TWI463987B

TWI463987B - 使用包含有４株乳酸菌菌株的混合物來預防和／或治療雞球蟲病

Info

Publication number: TWI463987B
Application number: TW101134006A
Authority: TW
Inventors: Hau Yang Tsen; Chih Yuan Chen; Li Tsen Chuang; chun li Lin
Original assignee: Univ Hungkuang
Priority date: 2012-09-17
Filing date: 2012-09-17
Publication date: 2014-12-11
Also published as: TW201412320A

Description

使用包含有4株乳酸菌菌株的混合物來預防和/或治療雞球蟲病

本發明是有關於使用一包含有嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )LASW、糞腸球菌(Enterococcus faecium )TM39、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum )LF33以及胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum )BCRC 10069的混合物來預防和/或治療雞球蟲病(chicken coccidiosis)，其中該嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39以及發酵乳桿菌LF33分別以寄存編號BCRC 910276、910248以及910554被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)。

球蟲病(coccidiosis)是一種由球蟲(coccidia)的感染所引起的寄生蟲病(parasitic disease)，而發生在雞隻中的球蟲病被稱為雞球蟲病(chicken coccidiosis)。常見會引起雞球蟲病的球蟲包括下列7種艾美球蟲屬物種(Eimeria spp.)：盲腸型球蟲(Eimeria tenella )(又被稱為柔嫩艾美球蟲)、毒害艾美球蟲(Eimeria necatrix )、堆型艾美球蟲(Eimeria acervulina )、巨型艾美球蟲(Eimeria maxima )、布氏艾美球蟲(Eimeria brunetti )、和緩艾美球蟲(Eimeria mitis )以及早熟艾美球蟲(Eimeria praecox )，其中盲腸型球蟲以及毒害艾美球蟲的致病性(pathogenicity)最高，而早熟艾美球蟲的致病性最低。

雞球蟲病是藉由球蟲卵囊(coccidian oocyst)的口服攝食(oral intake)而被感染。艾美球蟲屬物種主要寄生在雞隻的腸黏膜(intestinal mucosa)上，而寄生的棲所(habitat of parasite)會隨著艾美球蟲屬物種的不同而有所差異，例如，盲腸型球蟲主要感染盲腸(caecum)，而堆型艾美球蟲主要感染十二指腸(duodenum)(Swinkels W.J.C.et al .(2006),Vet.Parasitol .,138：223-233)。帶有雞球蟲病的雞隻會出現腹瀉(diarrhea)、食慾不振(anorexia)、厭食(asitia)、體重下降以及血痢(hemorrhagic dysentery)等臨床症狀，而嚴重者最終會導致死亡。

現今在家禽養殖業中常被使用的抗球蟲藥物(anticoccidial drugs)可依據它們的製備方法與作用機制而大致被歸納為下面2大類：(1)化學品：例如，影響輔因子(cofactor)合成的安保寧(Amprolium)與衣索巴(Ethopabate)，以及影響粒線體功能(mitochondrial function)的乃卡巴精(Nicarbazin)與氯吡啶(Clopidol)，它們皆是由化學合成而被製備；以及(2)離子通透促進劑(ionophore)：例如，由鏈黴菌屬物種(Streptomyces spp.)的發酵所生成的沙利黴素(Salinomycin)與孟寧素(Monensin)，以及由馬杜拉放線菌屬物種(Actinomadura spp.)的發酵所生成的馬杜拉黴素(maduramicin)，它們皆是屬於多醚類抗生素(polyether antibiotics)，能夠影響跨細胞膜的陽離子運輸(cation transport)進而導致滲透傷害(osmotic damage)。

然而，長期使用上述的抗球蟲藥物可能會導致抗藥性球蟲(drug resistant coccidia)的產生，並且該等藥物會藉由累積在雞隻體內而進入食物鏈(food chain)中，最終可能危害人類以及動物的健康。因此，本領域的相關研究人員皆致力於開發具有抗雞球蟲病效用(anti-chicken coccidiosis effect)並且不會產生非所欲的副作用的藥物。

乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是一群能夠發酵醣類並以乳酸為主要代謝產物的革蘭氏陽性菌，它們普遍存在於乳製品、醃漬品以及人類或動物的腸道黏膜中。乳桿菌已廣為被接受的形態與生理特徵包括：(1)外形為球狀(cocci)或桿狀(rod)；(2)缺乏細胞色素及過氧化氫酶(catalase)；(3)不形成內生性孢子；以及(4)不具運動性。

乳酸菌是屬於一般被公認為安全的(generally recognized as safe,GRAS)並且是為人所熟悉與廣泛使用的益生菌(probiotics)。乳酸菌已被發現到具有抑制腸胃道病原菌生長、緩和乳糖不耐症(lactose intolerance)、免疫調節(immunoregulation)、抗癌(anti-cancer)以及降血壓等功效。可作為益生菌使用的乳酸菌有許多種類，例如乳桿菌屬(Lactobacillus )、乳球菌屬(Lactococcus )、小球菌屬(Pediococcus )、鏈球菌屬(Streptococcus )以及腸球菌屬(Enterococcus )等。

已有研究顯示，不同的乳酸菌菌株的組合要比單一乳酸菌菌株的使用展現出一更優越的益生效用。例如，在Dalloul R.A.等人的一系列研究中，將添加有以乳桿菌屬-為基礎的益生菌(Lactobacillus -based probiotic)[商品名為Primalac^® ，其包含有經脫水的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )的發酵產物、經脫水的乳酪乳桿菌(Lactobacillus casei )的發酵產物、經脫水的雙叉型雙叉桿菌(Bifidobacterium bifidum )的發酵產物以及經脫水的屎腸球菌(Enterococcus faecium )的發酵產物]的飼料餵食給肉雞(broiler chicks)，繼而以堆型艾美球蟲的卵囊來進行口服攻毒(orally challenge)，並探討該以乳桿菌屬-為基礎的益生菌在被感染的肉雞的腸道免疫上的效用。實驗結果發現，該以乳桿菌屬-為基礎的益生菌對於被感染的肉雞的細胞免疫(cellular immunity)以及黏膜免疫(mucosal immunity)具有一正面的效應，而致使該等肉雞具有經增強的局部免疫防禦(improved local immune defense)可以來抵抗球蟲病(Dalloul R.A.et al. (2003),Poultry Science ,82：62-66；Dalloul R.A.et al. (2003),Avian Diseases ,47：1313-1320；Dalloul R.A.et al. (2005),Com.Immunol.Microbiol.Infect.Dis. ,28：351-361)。

另外，在弘光科技大學生物產業研究所的梁馨文所著碩士論文[名稱：“多重乳酸菌組合之免疫調節功能及其在生菌劑之應用(The immunomodulation activity and probiotic application for the multispecises combination of lactic acid bacteria)”]中，梁馨文從不同來源的乳酸菌菌株[包括購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)以及實驗室自行分離的菌株]中篩選出能夠刺激巨噬細胞產生大量的干擾素-γ(interferon-γ,IFN-γ)、TNF-α以及一氧化氮 (nitric oxide,NO)並且具有良好的抑菌效果以及腸道吸附能力的潛力菌株。接著，對這些潛力菌株進行不同的組合以配製含有不同乳酸菌菌株的混合物，然後將之餵食給小鼠歷時10週，繼而以鼠傷寒沙門桿菌(Salmonella typhimurium )來感染該等小鼠，藉此來探討該等混合物在提升該等小鼠之免疫力上的效用。而實驗結果顯示：一含有嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )LASW、糞腸球菌(Enterococcus faecium )TM39、發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum )LF33以及胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum )BCRC 10069的混合物具有提高腹膜巨噬細胞的吞噬能力，以及抑制鼠傷寒沙門桿菌侵入小鼠的脾臟與肝臟的效用。

經研究，申請人意外地發現該含有嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069的混合物除了具有免疫調節的效用之外，還能有效地保護雞隻抵抗球蟲的感染。因此，該含有4株乳酸菌菌株的混合物被預期可供用於預防和/或治療雞球蟲病。

發明概要

於是，本發明提供一種用於預防和/或治療雞球蟲病的藥學組成物，其包含有嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069，其中該嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39以及發酵乳桿菌LF33分別以寄存編號BCRC 910276、910248以及910554被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。

本發明亦提供一種用於治療一具有或被懷疑具有雞球蟲病的雞隻的方法，其包括對該雞隻投藥以一包含有嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069的混合物。

本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯。

發明的詳細說明

要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。

為了本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：術語“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及術語“包括(comprises)”具有一對應的意義。

除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。

在開發可用於預防和/或治療雞球蟲病的藥物上，申請人發現：一包含有4株乳酸菌菌株(包括嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069)的混合物具有這方面的產業應用潛力。於是，本發明揭示一包含有嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069的混合物供用於製備一用來預防和/或治療雞球蟲病之醫藥品的用途。

嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39以及發酵乳桿菌LF33已分別於西元2004年9月14日、西元2004年4月14日以及西元2012年6月26日以寄存編號BCRC 910276、BCRC 910248以及BCRC 910554被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)。

特別地，申請人經由活體內動物實驗(in vivo animal test)而證實：預先被餵食以本發明之包含有上述4株乳酸菌菌株的混合物的雞隻在被口服感染以盲腸型球蟲的卵囊之後，牠們的抗球蟲指數(anticoccidial index)相較於病理對照組雞隻所具者有顯著的升高，並且牠們的盲腸扁桃腺(cecal tonsil)中的促發炎細胞激素[包括介白素-1 β(interleukin-1 β,IL-1 β)、介白素-6(interleukin-6,IL-6)以及干擾素-γ]的基因表現位準有顯著的降低，而抗發炎細胞激素[包括介白素-10(interleukin-10,IL-10)]的基因表現位準有顯著的升高。這些實驗結果顯示：本發明之包含有上述4株乳酸菌菌株的混合物具有優越的抗雞球蟲病的效用。

因此，本發明提供一種用於預防和/或治療雞球蟲病的藥學組成物，其包含有嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069。

如本文中所使用的，“治療(treating)”或“治療(treatment)”意指減少(reducing)、減輕(alleviating)、改善(ameliorating)、緩解(relieving)、或控制(controlling)一疾病(disease)或障礙(disorder)的一或多個臨床徵兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆轉(reversing)一正在被治療中的病況(condition)或症狀(symptom)之嚴重性(severity)的進展(progression)。

依據本發明，該雞球蟲病是由一選自於下列所構成之群組中的艾美球蟲屬物種所引起：盲腸型球蟲、毒害艾美球蟲、堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、布氏艾美球蟲、和緩艾美球蟲、早熟艾美球蟲，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該雞球蟲病是由盲腸型球蟲所引起。

依據本發明，該藥學組成物具有一範圍落在10⁶ 至10⁹ CFU/mL內的細菌濃度。在本發明的一個較佳具體例中，該藥學組成物具有一範圍落在10⁸ 至10⁹ CFU/mL內的細菌濃度。

依據本發明，在該藥學組成物中，該嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069的相對比例(relative ratio)是1：1：1：1(v/v/v/v)。

依據本發明，該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥(oral administration)的劑型(dosage form)，這包括，但不限於：溶液(solution)、懸浮液(suspension)、粉末(powder)以及類似之物。

依據本發明的藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑。例如，該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、稀釋劑(diluent)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)、染色試劑(coloring agent)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。

此外，依據本發明的藥學組成物可使用一具有本技藝中的通常技術者所熟知的標準技術而被添加至雞隻的飼料(feed)或飲用水(drinking water)中。例如，依據本發明的藥學組成物可直接地被添加至雞隻的飼料內，或者它可被用於生成一或多種中間組成物(intermediate compositions)[諸如，飼料添加劑(feed additives)或預混料(premixes)]，該中間組成物隨後被添加至雞隻的飼料內。

依據本發明，投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化：要被治療的疾病之嚴重性，投藥途徑，以及要被治療的雞隻之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言，依據本發明的藥學組成物的每日投藥劑量通常是10⁷ CFU/kg體重至10⁹ CFU/kg體重，呈單一劑量或是分成數個劑量的形式，且可被口服地投藥。

依據本發明，該藥學組成物的投藥可被進行歷時整個飼養的時間期間，或者在飼養的時間期間中的一預定部分時被進行。較佳地，該藥學組成物的投藥是在雞隻出生之後被進行歷時3週，俾以獲得一高度的抗雞球蟲病的效用。

較佳實施例之詳細說明

本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。

實施例 一般實驗材料： 1.實驗動物：

在下面實施例中所使用的愛拔益加肉雞(Arbor Acres broiler chicks)(1天大，體重約40 g)是購自於台一農牧場(台中，后里)。所有的實驗動物被飼養於一個光照與黑暗各為12小時、室溫維持在28℃以及相對濕度維持在65%的籠子中，而且水分與飼料被充分地供給。有關實驗動物的處理以及一切實驗程序均依據台灣農委會實驗動物管理委員會準則(guidelines of Animal Care Committee of the Council of Agriculture,Taiwan)來進行。

2.製備本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物(a mixture of four lactic acid bacteria strains)：

在下面實施例中所使用的嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus )LASW、糞腸球菌(Enterococcus faecium )TM39以及發酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum )LF33已分別於西元2004年9月14日、西元2004年4月14日以及西元2012年6月26日以寄存編號BCRC 910276、BCRC 910248以及BCRC 910554被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Biosource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)，而胚芽乳桿菌(Lactobacillus plantarum )BCRC 10069是購自於台灣的食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。

首先，將嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069分別接種至MRS肉湯培養基(MRS Broth)(Difco,USA)中，並於一恆溫震盪培養箱(37℃)內進行培養過夜。之後，各個乳酸菌培養物分別在4℃下以10,000g進行離心歷時5分鐘，接著倒除上澄液，而沉澱物(pellets)以適量的無菌水予以洗滌共計2次，然後以適量之磷酸鹽緩衝的生理鹽水(phosphate buffered saline,PBS)予以散浮並調整至一為10⁹ CFU/mL(以平板計數培養基來進行菌數計數)的濃度。接著，將所得到的各個嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069的菌液以一為1：1：1：1(v/v/v/v)的比例予以混合均勻，而得到一具有一細菌濃度為10⁹ CFU/mL之含有4株乳酸菌菌株(它們皆具有相同的細菌濃度)的混合物來供隨後的實驗之用。

實施例1. 本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物(mixture of four lactic acid bacteria strains)在抗雞球蟲病(anti-chicken coccidiosis)上的效用評估

為了探討依據本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物在活體內(in vivo )是否具有抗雞球蟲病效用(anti-chicken coccidiosis effect)，申請人參照De Pablos L.M.et al .(2010),Parasitol Res .,107：601-604當中所述的方法來進行抗球蟲指數的評估，並略作修改。

首先，將雞隻隨機地分成1個實驗組、1個病理對照組以及1個正常對照組(每組n=10)，其中實驗組以及正常對照組的雞隻被口服投藥以200μL之在上面“一般實驗材料”的第2項「製備本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物」當中所製得的含有4株乳酸菌菌株的混合物，而病理對照組的雞隻被口服投藥以無菌水。各組雞隻每天被投藥一次，投藥時間總共歷時23天。

在投藥開始之後的第14天之時，紀錄各組存活雞隻的數目，而存活率(survival rate)是藉由將存活的雞隻數目代入下列公式(1)而被計算出：公式(1)：A=B/10×100%

其中：A=存活率(%)

B=各組存活的雞隻數

所得到的結果顯示，各組雞隻的存活率皆為100%。之後，測量各組雞隻的體重(每組n=10)，並計算出各組雞隻的平均體重。接著，對各組雞隻進行上述的菌株投藥，然後實驗組以及病理對照組的雞隻分別被口服感染以5,000顆盲腸型球蟲的卵囊(oocyst)(由屏東科技大學獸醫學系連一洋教授所提供)，俾以誘發該等雞隻產生雞球蟲病(chicken coccidiosis)，而正常對照組的雞隻則不作任何處理。

在投藥開始之後的第21天，紀錄各組存活雞隻的數目並依據上面公式(1)來計算出存活率，而所得到的結果顯示，各組雞隻的存活率皆為100%。接著，測量各組雞隻的體重(每組n=10)，並計算出各組雞隻的平均體重。相對增重率(rate of relative weight gain)是藉由將投藥開始之後的第14天與第21天所測得的平均體重(g)代入下列公式(2)而被計算出：公式(2)：C=(E-D)/(G-F)×100%

其中：C=相對增重率(%)

D=各組雞隻在投藥開始之後的第14天所測得的平均體重(g)

E=各組雞隻在投藥開始之後的第21天所測得的平均體重(g)

F=正常對照組雞隻在投藥開始之後的第14天所測得的平均體重(g)

G=正常對照組雞隻在投藥開始之後的第21天所測得的平均體重(g)

所得到的實驗結果被顯示於下面的表1中。

接著，從各組雞隻中分別隨機桃選5隻雞隻並且以異氟烷(isoflurane)(商品名稱為活寧液)來犧牲該等雞隻，繼而分別取出盲腸(cecum)與盲腸扁桃腺(cecal tonsil)，其中盲腸被拿來進行下面的病變計分值(lesion score)的評估，而盲腸扁桃腺被拿來進行下面實施例2的分析。

有關病變計分值的評估大體上是參照Sung-Hyen Leeet al. (2010),Vaccine ,28：6498-6504當中所述的方法來進行。簡言之，由屏東科技大學獸醫系的學生以目測的方式來觀察盲腸的病變嚴重性(lesion severity)，並以下列5種數值等級(numerical scale)來作為區別的依據：計分0分，表示正常；計分1分，表示盲腸壁出現點狀出血(spotting)，但是盲腸壁沒有增厚(thickening)；計分2分，表示盲腸的內容物中含有血液，並且盲腸壁稍有增厚；計分3分，表示盲腸壁明顯增厚，並且盲腸的內容物中含有血凝塊(blood clot)；以及計分4分，表示盲腸壁腫大，並且盲腸的內容物中充滿血凝塊或灰白色乾酪狀物(off-white caseous matter)。接著，將各組的每隻雞隻的病變計分值相加，藉此而得到各組的總病變計分值。之後，病變指數(lesion index)是藉由將總病變計分值代入下列公式(3)而被計算出：公式(3)：H=I×10/5

其中：H=病變指數

I=各組的總病變計分值

所得到的實驗結果被顯示於下面的表2中。

此外，各組剩餘存活的雞隻(每組n=5)的糞便被收集，繼而予以充分攪拌，接著從各組的糞便混合物中各取10 g並分別與290 mL的水混合均勻以形成一糞便懸浮液。接著，對各組的糞便混合物各取0.1 mL並分別置於一血球計數盤(hemocytometer)上，然後使用一倒立顯微鏡(inverted microscope)(Nikon)並在一為400X的放大倍數下來進行卵囊的計數，藉此可得到各組雞隻的卵囊數目，並進一步計算出各組雞隻的平均卵囊數目。此外，在投藥開始之後的第22天與第23天之時，亦參照上述方法來分別對各組剩餘存活的雞隻(每組n=5)進行卵囊數目的計數並獲得各組的平均卵囊數目。接著，將各組在投藥開始之後的第21天至第23天中所分別測得的平均卵囊數目進行加總，並進一步計算出各組雞隻的平均每日的卵囊數目。之後，卵囊指數(oocyst index)是藉由將所測得的平均每日的卵囊數目代入下列公式(4)而被計算出：公式(4)：J=K/L×40

其中：J=卵囊指數

K=各組雞隻的平均每日的卵囊數目

L=病理對照組雞隻的平均每日的卵囊數目

所得到的實驗結果被顯示於下面的表3中。

最後，抗球蟲指數是藉由將上面針對各組雞隻所測得的相對增重率、病變指數、卵囊指數(參見上面表1至3)以及在投藥開始之後的第21天時所測得的存活率代入下列公式(5)而被計算出：公式(5)：M=(A+C)×100-(H+J)

其中：M=抗球蟲指數

A=存活率(%)

C=相對增重率(%)

H=病變指數

J=卵囊指數

所得到的實驗結果被顯示於下面的表4中。

從表4可見，與正常對照組雞隻相較之下，病理對照組雞隻的抗球蟲指數有顯著的下降，這表示盲腸型球蟲的卵囊成功地誘發雞隻產生雞球蟲病。另外，與病理對照組雞隻相較之下，實驗組雞隻的抗球蟲指數有顯著的升高，甚至接近正常對照組雞隻所具者。這個實驗結果顯示：依據本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物具有抗雞球蟲病的效用。

實施例2. 本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物對於雞球蟲病所導致的促發炎細胞激素以及抗發炎細胞激素的表現量之影響

在本實施例中，申請人以量測雞隻的盲腸扁桃腺中的介白素-1 β(interleukin-1 β,IL-1 β)、介白素-6(interleukin-6,IL-6)、干擾素-γ以及介白素-10(interleukin-10,IL-10)的基因表現位準來評估依據本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物對於雞球蟲病所導致的促發炎細胞激素以及抗發炎細胞激素的表現量之影響。

實驗方法：

依據上面實施例1，在投藥開始之後的第21天之時，從各組被犧牲的雞隻中取出盲腸扁桃腺並且藉由使用Precellys 24樣品均質機(Bertin Technologies)來進行均質處理歷時5分鐘，繼而對所形成的均質物(homogenate)各取0.1 g並且使用PureLink^TM RNA Mini Kit(Invitrogen)來進行總RNAs(total RNAs)的萃取。由此所得到的各組的總RNAs分別被拿來進行下面定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)。

有關第一股cDNA(first-strand cDNA)的合成是使用SuperScript^TM III第一股合成系統並且依據廠商所提供的操作指引來進行。簡言之，取1 μg的總RNAs並加入1 μL寡(dT)引子[oligo(dT)primer]以及1 μL的10 mM dNTP，接著加入焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)水將體積補足至10 μL並予以混合均勻。然後，將所形成的混合物置於一PCR機器(ABI 2720)中，並於65℃下作用歷時5分鐘，繼而轉移至冰上靜置歷時1分鐘。接著，加入10 μL的cDNA Synthesis Mix[含有1 μL的SuperScript^TM III反轉錄酶(200 U/μL)、2 μL的10X反轉錄酶緩衝液、4 μL的25 mM MgCl₂ 、2 μL的0.1 M DTT以及1 μL的RNaseOUT^TM (40 U/μL)]，然後置於PCR機器中，並於50℃下進行反轉錄反應歷時50分鐘，最後，於85℃下作用歷時5分鐘以終止酵素反應，藉此而得到第一股cDNA。

以所得到的第一股cDNA作為模版，並分別使用針對IL-1 β、IL-6、IFN-γ以及IL-10基因所設計出的專一性引子對來進行qRT-PCR，而有關該等引子對的相關資訊(包括：核苷酸序列、所擴增出的PCR產物大小、對應於標的基因的所在位置等)已被整合於下面表5中。另外，甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的基因被使用作為內部對照組(internal control)。qRT-PCR是於一個SYBR系統(ABI 7500)中被執行。有關qRT-PCR的操作是依據廠商提供的操作指引來進行，而反應條件被顯示於下面的表6中。

由此所得到的PCR擴增產物(PCR amplification product)藉由SYBR Green螢光染料(雙股DNA結合染料)來進行偵測，而分別得到各個基因的循環閾值[cycle threshold(C _t )value]。相對的mRNA表現位準(relative mRNA expression level)是從各個PCR擴增產物的循環閾值被計算出，並且使用比較性C _t 方法(comparativeC _t method)(K.J.Livak and T.D.Schmittgen(2001),Methods ,25：402-408)而以GAPDH基因的循環閾值來予以標準化。接著，實驗組與病理對照組的mRNA表現位準相對於正常對照組所具者的倍數被計算出。

所得到的實驗數據是以SPSS 17.0軟體來進行統計分析。所有的數據是藉由單因子變異數分析(one-way ANOVA)，繼之以鄧肯氏多變域檢定(Duncan's multiple range test)來進行分析，俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是p <0.05，代表有統計學顯著性(statistical significance)。

結果：

圖1至圖4分別顯示在投藥開始之後的第21天，病理對照組以及實驗組的雞隻的盲腸扁桃腺藉由qRT-PCR而被測得的IL-1 β、IL-6、IFN-γ以及IL-10的mRNA表現位準(相對於正常對照組的倍數)。從圖1至圖3可見，與病理對照組雞隻相較之下，在實驗組雞隻的盲腸扁桃腺中所測得的IL-1 β、IL-6以及IFN-γ的mRNA表現位準皆有顯著的降低。從圖4可見，與病理對照組雞隻相較之下，在實驗組雞隻的盲腸扁桃腺中所測得的IL-10的mRNA表現位準有顯著的升高。這個實驗結果顯示：依據本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物可以在被感染以盲腸型球蟲的雞隻體內有效地抑制促發炎細胞激素的表現並增高抗發炎細胞激素的表現，因而具有明顯的抗發炎效用。

綜合以上的實驗結果，申請人認為：依據本發明之含有4株乳酸菌菌株的混合物可供用於預防和/或治療雞球蟲病。

於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。

雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。

圖1顯示在投藥開始之後的第21天，病理對照組以及實驗組的雞隻的盲腸扁桃腺藉由qRT-PCR而被測得的IL-1 β的mRNA表現位準(相對於正常對照組的倍數)，其中“＊”表示：當與病理對照組比較，p <0.05；圖2顯示在投藥開始之後的第21天，病理對照組以及實驗組的雞隻的盲腸扁桃腺藉由qRT-PCR而被測得的IL-6的mRNA表現位準(相對於正常對照組的倍數)，其中“＊”表示：當與病理對照組比較，p <0.05；圖3顯示在投藥開始之後的第21天，病理對照組以及實驗組的雞隻的盲腸扁桃腺藉由qRT-PCR而被測得的IFN-γ的mRNA表現位準(相對於正常對照組的倍數)，其中“＊”表示：當與病理對照組比較，p <0.05；以及圖4顯示在投藥開始之後的第21天，病理對照組以及實驗組的雞隻的盲腸扁桃腺藉由qRT-PCR而被測得的IL-10的mRNA表現位準(相對於正常對照組的倍數)，其中“＊”表示：當與病理對照組比較，p <0.05。

<110> 弘光科技大學

<120> 使用包含有4株乳酸菌菌株的混合物來預防和/或治療雞球蟲病

<130> 包含有4株乳酸菌菌株的混合物

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IL-1基因的前向引子IL-1F

<400> 1

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IL-1基因的反向引子IL-1R

<400> 2

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IL-6基因的前向引子IL-6F

<400> 3

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IL-6基因的反向引子IL-6R

<400> 4

<210> 5

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IFN-γ基因的前向引子IFN-F

<400> 5

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IFN-γ基因的反向引子IFN-R

<400> 6

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IL-10基因的前向引子IL-10F

<400> 7

<210> 8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的IL-10基因的反向引子IL-10R

<400> 8

<210> 9

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的GAPDH基因的前向引子GAPDH-F

<400> 9

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工的序列

<220>

<223> 用於即時PCR的GAPDH基因的反向引子GAPDH-R

<400> 10

Claims

一種用於預防和/或治療雞球蟲病的藥學組成物，其包含有嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069，其中該嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39以及發酵乳桿菌LF33分別以BCRC 910276、910248以及910554被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
如申請專利範圍第1項的藥學組成物，其中該雞球蟲病是由一選自於下列所構成之群組中的艾美球蟲屬物種所引起：盲腸型球蟲、毒害艾美球蟲、堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、布氏艾美球蟲、和緩艾美球蟲、早熟艾美球蟲，以及它們的組合。
如申請專利範圍第2項的藥學組成物，其中該雞球蟲病是由盲腸型球蟲所引起。
如申請專利範圍第1項的藥學組成物，其進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
如申請專利範圍第4項的藥學組成物，其中該藥學上可接受的載劑包含一或多種選自於由下列所構成之群組中的試劑：溶劑、緩衝液、乳化劑、懸浮劑、分解劑、崩解劑、分散劑、黏結劑、賦形劑、安定劑、螯合劑、防腐劑、潤濕劑、潤滑劑、稀釋劑、吸收延遲劑、脂質體以及染色試劑。
如申請專利範圍第1項的藥學組成物，它是呈一供口服投藥的劑型。
如申請專利範圍第6項的藥學組成物，其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液以及粉末。
一種包含有嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39、發酵乳桿菌LF33以及胚芽乳桿菌BCRC 10069的混合物供用於製備一用來預防和/或治療雞球蟲病之醫藥品的用途，其中該嗜酸乳桿菌LASW、糞腸球菌TM39以及發酵乳桿菌LF33分別以寄存編號BCRC 910276、910248以及910554被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心。
如申請專利範圍第8項的用途，其中該雞球蟲病是由一選自於下列所構成之群組中的艾美球蟲屬物種所引起：盲腸型球蟲、毒害艾美球蟲、堆型艾美球蟲、巨型艾美球蟲、布氏艾美球蟲、和緩艾美球蟲、早熟艾美球蟲，以及它們的組合。
如申請專利範圍第9項的用途，其中該雞球蟲病是由盲腸型球蟲所引起。
如申請專利範圍第8項的用途，其中該醫藥品是呈一供口服投藥的劑型。
如申請專利範圍第11項的用途，其中該劑型是選自於下列所構成的群組：溶液、懸浮液以及粉末。
一種動物飼料，其包含有一如申請專利範圍第1項的藥學組成物。