TWI826198B

TWI826198B - 一種嗜熱鏈球菌st7用於調節免疫能力之用途

Info

Publication number: TWI826198B
Application number: TW111149133A
Authority: TW
Inventors: 陳威仁; 蔡侑倫; 李爾博
Original assignee: 生展生物科技股份有限公司
Priority date: 2022-12-21
Filing date: 2022-12-21
Publication date: 2023-12-11
Also published as: CN118217312A; JP2024089667A; TW202426627A; US20240207330A1; BE1031135A1

Abstract

本發明公開一種嗜熱鏈球菌ST7用於調節免疫能力之用途，其係包含使用該嗜熱鏈球菌ST7作為調節免疫能力的有效成分，該嗜熱鏈球菌ST7的寄存編號為BCRC911126及DSM34255；藉由投予有效量之嗜熱鏈球菌ST7至一個體，具有提高細胞之IL-12p40的表現量，且可以調整腸道菌相、提高腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例以提高免疫能力、以及提高抗病毒能力之功效。

Description

一種嗜熱鏈球菌ST7用於調節免疫能力之用途

本發明是有關於一種益生菌之用途，特別是一種嗜熱鏈球菌ST7用於調節免疫能力之用途。

現代社會中，對人類具有威脅性的病原包含如病毒、細菌、寄生蟲，其中公認威脅最大的是病毒，例如2019冠狀病毒病 (coronavirus disease 2019, Covid-19)的大流行，衝擊人類社會的行為模式。

人體的免疫力有不同的特化方向，例如T細胞的免疫可以調整成傾向抗病毒的Th1、抗真菌與寄生蟲的Th2、抑制自身免疫反應的Treg等。已知Th1免疫反應有助於減緩病毒導致的症狀並縮短患病時間，Th1代表性的抗病毒指標為IFN-γ、IL-12。其中已知食用微生物可能有調節免疫系統的能力，且促進機制是透過調節菌相、或是微生物具有調節免疫的有效成分。

益生菌保健食品中，絕大多數的益生菌補充劑是活菌的形式提供給消費者，主要原因為：(1) 一般認為僅有活菌才具有調節菌相的能力；(2)益生菌調節免疫系統的有效成分，可能是活菌的代謝物；(3)加工滅活時可能使調節免疫的有效成分喪失活性；然而，令人困擾的是，活菌益生菌在常溫儲藏下，活菌數會快速衰退，活菌轉變為死菌後的功能，備受質疑。

腸細胞有多種方式可以偵測病毒的存在，例如使用模式識別受體中的類鐸受體(toll-like receptor, TLR)識別病毒基因組的雙股RNA(double-stranded RNA, dsRNA)或病毒複製過程中的dsRNA，引起後續的免疫反應。聚肌胞苷酸(Polyinosinic acid-polycytidylic acid, 以下簡稱為poly I:C)是合成的dsRNA 類似物，TLR3能辨認poly I:C與dsRNA，隨後激活NF-kB並表現出發炎反應。在poly I:C誘導的腸道損傷動物模型中，腹膜內給予poly I:C會觸發腸道免疫反應，並以TLR3依賴的方式在腸道內造成嚴重的黏膜損傷。

然而，現有用於調節免疫能力的益生菌技術中，缺乏能夠同時大幅提升細胞之IL-12p40的表現量，且可以調整腸道菌相、提高腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例(Firmicutes/Bacteroidetes ratio, F/B ratio)以提高免疫能力、以及提高抗病毒能力之功效的益生菌；此外，現有用於調節免疫能力的益生菌技術中，大多是複數種活菌益生菌的複合菌株，目前沒有看到單一菌株的益生菌於滅活狀態即可用於同時提高免疫能力(抗病毒能力)以及調整腸道菌相。

有鑑於此，本發明人深刻瞭解前案之不足與缺陷，乃亟思加以改良創新，並經多年研究後，終於成功分離出可以大幅提升細胞之IL-12p40的表現量的同時，可以調整腸道菌相、提高腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例以提高免疫能力、以及提高抗病毒能力之功效的益生菌，也為益生菌調節免疫能力提供一個新穎且低成本的保健策略。

本發明的目的在於提供一種嗜熱鏈球菌ST7( Streptococcus thermophilusST7)用於製備調節免疫能力之醫藥組合物的用途，其係包含使用嗜熱鏈球菌ST7作為調節免疫能力的有效成分，嗜熱鏈球菌ST7的寄存編號為BCRC911126及DSM34255。

在本發明之一實施例中，嗜熱鏈球菌ST7為滅活菌。

在本發明之一實施例中，醫藥組合物不包含嗜熱鏈球菌ST7以外的其他菌種。

在本發明之一實施例中，嗜熱鏈球菌ST7係能用於提高細胞之IL-12p40的表現量，且IL-12p40的表現量為400 pg/mL至1000 pg/mL。

在本發明之一實施例中，嗜熱鏈球菌ST7係能用於調整腸道菌相，且提高腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例以提高免疫能力。

在本發明之一實施例中，嗜熱鏈球菌ST7係能用於提高抗病毒能力。

在本發明之一實施例中，抗病毒能力為緩解病毒引起的腸道損傷，提升抗病毒的免疫力。

在本發明之一實施例中，抗病毒能力為在病毒感染時增加CD4 ⁺的T細胞、CD8 ⁺的T細胞的活化。

在本發明之一實施例中，抗病毒能力為誘發CD4 ⁺的T細胞、CD8 ⁺的T細胞表現IFN-γ。

在本發明之一實施例中，嗜熱鏈球菌ST7的服用劑量為1 × 10 ⁶至1 × 10 ¹⁰CFU/天。

綜上所述，本發明所使用之嗜熱鏈球菌ST7( Streptococcus thermophilusST7)活菌，比同種的菌株相比能誘發更多的抗病毒指標IL-12p40，特別是在熱滅活後，效果更為突出。令人驚奇的是，利用腹腔注射小鼠病毒dsRNA擬似物poly I:C之模擬病毒感染的實驗中，嗜熱鏈球菌ST7之滅活菌除了提升抗病毒指標IFN-γ及T細胞抗病毒能力外，還能減緩腸道損傷、改變腸道菌相，顯示出令人驚異的抗病毒潛力。

[術語定義] 本說明書中廣泛地使用生物技術領域內習用之許多技術性及科學術語，在以下描述中，為了對本說明書及申請專利範圍以及賦予該等術語之範疇有清楚又一致的瞭解，提供以下定義。沒有在下述所特別定義的其他術語，則為該所屬專業人士領域可共同瞭解的意義。

本發明所使用之材料，除有特別指明者，皆為市售易於取得之材料。本發明實施例所使用之嗜熱鏈球菌ST7( Streptococcus thermophilusST7)，其係寄存於台灣新竹財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 911126；以及寄存於德國國家菌種保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存編號為DSM34255。

本說明書使用之「或」、「以及」、「和」，除非另有說明，皆指涉「或/和」。此外，用語「包含」、「包括」皆非有所限制之開放式連接詞。前述段落僅為系統性之指涉而不應解釋為對發明主體之限制。

本說明書使用之「%」若無特定說明皆指「重量百分比(wt%)」；數值範圍(如10%~11%的A)若無特定說明皆包含上、下限值(即10%≦A≦11%)；數值範圍若未界定下限值(如低於0.2%的B，或0.2%以下的B)，則皆指其下限值可能為0(即0%≦B≦0.2%)；各成份的「重量百分比」之比例關係亦可置換為「重量份」的比例關係。

本說明書中所揭露的所有數值可具有 ± 10% 的標準技術測量誤差(標準差)。詞彙「約」的目的是表示相對某給定值的 ±10%、±5%、±2.5%、或±1%，也就是說，「約20%」代表 20±2%、20±1%、20±0.5%、或 20±0.25%。

本說明書使用之「調節免疫能力」係指可專致的或非專致的增加或減少免疫反應，亦指可抑制過敏反應或自我免疫反應，但同時保留甚至增強對外來入侵物或癌細胞的抵抗作用。

本說明書使用之「醫藥組合物」係指稱一固體或液體組成物，其形式、濃度和純度程度適合投與給患者，在投與之後，其可誘發所欲生理變化；醫藥組成物為無菌及/或非發熱性者(non-pyrogenic)。

本說明書使用之「個體」係指需要或被認為潛在需要本發明的嗜熱鏈球菌ST7之組合物的任何哺乳動物，其包含靈長類、齧齒類、寵物、實驗室試驗動物、眷養野生動物。舉例來說，此可包含，但不限於：猴子、人類、豬隻、牛、綿羊、山羊、馬科動物、小鼠、大鼠、天竺鼠、倉鼠、兔子、貓(felines)、犬(canines)。較佳地，個體為小鼠或人類。

本說明書使用之「有效量」、「劑量」及其類似用語在本文中用於治療、治癒、預防或改善一疾病、障礙、或副作用，或降低一疾病或障礙的進展速度方面有作用的一藥劑的量。該術語在其範圍內還包括有效增強正常生理功能的量。

本說明書使用之「藥學上可接受」係指稱物質或組合物必須與其藥學上調配物之其他成分相容，且不加劇患者之症狀。

本發明提供之醫藥組合物係可利用本發明所屬技術領域具有通常知識者所詳知的技術，將本案所提供之有效成分或組合物，與至少一藥學上可接受之載劑(vehicle)，製備一適用本發明組合物之劑型。其中該劑型包含但不限於溶液、懸浮液、粉末、錠劑、口含錠、藥片、口嚼膠、膠囊以及其他類似或適用本發明之口服劑型。

本說明書使用之「藥學上可接受之載劑」包含一種或多種選自於下列的成分類型：溶劑、乳化劑、懸浮劑、分解劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、稀釋劑、膠凝劑、防腐劑、潤滑劑、表面活性劑、及其他類似或適用於本發明之口服載劑。

前述組合物中，亦可依需適宜地添加一種或多種以上製劑領域內通常使用之溶解輔助劑、緩衝劑、著色劑、調味劑等。

本說明書使用之「藥學上可接受之賦形劑」包括但不限於，聚合物、樹脂、增塑劑、填料、潤滑劑、稀釋劑、黏合劑、崩解劑、溶劑、共一溶劑、界面活性劑、防腐劑、甜味劑、調味劑、藥學級的染料或顏料、及黏度劑至少一者。

[嗜熱鏈球菌ST7]

本發明所使用之嗜熱鏈球菌ST7( Streptococcus thermophilusST7)，於2022年4月25日寄存於台灣新竹財團法人食品工業發展研究所，寄存編號為BCRC 911126；以及寄存於德國國家菌種保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)，寄存編號為DSM34255。

在一實施例中，嗜熱鏈球菌ST7可以為其發酵產物，例如可以為嗜熱鏈球菌ST7代謝物；在一實施例中，嗜熱鏈球菌ST7可以為活菌體或滅活菌，但從提升免疫力的觀點考慮，嗜熱鏈球菌ST7較佳為滅活菌，更佳為熱滅活菌(Heat-killed)。

本發明使用嗜熱鏈球菌ST7作為調節免疫能力的有效成分，其中有效成分的種類並不受到限制，例如嗜熱鏈球菌ST7可以搭配一種或多種其他益生菌的菌種或菌株形成益生菌組合物，也可以僅由嗜熱鏈球菌ST7作為有效成分；在一實施例中，從生產成本的觀點考慮，調節免疫能力的有效成分較佳為僅包含嗜熱鏈球菌ST7，換句話說，在本發明之嗜熱鏈球菌ST7用於製備調節免疫能力之醫藥組合物的用途中，其醫藥組合物較佳為不包含嗜熱鏈球菌ST7以外的其他菌株或菌種。

[提升免疫力的方法] 本發明另揭示一種嗜熱鏈球菌ST7用於提升免疫力的方法，該方法是關於向有需要之個體投予有效量之嗜熱鏈球菌ST7，嗜熱鏈球菌ST7的寄存編號為BCRC911126及DSM34255。

本發明之提升免疫力方法是關於向個體(例如人類個體)投予嗜熱鏈球菌ST7以調節免疫能力。根據本發明之提升免疫力方法亦可適用於在個體中提高細胞之IL-12p40的表現量、調整腸道菌相(提高腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度)、提高抗病毒能力(緩解病毒引起的腸道損傷、增加CD4 ⁺的T細胞、CD8 ⁺的T細胞的活化、誘發該CD4 ⁺的T細胞、CD8 ⁺的T細胞表達IFN-γ)。

在一實施例中，本發明之嗜熱鏈球菌ST7誘發細胞表現抗病毒指標IL-12p40的表現量為約400 pg/mL至1000 pg/mL，例如為約450 pg/mL、500 pg/mL、550 pg/mL、600 pg/mL、650 pg/mL、700 pg/mL、750 pg/mL、800 pg/mL、850 pg/mL、900 pg/mL、950 pg/mL、以及前述任意兩個數值之間的範圍。本發明之嗜熱鏈球菌ST7誘發IL-12p40效果較其他嗜熱鏈球菌菌株突出。

[嗜熱鏈球菌ST7之給藥] 本發明提供之醫藥組合物的適當之給藥途徑包含，但不限於口服、靜脈、直腸、氣霧、腸胃道、眼、肺、黏膜穿透、皮膚穿透、陰道、耳、鼻或局部給藥。此外，腸胃道給藥之示例包括但不限於肌肉內、皮下、靜脈內、髓內注射，以及髓鞘內、心室內、腹腔內、淋巴內或鼻內注射。本發明所提供之醫藥組合物之使用劑型，可視需求適宜調整，並未特別限定，較佳者為口服劑型。

[嗜熱鏈球菌ST7之劑量]

在本發明的提升免疫力方法中，向有需要之個體投予有效量之嗜熱鏈球菌ST7。詳言之，視投藥目的、需求個體之健康及身體狀況、年齡、需求個體之分類組(例如人類、非人類靈長類、靈長類等)、嗜熱鏈球菌ST7之劑型、治療臨床醫師對醫學情形之評估及其他相關因素而變化。預期該量將在相對寬的範圍內，此可經由常規試驗來測定。

在一實施例中，視需求可以採用不同的嗜熱鏈球菌ST7的服用劑量，通常為約1 × 10 ⁶至1 × 10 ¹⁰CFU/天，例如可以為約5 × 10 ⁶、1 × 10 ⁷、5 × 10 ⁷、1 × 10 ⁸、5 × 10 ⁸、1 × 10 ⁹、5 × 10 ⁹CFU/天、以及前述任意兩個數值之間的範圍。

在一實施例中，視需求可以採用不同的嗜熱鏈球菌ST7的服用週期，通常為約2天至4個月或更長，例如可以為約2、4、6、8、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60天；再比如，可以為約1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、15週、16週、17週、18週或更長。

在一實施例中，視需求可以採用不同的嗜熱鏈球菌ST7的服用頻率，例如可以為約一天施用1至3次、兩天施用1至6次、三天施用1至9次、一週施用1至14次、一月施用1至60次。

本發明提供之醫藥組合物可進一步添加一可食性材料，以製備為一種食品產品或保健產品。其中該可食性材料包含，但不限於：水(Water)、流體乳品(Fluid milk products)、牛奶(Milk)、濃縮牛奶(Concentrated milk)、優酪乳(Yogurt)、酸乳(Sour milk)、冷凍優格(Frozen yogurt)、乳桿菌發酵飲料(Lactic acid bacteria-fermented beverages)、奶粉(Milk powder)、冰淇淋(Ice cream)、乳酪(Cream cheeses)、乾酪(Dry cheeses)、豆奶(Soybean milk)、發酵豆奶(Fermented soybean milk)、蔬果汁(Vegetable-fruit juices)、果汁(Juices)、運動飲料(Sports drinks)、甜點(Confectionery)、果凍(Jellys)、糖果(Candies)、嬰兒食品(Infant formulas)、健康食品(Health foods)、動物飼料(Animal feeds)、中草藥材(Chinese herbals)或膳食補充品(Dietary supplements)。

以下列舉數個實施例與比較例，來說明本發明的嗜熱鏈球菌ST7用於調節免疫能力之用途，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明精神與範圍內，當可做各種更動與潤飾。

以下各實施例中之數據為使用Prism software(GraphPad, USA)分析Mann–Whitney t tests及one-way ANOVA，結果之誤差線為標準偏差(the standard error of the mean, SEM)。菌相富集分析使用LDA(Linear discriminant analysis)、LEfSe(Linear discriminant analysis Effect Size)方法，使用 Kruskal–Wallis 和Wilcoxon 檢驗比較數據；在P ≤ 0.05且對數LDA評分 ≥ 2 時判定為顯著。

[實施例1：生物材料準備]

將嗜熱鏈球菌ST7係可培養於一般生長培養基，例如含有約1~2%葡萄糖、約1~2%蛋白腖、約0.01~0.08%硫酸鎂等之培養基；以下實施例所使用之其他嗜熱鏈球菌株皆為本發明所屬技術領域中具有通常知識者能夠易於取得者，故不需要進行寄存。

[實施例2：嗜熱鏈球菌ST7大幅誘發細胞表現抗病毒指標IL-12p40的含量]

為了說明本發明之嗜熱鏈球菌ST7相較於其他嗜熱鏈球菌菌株具有更佳的調節免疫之功效，以及說明嗜熱鏈球菌各菌株之活菌體或滅活菌是否影響其調節免疫之功效；在本實施例中，選擇嗜熱鏈球菌STI-001、STI-002、STI-003、Ta 39、BCRC14086、BCRC13689、ST7等不同的菌株，並將上述各菌株分成活菌體組與滅活菌組進行試驗，具體實驗方法如下：

將約50%腦心浸出培養液 (Brain Heart Infusion broth, BHI broth)與約50% MRS(DeMan-Rogosa-Sharpe)培養液混和後，使用該培養液於約37℃培養上述嗜熱鏈球菌各菌株，並於靜止期(stationary phase)的前期收取樣品，離心並以約0.9% NaCl溶液中洗滌，再重新懸浮於約0.9% NaCl溶液中，即為活菌體；將活菌體以約70℃加熱約30分鐘即為滅活菌(熱滅活菌)。

使用小鼠巨噬細胞J774A.1細胞株(BCRC 60140)，其購買自生物資源保存及研究中心，並以含有約10%胎牛血清(fetal bovine serum)的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)培養液，於約37℃ 5% CO ₂培養。加入約4 × 10 ⁴/100 μL的J774A.1細胞至96孔盤中培養，再加入約2 × 10 ⁵/50 μL的嗜熱鏈球菌各菌株，而控制組單獨加入J774A.1細胞而不加入任何嗜熱鏈球菌。於加入嗜熱鏈球菌約24小時後，收取培養上清液，以酵素免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)套組測定IL-12p40的含量。

請參考圖1，圖1顯示出不同菌株的嗜熱鏈球菌所誘發細胞表現抗病毒指標IL-12p40的含量，從圖中可知，相較於一般的嗜熱鏈球菌STI-001、STI-002、STI-003、BCRC14086、Ta 39、或BCRC13689等菌株，本發明之嗜熱鏈球菌ST7可以大幅誘發細胞表現抗病毒指標IL-12p40的含量，藉此說明本發明之嗜熱鏈球菌ST7相較於其他嗜熱鏈球菌菌株具有更佳的調節免疫能力之功效。

並且，從圖1可知，本發明之嗜熱鏈球菌ST7不需要添加其他菌株即具有顯著的調節免疫能力之功效，即本發明不需要包含嗜熱鏈球菌ST7以外的其他菌株或菌種，為益生菌調節免疫能力提供一個新穎且低成本的保健策略。

此外，從圖1可知，在一般的嗜熱鏈球菌STI-001、STI-002、STI-003、BCRC14086、Ta 39、或BCRC13689等菌株中，相較於滅活菌，其活菌體誘發巨噬細胞J774A.1表現抗病毒指標IL-12p40的含量有較高的趨勢；另一方面，在本發明之嗜熱鏈球菌ST7中，反而是滅活菌誘發巨噬細胞J774A.1表現抗病毒指標IL-12p40的含量顯著較高，藉此說明本發明之嗜熱鏈球菌ST7與一般嗜熱鏈球菌菌株在免疫調節上具有非常不同的特性，且本發明之嗜熱鏈球菌ST7之滅活菌具有較佳的調節免疫能力之功效；因此，將以嗜熱鏈球菌ST7之滅活菌進行以下的試驗。

本發明實施例所使用之嗜熱鏈球菌ST7以外的嗜熱鏈球菌菌株係用於作為比較例，該等菌株(STI-001、STI-002、STI-003、BCRC14086、Ta 39、BCRC13689)不應作為評斷本發明是否可據以實現的依據，如有需要，亦可使用市售或其他任何途徑取得之嗜熱鏈球菌菌株取代該等菌株。使用市售或其他任何途徑取得之嗜熱鏈球菌菌株取代該等菌株(STI-001、STI-002、STI-003、BCRC14086、Ta 39、BCRC13689)作為比較例不會影響本發明之實施。

[實施例3：動物實驗設計]

首先，準備年齡約八週的C57BL/6JNarl雄性小鼠(購自國家動物中心)，飼養於無特異病原(specific-pathogen-free)之環境，使小鼠隨意攝食常規均衡飲食(conventional balanced diet) 7天；接著，請參考圖2，圖2係為本發明之動物實驗設計圖，如圖所示，將隨意攝食常規均衡飲食7天後作為第0天，接著將小鼠分為控制組、poly I:C組、poly I:C+ST7組等三組，三組皆小鼠隨意攝食常規均衡飲食。

請參考圖2，在控制組中，第0天到第7天的期間內管餵純水，第8天時腹腔注射約100 μg/g的磷酸鹽緩衝液(phosphate buffered saline, PBS)，2小時後採血進行生化分析；在poly I:C組中，第0天到第7天的期間內管餵純水，第8天時腹腔注射約100 μg/g的poly I:C，2小時後採血進行生化分析；在poly I:C+ST7組中，第0天到第7天的期間內管餵10 ⁷cells/mouse/day的嗜熱鏈球菌ST7之滅活菌，第8天時腹腔注射約100 μg/g的poly I:C，2小時後採血進行生化分析；三個組別均在第9天秤量體重、收集腸道組織(例如小腸與盲腸中的糞便)並保存於-80°C供菌相分析；其中血清儲存於-80度，並以市售ELISA套組分析血清IFN-γ含量。

[實施例4：嗜熱鏈球菌ST7減輕poly I:C所導致的體重流失]

請參考圖3，圖3顯示出嗜熱鏈球菌ST7影響小鼠體重，以相較於控制組小鼠之體重流失百分比的形式呈現，n=5，*P＜0.05；如圖所示，poly I:C用於模擬病毒感染，poly I:C之病毒感染組使小鼠產生體重流失(約5%)；另一方面，poly I:C+ST7之給藥組顯著減輕了病毒所引起的體重流失(約2%)，因此，本發明之嗜熱鏈球菌ST7可以減輕病毒所導致的體重流失，具有改善病毒症狀之功效。

[實施例5：嗜熱鏈球菌ST7緩解poly I:C所引起的小腸損傷]

小腸組織病理評估的方法如下：切除小腸以PBS洗滌，再浸泡於福馬林溶液中固定，再脫水包埋製作切片，以蘇木精伊紅染色(hematoxylin and eosin stain, H&E stain)，病理評分與絨毛長度可以參考下述技術文獻： Int J Clin Exp Pathol2014, 7, 4557-4576. PLoS One2014, 9, e110549, doi:10.1371/journal.pone.0110549.

請參考圖4，圖4顯示出嗜熱鏈球菌ST7影響小腸病理，圖4中的上圖為小腸切片後經蘇木精伊紅染色後之病理照片，左下圖為小腸組織病理評分，右下圖為小腸絨毛長度，n=5，*P＜0.05，**P＜0.01；如圖所示，poly I:C之病毒感染組誘導小鼠產生小腸組織炎症、絨毛縮短；另一方面，poly I:C+ST7之給藥組顯著減少病毒所引起的小腸炎症、絨毛縮短，因此，本發明之嗜熱鏈球菌ST7能緩解病毒透過TLR3引起的腸道損傷，具有改善病毒症狀之功效。

[實施例6：嗜熱鏈球菌ST7顯著增加poly I:C所刺激的IFN-γ表現量]

IFN-γ表現量分析的方式如下：細胞培養於含佛波醇肉荳蔻酸酯乙酸酯(phorbol myristate acetate) 100 ng/mL、離子運載物A23187 (ionophore A23187) 1 μg/mL、10%體積百分比之胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)的RPMI培養基中3小時，再加入布雷非德菌素A(Brefeldin A) 5ug/mL培養2小時，細胞以T細胞相關的表面標記染色，在細胞內染IFN-g-APC (XMG1.2)或同型對照(isotype control)，接著以流式細胞儀分析。

請參考圖5，圖5顯示出嗜熱鏈球菌ST7影響血液中IFN-γ含量，***P＜0.001；如圖所示，poly I:C之病毒感染組刺激小鼠產生血清IFN-γ；另一方面，poly I:C+ST7之給藥組顯著增加病毒所刺激的血清IFN-γ含量，因此，服用本發明之嗜熱鏈球菌ST7能提升抗病毒的免疫力。

[實施例7：嗜熱鏈球菌ST7調節poly I:C刺激後的腸道菌相]

為了說明嗜熱鏈球菌ST7能夠影響小鼠的腸道菌相，本試驗偵測各組小鼠糞便的微生物群的Alpha多樣性，其方法為利用市售QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Germany)萃取小鼠糞便的DNA，再使用Illumina MiSeq system泛用的引子對341F與805R擴增細菌16S rRNA的V3-V4 region。使用 Cutadapt (v1.12) 刪除了多餘的定序數。使用 R (v3.6.1) 軟件中的 DADA2 包 (v1.14.1) 處理過濾後的定序序列。使用 DADA2 包推斷樣本中的 V3-V4 序列變異，並獲得每個樣本中每個序列的頻率。使用 SILVA 數據庫 (v138) 進行菌種分類。使用 DECIPHER (v2.14.0) 和 phangorn (v2.14.0) 軟件進行序列比對和繪製系統發育樹，以及使用 phyloseq (v1.30.0) 軟件進行群落分析。計算Alpha多樣性指數以估計菌種豐富度。使用Wilcoxon-Mann-Whitney 檢驗 (α = 0.05) 進行統計分析。更詳細的試驗方法可以參考下述技術文獻： Brain Sci2021, 11, doi:10.3390/brainsci11081085.。

請參考圖6，圖6顯示出嗜熱鏈球菌ST7影響小鼠的腸道菌相，樣本取自於各組小鼠的糞便以偵測糞便的微生物群分佈，從圖6的A圖可知，各組之微生物群的Alpha多樣性皆相似，但從圖6的B圖可知，與控制組的小鼠相比，poly I:C之病毒感染組處理顯著改變了微生物群分佈，影響其Beta多樣性；從圖6的C圖可知，餵食本發明的嗜熱鏈球菌ST7之poly I:C+ST7給藥組又可以再改變微生物群分布。

以下更具體說明圖6的B圖，其是控制組、poly I:C之病毒感染組和poly I:C+ST7之給藥組小鼠的主成分分析圖。其中Beta多樣性的顯著差異分析是用排列多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance; vegan::adonis，1000 permutations)，使用betadisper(vegan::betadisper，1000 permutations)對其進行了量化。Adonis 和betadisper指數分別產生 P value ＜0.05 和 P value ＞0.05。

請參考圖7，圖7顯示出嗜熱鏈球菌ST7對腸道菌相之微生物分類群影響，其是使用LEfSe分析，並將顯著的分類群差異定義為LDA分數(log10) ≥2，*P＜0.05；從圖7可知，控制組有較多的放線菌門(Actinobacteriota)、擬桿菌門(Bacteroidota)、彎曲桿菌門(Campilobacterota)與細菌門-芽孢桿菌屬之Patescibacteria。與控制組相較，poly I:C組有較多的變形菌門(Proteobacteria)、丙型變形菌綱 (Gammaproteobacteria)綱、另枝菌屬(Alistipes)。與poly I:C組相比，ST7+poly I:C組則有較多的厚壁菌門(Firmicutes)、梭菌綱 (Clostridia)、Lachnospirales科。

請參考圖8，圖8顯示出嗜熱鏈球菌ST7對腸道菌相之厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例是近年微生物體研究中，用來衡量特定疾病風險的一項因子，在腸炎疾病中，通常可觀察到厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例的比率降低，從圖8可知，在poly I:C之病毒感染組中，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例偏低，而在poly I:C+ST7之給藥組中，嗜熱鏈球菌ST7的給藥顯著增加厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例，說明本發明之嗜熱鏈球菌ST7可以改變腸道菌相並緩解腸炎疾病。

綜上所述，由於腸道菌群失調常與炎症和感染同時出現，一般認為活菌益生菌具有調節腸道菌相、改善腸炎的潛力，但本試驗意外的發現熱滅活的嗜熱鏈球菌ST7可以在poly I:C誘導腸炎後調節腸道菌相，亦即，本發明之嗜熱鏈球菌ST7的滅活菌可以改善病毒誘導的腸道損傷小鼠的菌相失調。

[實施例8：嗜熱鏈球菌ST7在病毒感染時增加CD4 ⁺的T細胞、CD8 ⁺的T細胞的活化]

為了說明本發明之嗜熱鏈球菌ST7對於免疫細胞的影響，本試驗使用流式細胞術進行實驗，利用特定抗體染色細胞表面分子後，以流式細胞儀分析。使用與BioLegend螢光染料連結的下述抗體：CD3-FITC (2C11)、CD8α-APC-Cy7 (53-6.7)、CD19-PB (6D5)、CD4-PE-Cy7 (GK1.5)、或CD69-PE (H1.2F3)，藉由上述試驗以檢測poly I:C刺激後的CD69表達來研究嗜熱鏈球菌ST7是否可以調節T細胞活化。

請參考圖9，圖9顯示出嗜熱鏈球菌ST7影響脾臟CD8 ⁺T細胞及CD4 ⁺T細胞的活化，n=5，*P＜0.05，如圖所示，單獨餵食嗜熱鏈球菌ST7不影響脾臟的CD69 ⁺CD8 ⁺T細胞和CD69 ⁺CD4 ⁺T細胞計數，然而，在poly I:C+ST7之給藥組中，觀察到CD69 ⁺CD8 ⁺T細胞和CD69 ⁺CD4 ⁺T細胞計數上升，顯示當有poly I:C刺激時，嗜熱鏈球菌ST7能促進脾臟CD8 ⁺T細胞與CD4 ⁺T細胞活化，藉此提高免疫能力、以及提高抗病毒能力之功效。

[實施例9：嗜熱鏈球菌ST7誘發CD4 ⁺的T細胞、CD8 ⁺的T細胞表達IFN-γ]

IFN-γ是關鍵性的抗病毒細胞激素，為了說明本發明之嗜熱鏈球菌ST7對於IFN-γ表現的影響，將各組小鼠於注射poly I:C或PBS後兩小時，測量其脾臟CD4 ⁺T細胞與CD8 ⁺T的細胞內之IFN-γ表現量。

請參考圖10，圖10顯示嗜熱鏈球菌ST7影響脾臟CD8 ⁺T細胞及CD4 ⁺T細胞內表現IFN-γ，n=5，*P＜0.05，如圖所示，當poly I:C刺激兩小時後，脾臟CD8 ⁺T細胞及CD4 ⁺T細胞內的IFN-γ表現量並未改變，然而令人驚訝的是，單純服用嗜熱鏈球菌ST7就顯著增加脾臟CD8 ⁺T細胞及CD4 ⁺T細胞內的IFN-γ表現量，且在poly I:C存在時效果更為強烈，顯示不論是否有poly I:C刺激，嗜熱鏈球菌ST7能促進poly I:C刺激後之脾臟CD8 ⁺T細胞及CD4 ⁺T細胞內表現IFN-γ，藉此提高免疫能力、以及提高抗病毒能力之功效。

綜上所述，食用嗜熱鏈球菌ST7可以誘導CD4 ⁺T細胞與CD8 ⁺T細胞的抗病毒能力，且在與poly I:C同時刺激時，又可增加CD4 ⁺T細胞與CD8 ⁺T細胞的活化，顯示出良好的預防、緩解病毒感染與相關症狀的能力。

本發明之嗜熱鏈球菌ST7具有下列特徵： (1) 嗜熱鏈球菌ST7誘發IL-12p40效果較其他嗜熱鏈球菌菌株突出。 (2) 嗜熱鏈球菌ST7滅活後反而效果增強，與其他嗜熱鏈球菌菌株明顯不同。 (3) 食用嗜熱鏈球菌ST7(特別是滅活菌)具調節菌相的能力，可以提高腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例。 (4) 食用嗜熱鏈球菌ST7(特別是滅活菌)能提高抗病毒能力，可以提高血清IFN-γ表現量，並藉由誘發CD4 ⁺T細胞、CD8 ⁺T細胞表達IFN-γ，以及於病毒感染時提高CD4 ⁺T細胞、CD8 ⁺T細胞活化，藉此促進T細胞抗病毒功能。

上列詳細說明係針對本發明之可行實施例之具體說明，惟該實施例並非用以限制本發明之專利範圍，凡未脫離本發明技藝精神所為之等效實施或變更，均應包含於本案之專利範圍中。

上述多項功效，實屬充分符合新穎性及進步性之法定專利要件，爰依法提出申請，懇請　貴局核准本件發明專利申請案，以勵發明。

圖1顯示出不同菌株的嗜熱鏈球菌所誘發細胞表現抗病毒指標IL-12p40的含量比較之長條圖。圖2係為本發明之動物實驗設計圖。圖3顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7影響體重變化的散點圖。圖4顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7影響小腸病理的病理組織圖及散點圖。圖5顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7影響血液中IFN-γ含量的散點圖。圖6顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7影響腸道菌相之統計圖表，其中A圖顯示Alpha多樣性；B圖及C圖顯示不同組別之Beta多樣性。圖7顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7對腸道菌相的影響中，豐度有顯著差異的微生物分類群。圖8顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7對腸道菌相的影響中，厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例。圖9顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7影響脾臟CD8 ⁺T細胞及CD4 ⁺T細胞的活化。圖10顯示出動物實驗之嗜熱鏈球菌ST7影響脾臟CD8 ⁺T細胞及CD4 ⁺T細胞內表現IFN-γ。

國內寄存資訊(依寄存機構、日期、號碼順序註記) 1. 財團法人食品工業發展研究所，寄存日期為2022年4月25日、寄存編號為BCRC 911126 國外寄存資訊(依寄存國家、機構、日期、號碼順序註記) 1. 寄存於德國，德國國家菌種保藏中心(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures，DSMZ)、寄存日期為2022年4月28日、寄存編號為DSM 34255

無。

Claims

一種嗜熱鏈球菌ST7(Streptococcus thermophilus ST7)用於製備調節免疫能力之醫藥組合物的用途，其係包含使用該嗜熱鏈球菌ST7作為調節免疫能力的有效成分，該嗜熱鏈球菌ST7的寄存編號為BCRC911126及DSM34255，該嗜熱鏈球菌ST7係能用於提高細胞之IL-12p40的表現量，能用於提高抗病毒能力。
如請求項1所述之用途，其中該嗜熱鏈球菌ST7為滅活菌。
如請求項1所述之用途，其中該醫藥組合物不包含嗜熱鏈球菌ST7以外的其他菌種。
如請求項1所述之用途，其中該IL-12p40的表現量為400pg/mL至1000pg/mL。
如請求項1所述之用途，其中該嗜熱鏈球菌ST7係能用於調整腸道菌相，且提高腸道中的厚壁菌門和擬桿菌門的豐度比例以提高免疫能力。
如請求項1所述之用途，其中該抗病毒能力為緩解病毒引起的腸道損傷，提升抗病毒的免疫力。
如請求項1所述之用途，其中該抗病毒能力為在病毒感染時增加CD4⁺的T細胞、CD8⁺的T細胞的活化。
如請求項7所述之用途，其中該抗病毒能力為誘發該CD4⁺的T細胞、CD8⁺的T細胞表現IFN-γ。
如請求項1所述之用途，其中該嗜熱鏈球菌ST7的服用劑量為1×10⁶至1×10¹⁰CFU/天。