，將培養基換成實驗和控制組培養基，培養基成分及額外添加成分如下表4所示。
接著，加入最終濃度為0.2μg/ml的抗-DNP-IgE，反應30分鐘。將孔盤內液體移除，加入500μl DNP-HAS溶液，於37度下反應30分鐘。反應結束後收集孔盤內的上清培養液備用。接著，將50μl/well的序列稀釋(如上述多個濃度)、空白組、控制組以及實驗組的上清培養液(不含細胞)加入已預塗且是隨時可使用的96孔板(包含
在組織胺檢測試劑套組中)上，再立即加入50μl/孔的檢測試劑A操作溶液，輕搖後，於37度下反應1小時。將孔盤中液體倒出，再加入350μl/孔的1倍清洗液，靜至1-2分鐘。倒置在紙巾上，盡量移除孔內所有液體。
接著，加入100μl/孔的檢測試劑B操作溶液，於37度下反應30分鐘。加入90μl/孔的TMB液，於37度下反應10-20分鐘(此需避光，且作用不可超過30分鐘)。加入50μl/孔的中止溶液，輕拍孔盤使其充分混和(變色)。
最後，以分光光度計(Thermo Fisher Scientific)測得O.D.450值，與序列稀釋的吸光值比較，求出所測樣品(各組別細胞培養液)的組織胺濃度，並使用Excel軟體中的student t-test進行統計分析。
經過吸光值的比較換算，空白組所測得組織胺含量為0.025ng/ml，控制組所測得組織胺含量為0.041ng/ml，實驗組所測得組織胺含量為0.011ng/ml；詳細而言，以DNP-HAS誘發鹼性粒細胞的組織胺後，再以0.125%體積百分比(相較於培養基)MRS培養液處理24小時後，組織胺並沒有被抑制，然而，若是以DNP-HAS誘發鹼性粒細胞的組織胺後，再以0.125%體積百分比(相較於培養基)TCI007上清液處理24小時後，組織胺明顯被抑制。
請參閱圖1。將空白組的組織胺的含量(0.025ng/ml)視為1(即100%)時，控制組的組織胺的含量(0.011ng/ml)為1.6238(即162.38%)，實驗組相對於空白組的組織胺的含量為0.433(即43.30%)，
代表細胞經TCI007上清液處理後，組織胺的含量降低，為空白組的0.43倍。
由此可知，當嗜鹼性粒細胞經TCI007樣品處理後，組織胺的含量被抑制，代表TCI007樣品能有效抑制組織胺含量，可抑制過敏情況。
(2-2)TCI007調控免疫相關基因實驗
此範例以RNA萃取套組、反轉錄酶、KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組配合定量PCR儀，測定人類單核球細胞株受經TCI007樣品處理後，細胞中免疫相關基因的變化。
舉例來說，免疫相關基因為IL-8基因，IL-8是一種多功能因子，能特異性趨化中性粒細胞進入炎性組織，調節免疫，此處以IL-8基因作為免疫相關基因分析標的。
材料與儀器
1. 細胞株(下稱細胞)：人類單核球細胞株THP-1(ATCC公司(瑞士)，TIB202)。
2. 培養基：添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、0.05mM 2-巰基乙醇(2-mercaptoethanol)、100單位/mL青黴素、及100μg/mL鏈黴素之RPMI 1640培養基(Gibco RPMI medium 1640；Thermo Fisher Scientific)。
3. RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，型號：FC24015-G)。
4. 反轉錄酶(SuperScript® III Reverse Transcriptase)
(Invitrogen公司，美國，編號18080-051)。
5. 測量標的基因引子，其中包含IL-8基因，另包括內部控制組(GAPDH基因)。
6. KAPA SYBR® FAST qPCR試劑組(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)。
7. ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))。
8. TCI007樣品：此實驗中所使用的TCI007樣品是透過如上製備實施例中的(B-2)樣品製備步驟所獲得。
首先，將人類單核球細胞(與此實施例簡稱為細胞)以每孔1×105個細胞量培養於含有2mL上述培養液之六孔培養盤中，並在37℃下培養16小時，然後將細胞分為以下三組：對照組、實驗組與空白組。
詳細來說，實驗組是將如上實施例(B-2)所製備的TCI007樣品0.125%(v/v)濃度的培養基2ml，培養人類單核球細胞株16小時；對照組是將MRS培養液0.125%(v/v)濃度的培養基2ml，培養人類單核球細胞株16小時。
空白組是單純使用2毫升培養液來培養人類單核球細胞，未再加入其他添加成分，培養人類單核球細胞株16小時，用於做為實驗空白組。
以上實驗組及空白組，每組進行四重複。
將處理後的細胞(即對照組、實驗組)以及空白組的細胞以細胞裂解液分別破細胞膜以形成三組的細胞溶液。接著，以RNA萃取試劑套組(購自Geneaid公司，台灣，Lot No.FC24015-G)分別萃取三組細胞溶液內的RNA。接著，每組取1000奈克(ng)的萃取出的RNA作為模板，透過SuperScript® III反轉錄酶(購自Invitrogene公司，美國，編號18080-051)將萃取出的RNA反轉錄為相應之cDNA。再藉由ABI StepOnePlusTM即時PCR系統(ABI StepOnePlusTM Real-Time PCR system(Thermo Fisher Scientific公司，美國))、KAPA SYBR FAST(購自Sigma公司，美國，編號38220000000)及表6的引子(SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：5)對兩組的cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應(quantitative real-time reverse transcription polymerase chain reaction)以觀察三組的人類單核球細胞內的IL-8基因的表現量。定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應的儀器設定條件為95℃反應20秒，接著95℃反應3秒，60℃反應30秒，並重複40個迴圈，並使用2-
△Ct方法進行基因定量。於此，藉由cDNA進行定量即時反轉錄聚合酶連鎖反應可間接定量IL-8基因的mRNA表現量，進而推斷IL-8基因編碼的蛋白質的表現量。
需要特別說明的是，下文述及之圖式中顯示的各基因的相對基因表現係以相對倍率呈現，其中使用Excel軟體之STDEV公式計算標準差，並在Excel軟體中以單尾學生t檢驗(Student t-test)分析是否具有統計上的顯著差異。圖式中「*」代表p值小於0.05，「**」代表p值小於0.01，以及「***」代表p值小於0.001。當「*」越多時，代表統計上的差異越顯著。
請參閱圖2。將空白組的IL-8基因的表現量視為1(即100%)時，控制組相對於空白組的IL-8基因的表現量為1.02(即102%)，實驗組相對於空白組的IL-8基因的表現量為3.05(即305%)，代表細胞經TCI007樣品處理後，IL-8基因的表現量升高，為空白組的3.05倍。
由此可知，當細胞經TCI007樣品處理後，細胞內與免疫相關基因的表現量提高，代表TCI007樣品有調節免疫之功能。
(2-3)TCI007提升嗜中性球活性實驗
嗜中性球為體內數量最多的白血球，在異物入侵時能迅速聚集，透過非專一性吞噬作用吞噬外來物質或病原體，並透過細胞內特定酵素與過氧化物殺死病原體，在人體免疫系統中扮演重要的角色。
本實驗將樣品與綠色螢光顆粒共同加入培養液培養四小時後，藉由測定細胞內聚集螢光顆粒之螢光強度，判斷嗜中性球吞噬作用之能力。
實驗材料
1. 細胞株：嗜中性球Neutrophil(自人類血液分離)。
2. 培養液：無血清造血細胞培養基(X-VIVOTM 15 Serum-free Hematopoietic Cell Medium)(X-VIVOTM 15)(購自Lonza；型號04-418Q)。
3. SPHERO螢光黃顆粒(Fluorescent Yellow Particles)(購自spherotech；型號Cat.FH-2052-2)。
4. TCI007樣品：此實驗中所使用的TCI007樣品是透過如上製備實施例中的(B-2)樣品製備步驟所獲得。
實驗步驟
首先，從人體血液中分離出嗜中性球，以106cells/well的密度種入6孔細胞培養盤，培養於含有2mL上述培養液之六孔培養盤中，然後將細胞分為以下三組：空白組、控制組與實驗組；
接著隨即在每個孔中以1：1000的體積比例加入SPHERO螢光黃顆粒共培養4小時，收取細胞後以1倍PBS清洗細胞1次，去除上清液(去除未被嗜中性球吞噬的螢光黃顆粒)，以1ml/管的1倍PBS重新懸浮細胞，以流式細胞儀(購於Beckman)測得螢光訊號，使用Excel軟體中的student t-test進行統計分析。
請參閱圖3。將空白組的螢光訊號表現量視為1(即100%)時，控制組相對於空白組的螢光訊號表現量為1.05(即105%)，實驗組相對於空白組的螢光訊號表現量為1.13(即113%)，螢光訊號即為被嗜中性球吞噬之螢光黃顆粒所產生的螢光，螢光訊號越強嗜中性球吞噬之螢光黃顆粒越多，吞噬作用越強；因此，代表細胞經TCI007樣品處理後，嗜中性球的吞噬作用升高，為空白組的1.13倍。
實施例3：腸膜明串珠菌TCI007調節過敏的人體實驗
(3-1)TCI007抑制人體組織胺能力實驗
為進一步確認TCI007對於人體組織胺含量的影響。以每顆膠囊含有5X109cells(即5X109cells/cap)的TCI007的活菌膠囊提供給6位受試者(持續性過敏性鼻炎族群)，每人每日睡前服用一顆，並服用
8週。並於服用TCI007膠囊前(視為第0週)及服用TCI007膠囊4週後(視為第4週)、服用TCI007膠囊8週後(視為第8週)進行受試者血液檢測，檢測項目包括受試者血液中的組織胺含量。其中，受試者血液中的體組織胺含量可將受試者血液以羥組織胺套組(廠牌：Elabscience，檢測套組名稱Hydroxyproline(Hyp)Colorimetric Assay Kit)，檢測方式是依照檢測套組所附的使用說明書所進行，或是採外部醫學檢驗所執行；較佳地，本實施例受試者血液中的體組織胺含量是委由立人檢驗所(台灣)執行。
請參閱圖4，於服用TCI007膠囊前，6位受試者的平均血液中體組織胺含量為0.94ug/ml(圖4標示第0週)，並於服用4週後，6位受試者的平均血液中體組織胺含量下降至0.41ug/ml(圖4標示第4週)，於服用8週後，6位受試者的平均血液中組織胺含量下降至0.21ug/ml(圖4標示第8週)。換言之，相較於第0週，於服用TCI007膠囊4週後，6位受試者的平均血液中體組織胺含量下降了0.53ug/ml，等於下降了57%；相較於第0週，於服用TCI007膠囊8週後，6位受試者的平均血液中體組織胺含量下降了0.73ug/ml，等於下降了78%。
換言之，當受試者每日服用5X109cells(即5X109cells/cap)的TCI007的活菌，持續服用4週後，血液中的組織胺含量下降了57%；持續服用8週後，血液中的組織胺含量下降了78%。
因此，由此可知，TCI007能有效抑制組織胺含量，可抑制過敏情況。
(3-2)TCI007改善過敏症狀的問券調查結果
首先對上述6位受試者於第0週(服用上述的腸膜明串珠菌TCI007的活菌膠囊前)、第4週(服用上述的腸膜明串珠菌TCI007的活菌膠囊後)以及第8周進行過敏狀況問卷調查，問卷中對於肌膚狀況進行調查，其調查及計分方式如下表8。其中，第一部分的各分數代表各種症狀的嚴重程度，0分為無困擾，1分為輕微，2分為中等，3分為稍嚴重，4分為嚴重，5分為非常嚴重。
其中，過敏情況嚴重是指，受試者對於其自身整體過敏狀況(例如皮膚搔癢等過敏性濕疹情況，或皺鼻、揉鼻等過敏性鼻炎)的程度評估。
項目1.問卷結果如下表9所示
其中，平均分數是經由所有受試者填寫的嚴重程度所對應的分數經過平均後求得，平均分數降低代表該項目的情況減輕。
綜合以上，由表9可看出，服用上述的腸膜明串珠菌TCI007的活菌膠囊4周及8周後，受試者對於項目1.嚴重流鼻水或鼻塞、項目2.過敏情況嚴重情況有改善，而項目3.經常打噴嚏則是影響不大(結果未示)。
實施例4：腸膜明串珠菌TCI007調節菌相的人體實驗
為進一步確認腸膜明串珠菌TCI007對於人體腸道菌相的影響。在上述受試者服用TCI007膠囊前(視為第0週)及服用TCI007膠囊4週後(視為第4週)、服用TCI007膠囊8週後(視為第8週)進行受試者腸道菌相檢測，檢測方式可以是採集受試者糞便檢體後，對糞便進行DNA萃取，並進行16S核糖體基因(16S ribosomal gene)的定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)，透過以知菌的引子序列來檢測常見腸內菌的菌數比例；檢測方式也可以將糞便進行DNA萃取後以次世代定序(Next Generation Sequencing(NGS))的方式，對檢體進行微生物體16S擴增子定序(16S Amplicon Sequencing)，其中特別是針對16S DNA其中的V3-V4區域進行放大，並進行後續的定序分析。本實施例是以次世代定序方式進行，由圖爾思生物科技股份有限公司進行微生物體16S擴增子定序(16S Amplicon Sequencing)，利用雙端定序(Paired-End)，透過Reads拼接過濾以及OTU(Operational Taxonomic Units)聚類，以進行物種注釋及豐度分析，揭示樣品物種構成，分析檢體內的微生物比例。
參照圖5，相比服用前(第0週)，持續4週服用TCI007膠囊後可雙歧桿菌(Bifidobacterium)增加約155%，持續8週服用TCI007膠囊後可使雙歧桿菌增加約117%。
參照圖6，相比服用前(第0週)，持續8週服用TCI007膠囊後可使嗜血桿菌(Haemophilus)減少約52%。
經文獻證實，雙歧桿菌為腸道中常見的益生菌，具有調理免疫及抗過敏功效。嗜血桿菌屬於正常成年人腸道菌相，極少引發疾病，經文獻證實，當過敏發生時，嗜血桿菌會刺激嗜鹼性球產生更多組織胺，使過敏反應更加嚴重。可參見例如：Various effects of different probiotic strains in allergic disorders：an update from laboratory and clinical data,2010 British Society for Immunology,Clinical and Experimental Immunology,160：295-304、Endotoxin from Haemophilus influenzae enhances IgE-mediated and non-immunological histamine release,Allergy.1990 Jan；45(1)：10-7，該文獻之全文併於此處以供參考。
透過受試者糞便檢體之定序檢測，分析TCI007對於人體菌相調節的能力，由以上結果可知，於服用TCI007膠囊後，受試者腸胃道內的雙歧桿菌明顯增加，代表TCI007具有調理免疫及抗過敏功效；於服用TCI007膠囊後，受試者腸胃道內的嗜血桿菌明顯減少，代表TCI007具有減少組織胺，降低過敏反應之功效。
綜上，透過實施例(2-1)可知，在細胞模式中，腸膜明串珠菌TCI007可降低組織胺含量。透過實施例(2-2)可知，腸膜明串珠菌
TCI007有調節免疫相關基因之能力，特別是IL-8基因。透過實施例(2-3)可知，腸膜明串珠菌TCI007能提升嗜中性球吞噬作用，代表TCI007能提升嗜中性球活性。透過實施例(3-1)可知，在人體實驗中，服用腸膜明串珠菌TCI007的菌體後，能降低人體組織胺的含量。透過實施例(3-3)可知，服用腸膜明串珠菌TCI007的菌體後，能改善人體流鼻水、鼻塞等過敏情況。透過實施例4可知，服用腸膜明串珠菌TCI007的菌體後，能調節人體腸胃道中的菌相，特別是增加雙歧桿菌、減少嗜血桿菌，因此有減少組織胺，降低過敏反應之功效。
雖然本發明的技術內容已經以較佳實施例揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神所作些許之更動與潤飾，皆應涵蓋於本發明的範疇內，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
TW中華民國 財團法人食品工業發展研究所2020/03/27 BCRC 910981
DE德國 德國國家菌種保藏中心DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)2020/04/17 DSM33502
<110> 大江生醫股份有限公司
<120> 腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物用於改善過敏狀況的用途
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1163
<212> DNA
<213> Leuconostoc mesenteroides
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Claims (7)
- 一種腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物在製備改善過敏狀況的組合物之用途，其中腸膜明串珠菌TCI007(Leuconostoc mesenteroides TCI007)寄存於財團法人食品工業發展研究所，且寄存編號為BCRC 910981，該代謝產物為於37℃厭氧環境培養該腸膜明串珠菌TCI007後的培養液經離心所得的上清液，且該腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物透過減少嗜血桿菌(Haemophilus)來改善過敏狀況。
- 如請求項1所述之用途，其中該腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物更包含該腸膜明串珠菌TCI007。
- 如請求項2所述之用途，其中該腸膜明串珠菌TCI007包含如SEQ ID NO：1所示之序列。
- 如請求項2所述之用途，其中該腸膜明串珠菌TCI007具有生成多醣之能力。
- 如請求項1所述之用途，其中該腸膜明串珠菌TCI007的代謝產物用以降低組織胺含量。
- 如請求項2所述之用途，其中該腸膜明串珠菌TCI007的有效劑量為5X109cells。
- 如請求項1所述之用途，其中該改善腸道菌相更包括增加雙歧桿菌(Bifidobacterium)。
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