TW202325835A - 使用乳酸菌菌株組合來提升腸胃道屏障功能 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示一種乳酸菌菌株組合可被用於提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病,以及抑制腸胃道病原菌生長,其中該乳酸菌菌株組合包含有呈一範圍落在1:0.2:0.67至1:9:9內之菌數比的鼠李糖乳桿菌MP108 (CGMCC No.21225)、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02 (BCRC 910812)以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115 (BCRC 911045)。
Description
本發明是有關於使用乳酸菌菌株組合來提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病,以及抑制腸胃道病原菌生長。
腸胃道屏障(gastrointestinal barrier)是由緊密連接蛋白(tight junction proteins)(特別是claudins)連結的腸胃道上皮細胞(gastrointestinal epithelial cells)所組成,能夠隔絕腸胃道病原菌(gastrointestinal pathogenic bacteria)及其分泌物的進入。然而,腸胃道屏障功能亦容易會受到腸胃道病原菌的影響,例如,當腸胃道菌叢失調(gastrointestinal dysbiosis)而腸胃道病原菌大量增生時,腸胃道病原菌可藉由向下調節緊密連接蛋白的表現來損害腸胃道上皮的結構與功能,並異常提高腸胃道的通透性而有利於入侵宿主,進而引起一系列相關疾病[亦即腸胃道屏障功能異常相關疾病(gastrointestinal barrier dysfunction-related diseases)],例如,發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease, IBD)[諸如,潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)與克隆氏症(Crohn's disease)]以及大腸激躁症(irritable bowel syndrome, IBS)。
目前大多使用抗生素來對抗腸胃道病原菌並改善腸胃道屏障功能異常相關疾病,然而,抗生素會使得腸胃道病原菌產生抗生素耐性(antibiotic resistance),並且會導致嚴重副作用(side effect)與不良反應(adverse effect)。因此,本領域的相關研究人員皆致力於開發可以有效地提升腸胃道屏障功能和/或對抗腸胃道病原菌並且不會產生非所欲的副作用的藥物。
乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)是屬於一般被公認為安全的(generally recognized as safe, GRAS)並且是為人所熟悉與廣泛使用的益生菌(probiotics)。常見的乳酸菌包括:乳桿菌屬(
Lactobacillus)、乳球菌屬(
Lactococcus)、小球菌屬(
Pediococcus)、腸球菌屬(
Enterococcus)、鏈球菌屬(
Streptococcus)、雙歧桿菌屬(
Bifidobacterium)、芽孢桿菌屬(
Bacillus)以及明串珠菌屬(
Leuconostoc)等。
目前已有研究在探討乳酸菌菌株在腸胃道屏障功能上的相關應用。例如,在D.M. Commane
et al.(2005),
Nutrition and Cancer, 51(1):102中,D.M. Commane等人測試了數種益生菌對於帶有去氧膽酸(deoxycholic acid, DCA)-誘發的腸道上皮屏障損傷的人類結腸腺癌細胞株(human colon adenocarcinoma cell line) Caco-2之影響,並藉由對Caco-2的細胞單層(monolayer)進行跨上皮電阻(transepithelial electrical resistance, TEER)的測定而發現到,動物雙歧桿菌乳亞種(
Bifidobacterium animalissubsp.
lactis) BB-12在提升Caco-2細胞單層的TEER上具有最佳的效用,而被預期能夠改善腸胃道上皮與緊密連接蛋白的完整性以及功能,以達致預防和/或改善腸胃道上皮屏障功能損傷的功效。
另外,在X. Han
et al.(2019),
Gut Microbes., 10(1):59–76中,X. Han等人測試了鼠李糖乳桿菌(
Lactobacillus rhamnosus) GG (LGG)的預處理對於IFN-γ誘發的腸道上皮屏障損傷(IFN-γ induced epithelial barrier damage)之影響,而實驗結果發現,鼠李糖乳桿菌GG能夠有效地改善人類腸道上皮培養物的細胞通透性,並恢復緊密連接蛋白的表現。據此,鼠李糖乳桿菌GG被認為能夠預防腸胃道屏障功能異常。
雖然已存在有上述文獻報導,本技藝中仍然存在有一需要去篩選出可以有效提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病並且抑制腸胃道病原菌生長的乳酸菌以供產業界之用。
發明概要
於本發明中,申請人經實驗而發現到,以特定的比例範圍(亦即1:0.2:0.67至1:9:9)來組合使用鼠李糖乳桿菌(
Lactobacillus rhamnosus) MP108 (CGMCC No.21225)、長雙歧桿菌嬰兒亞種(
Bifidobacterium longumsubsp.
infantis) BLI-02 (BCRC 910812)以及動物雙歧桿菌乳亞種(
Bifidobacterium animalissubsp.
lactis) BB-115 (BCRC 911045)能夠協同地提升腸胃道屏障功能(gastrointestinal barrier function),並有效地促進腸胃道細胞吸附能力且抑制腸胃道病原菌生長,而被預期可供應用於改善腸胃道屏障功能異常相關疾病。
於是,在第一個方面,本發明提供一種乳酸菌菌株組合供應用於製備一用來提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病之組成物的用途,其中該乳酸菌菌株組合包含有呈一範圍落在1:0.2:0.67至1:9:9內之菌數比的鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115。較佳地,鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115的菌數比是落在1:0.67:0.67至1:1.5:1.5的範圍內。
在第二個方面,本發明提供一種用來提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病的方法,其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的乳酸菌菌株組合。
在第三個方面,本發明提供一如上所述的乳酸菌菌株組合供應用於製備一用來抑制腸胃道病原菌生長之組成物的用途。
在第四個方面,本發明提供一種用來抑制腸胃道病原菌生長的方法,其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的的乳酸菌菌株組合。
發明的詳細說明
要被瞭解的是:若有任何一件前案刊物在此被引述,該前案刊物不構成一個下述承認:在台灣或任何其他國家之中,該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的,將被清楚地瞭解的是:文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”,以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義,在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料,它們可被用於實施本發明。當然,本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。
本發明提供一種乳酸菌菌株組合供應用於製備一用來提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病之組成物的用途,其中該乳酸菌菌株組合包含有呈一範圍落在1:0.2:0.67至1:9:9內之菌數比的鼠李糖乳桿菌(
Lactobacillus rhamnosus) MP108 (CGMCC No.21225)、長雙歧桿菌嬰兒亞種(
Bifidobacterium longumsubsp.
infantis) BLI-02 (BCRC 910812)以及動物雙歧桿菌乳亞種(
Bifidobacterium animalissubsp.
lactis) BB-115 (BCRC 911045)。
較佳地,該菌數比是落在1:0.67:0.67至1:1.5:1.5的範圍內。在本發明的一個較佳具體例中,該菌數比為1:0.67:1。在本發明的另一個較佳具體例中,該菌數比為1:1:1。
依據本發明,術語“腸胃道屏障功能(gastrointestinal barrier function)”與“腸胃道上皮屏障功能(gastrointestinal epithelial barrier function)”可被交替地使用。較佳地,該腸胃道屏障功能是腸道屏障功能(intestinal barrier function)。
依據本發明,該腸胃道屏障功能的提升包括下列至少一者:改善腸胃道上皮結構與功能、對抗腸胃道病原菌感染、促進益生菌定殖,以及調節腸胃道菌相。
依據本發明,該腸胃道屏障功能異常相關疾病可包括,但不限於:腹瀉(diarrhea)[例如,旅行者腹瀉(traveler’s diarrhea, TD)與滲透性腹瀉(osmotic diarrhea)]、腸胃炎(gastroenteritis)[例如,腸炎(enteritis)與病毒性腸胃炎(viral gastroenteritis)]、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease, IBD)[例如,潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)與克隆氏症(Crohn's disease)]、大腸激躁症(irritable bowel syndrome, IBS)、傷寒熱(typhoid fever)、短腸症候群(short bowel syndrome, SBS),以及小腸細菌過度生長(small intestine bacterial overgrowth, SIBO)。
依據本發明,該乳酸菌菌株組合可具有大約10
7至10
12CFU/mL的細菌濃度,較佳地,10
8至10
10CFU/mL。在本發明的一個較佳具體例中,該乳酸菌菌株組合的細菌濃度為大約10
9CFU/mL。
依據本發明,鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115可以是活菌或死菌、經濃縮的(concentrated)或未經濃縮的(non-concentrated)、液態(liquid)、糊狀(paste)、半固態(semi-solid),或固態(solid)[例如,丸(pellet)、細顆粒(granule)或粉末(powder)],並且可以是經熱去活的(heat-inactivated)、經冷凍的(frozen)、經乾燥的(dried),或經冷凍-乾燥的(freeze-dried)[例如,可呈冷凍乾燥形式或噴霧/流化床乾燥(spray/fluid bed dried)形式]。
本發明亦提供一如上所述的乳酸菌菌株組合供應用於製備一用來抑制腸胃道病原菌生長之組成物的用途。
依據本發明,該腸胃道病原菌是選自於由下列所構成的群組:腸道沙門氏菌腸道亞種(
Salmonella entericasubsp.
enterica)、李斯特單胞菌(
Listeria monocytogenes)、大腸桿菌(
Escherichia coli)、腸炎弧菌
(Vibrio parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌(
Staphylococcus aureus)、痢疾桿菌(
Shigella boydii)、痢疾志賀桿菌(
Shigella dysenteriae)、克雷伯氏肺炎桿菌(
Klebsiella pneumoniae)、小腸大腸炎耶氏桿菌(
Yersinia enterocolitica)、普通變形桿菌(
Proteus vulgaris),以及它們的組合。較佳地,該腸胃道病原菌是腸道沙門氏菌腸道亞種、李斯特單胞菌、大腸桿菌以及腸炎弧菌。
如本文中所使用的,術語“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”意指防止或減緩腸胃道病原菌在一個體中生長。
依據本發明,該組成物可以是食品組成物(food composition),例如,呈一食品添加物(food additive)的形式,其可以被添加至一可食性材料(edible material)中以製備一供人類或動物食用的食品產品。依據本發明,該食物產品的種類可包括,但不限於:奶粉(milk powder)、發酵乳(fermented milk)、優格(yogurt)、乳酪(butter)、飲料(beverages)(例如,茶、咖啡)、機能性飲料(functional beverages)、麵製品(flour product)、烘焙食品(baked foods)、甜點(confectionery)、糖果(candies)、發酵食品(fermented foods)、動物飼料(animal feeds)、保健食品(health foods)、嬰兒食品(infant food),以及膳食補充品(dietary supplements)。
依據本發明,該組成物可以是藥學組成物(pharmaceutical composition)。
依據本發明,該藥學組成物可呈一適合於口服投藥(oral administration)、局部投藥(topical administration)或非經腸道投藥(parenteral administration)之劑型(dosage form)。
依據本發明,該藥學組成物可進一步包含有一被廣泛地使用於藥物製造技術之藥學上可接受的載劑(pharmaceutically acceptable carrier)。例如,該藥學上可接受的載劑可包含一或多種選自於下列的試劑:溶劑(solvent)、緩衝液(buffer)、乳化劑(emulsifier)、懸浮劑(suspending agent)、分解劑(decomposer)、崩解劑(disintegrating agent)、分散劑(dispersing agent)、黏結劑(binding agent)、賦形劑(excipient)、安定劑(stabilizing agent)、螯合劑(chelating agent)、稀釋劑(diluent)、膠凝劑(gelling agent)、防腐劑(preservative)、潤濕劑(wetting agent)、潤滑劑(lubricant)、吸收延遲劑(absorption delaying agent)、脂質體(liposome)以及類似之物。有關這些試劑的選用與數量是落在熟習此項技術之人士的專業素養與例行技術範疇內。
依據本發明,該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於口服投藥的劑型,這包括,但不限於:無菌的粉末、錠劑(tablet)、片劑(troche)、口含錠(lozenge)、丸劑(pellet)、膠囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或細顆粒(granule)、溶液、懸浮液(suspension)、乳劑(emulsion)、糖漿(syrup)、酏劑(elixir)、濃漿(slurry)以及類似之物。
依據本發明,該藥學組成物可利用熟習此技藝者所詳知的技術而被製造成一適合於非經腸道途徑投藥的劑型[包括注射品(injection),例如,無菌的水性溶液(sterile aqueous solution)或分散液(dispersion)],且以一選自於由下列所構成的群組中的途徑來投藥:腹膜內注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮內注射(intradermal injection)以及舌下投藥(sublingual administration)。
此外,本發明亦提供一種用來提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病的方法,其包括對一有此需要的個體投予(administering)一如上所述的乳酸菌菌株組合。本發明亦提供一種用來抑制腸胃道病原菌生長的方法,其包括對一有此需要的個體投予一如上所述的乳酸菌菌株組合。
如本文中所使用的,術語“投予”以及“投藥(administration)”可被交換地使用,並且意指藉由任何合適的途徑來對一個體導入(introducing)、提供(providing)或遞送(delivering)一預定的活性成分以執行其預期的效用。
如本文中所使用的,術語“個體(subject)”意指任何感興趣的哺乳類動物,諸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、綿羊(sheep)、馬(horses)、豬(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、貓(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依據本發明,該乳酸菌菌株組合的投藥劑量與投藥次數會視下列因素而變化:要被改善的疾病之嚴重性,投藥途徑,以及要被改善的個體之體重、年齡、身體狀況與反應。一般而言,該乳酸菌菌株組合可呈單一劑量或是分成數個劑量的形式而被口服地、局部地或非經腸道地投藥。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明,但應瞭解的是,該等實施例僅是供例示說明用,而不應被解釋為本發明的實施上的限制。
實施例 一般實驗材料: 1. 乳酸菌菌株:
在下面實施例中拿來進行功效評估的乳酸菌菌株已被寄存於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號,台灣);和/或依據布達佩斯條約(the Budapest Treaty)的規定被寄存於中國普通微生物菌種保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)。為表清楚,各個乳酸菌菌株的相關資訊(包括:學名、相關出處、寄存編號以及寄存日期)已被整合於下面表1中。
表1. 各個乳酸菌菌株的相關資訊
註:鼠李糖乳桿菌MP108以及長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02皆已可自由分讓。
菌株 | 相關出處 | 寄存編號 | 寄存日期 |
鼠李糖乳桿菌( Lactobacillus rhamnosus) MP108 | CN 102604854 B | CGMCC No.21225 | 2020/11/23 |
長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp. infantis) BLI-02 | TW I701034 B | BCRC 910812 | 2018/01/18 |
CGMCC No.15212 | 2018/01/15 | ||
動物雙歧桿菌乳亞種 ( Bifidobacterium animalissubsp. lactis) BB-115 | 左繼東等人,(2017),中國當代醫藥,第24卷第5期 | BCRC 911045 | 2021/03/25 |
CGMCC No.21840 | 2021/02/26 |
為供比較,亦有使用下列習知具有保護腸胃道效用的市售乳酸菌菌株:購自於科漢森股份有限公司(Chr. Hansen A/S, Denmark)的動物雙歧桿菌乳亞種BB-12以及鼠李糖乳桿菌GG (LGG)。
2. 腸胃道病原菌菌株(gastrointestinal pathogenic bacteria strains):
在下面實施例中所使用的腸胃道病原菌菌株皆是購自於FIRDI的BCRC。為表清楚,各個腸胃道病原菌菌株的學名與寄存編號)已被整合於下面表2中,而它們所適用的培養基與培養條件是如下面表3所示。
表2. 各個腸胃道病原菌菌株的相關資訊
表3. 各個腸胃道病原菌株的培養基與培養條件
3. 人類結腸腺癌細胞株(human colon adenocarcinoma cell line) Caco-2的來源與培養:
菌株 | 寄存編號 |
腸道沙門氏菌腸道亞種( Salmonella entericasubsp. enterica) | BCRC 10747 |
李斯特單胞菌( Listeria monocytogenes) | BCRC 14845 |
大腸桿菌( Escherichia coli) | BCRC 11634 |
腸炎弧菌( Vibrio parahaemolyticus) | BCRC 12974 |
菌株 | 培養基 | 培養條件 |
腸道沙門氏菌腸道亞種 | 營養肉湯培養基(nutrient broth, NB)(BD Bioscience, Cat. No. 234000) | 37℃,5% CO 2 |
大腸桿菌 | NB培養基(同上述) | 37℃,5% CO 2 |
李斯特單胞菌 | 腦心浸液(BHI)培養基[brain heart infusion (BHI) medium](BD Bioscience, Cat. No. R452472) | 37℃,5% CO 2 |
腸炎弧菌 | 添加有2.5%氯化鈉(Sigma, Cat. No. S5886)的胰蛋白酶大豆肉湯培養基(tryptic soy broth, TSB)(BD Bioscience, Cat. No. R112996) | 25℃,5% CO 2 |
在下面實施例中所使用的人類結腸腺癌細胞株Caco-2 (ATCC
®HTB-37™)是購自於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)。Caco-2細胞被培養於含有杜貝可氏改良的依格氏培養基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, DMEM)(Cytiva)[添加有10%胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)以及1%盤尼西林-鏈黴素(penicillin-streptomycin)]的10 cm培養皿(Petri dish)中,並在培養條件被設定為37℃、5% CO
2的培養箱中進行培養。之後,大約每隔2-3天更換新鮮的培養基。當細胞密度達到約80-90%匯聚(confluence)時,進行繼代培養(subculture)。
4. 乳酸菌菌株的菌液製備:
首先,將上面第1項當中所述的乳酸菌菌株分別接種至補充有0.05%半胱胺酸(cysteine)的MRS肉湯培養基(MRS broth)(Difco, Cat. No. 288130)中,並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養歷時24小時,俾以活化該等乳酸菌菌株。接著,將經活化的菌株分別以一為2% (v/v)的接種量接種至MRS肉湯培養基中,並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養歷時24小時。之後,將所形成的培養物以3,000 rpm來進行離心歷時10分鐘,接著去除上澄液,而沉澱物(pellets)以適量的MRS肉湯培養基來予以散浮並將各個乳酸菌菌株調整成具有一約為10
9CFU/mL的細菌濃度(以平板計數培養基來進行菌數計數),藉此而分別得到各個乳酸菌菌株的菌液。
實施例 1. 乳酸菌菌株在提升 腸胃道 屏障功能 ( gastrointestinal barrier function) 上的效用評估 A. 腸道細胞緊密連接蛋白 ( tight junctions protein) claudins 的表現量分析 實驗方法: (i) 以乳酸菌菌株的菌液處理人類結腸腺癌細胞 Caco-2 細胞:
將依據上面“一般實驗材料”的第3項來進行繼代培養的Caco-2細胞分為1個對照組、5個單菌組(亦即,單菌組R、L、A、R’與A’)、3個二菌組(亦即,單菌組LA、RA與RL),以及8個三菌組(亦即,三菌組1至8)。將各組細胞以一為3×10
5細胞/井的數量分別培養於含有3 mL的DMEM培養基(添加有10% FBS以及1%盤尼西林-鏈黴素)的6-井培養盤的各井中,並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養歷時11天,期間每3天更換一次培養基。
接著,移除各井中的培養基,將上面“一般實驗材料”的第4項中所得到的各個乳酸菌菌株的菌液依據下面表4所示而添加至各個單菌組的細胞培養物中,以及將鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115的菌液依據下面表5所示的比例來予以混合,繼而將所得到的混合菌液(細菌濃度為10
9CFU/mL)分別添加至對應的各個二菌組與三菌組的細胞培養物中,至於對照組則被添加以不含有任何乳酸菌菌液的DMEM培養基,繼而在培養箱(37℃、5% CO
2)中予以進行共培養歷時6小時。接著,將所得到的細胞培養物拿來進行下面第(ii)項的分析。
表4. 各個單菌組所處理的乳酸菌菌株
表5. 各個二菌組與三菌組所處理的乳酸菌菌株的菌數比
(ii) CLDN1 基因的 mRNA 位準的測定:
組別 | 鼠李糖乳桿菌 | 長雙歧桿菌嬰兒亞種 | 動物雙歧桿菌乳亞種 |
單菌組R | MP108 | - | - |
單菌組L | - | BLI-02 | - |
單菌組A | - | - | BB-115 |
單菌組R’ | LGG | - | - |
單菌組A’ | - | - | BB-12 |
組別 | MP108:BLI-02:BB-115 |
二菌組LA | 0:1:1 |
二菌組RA | 1:0:1 |
二菌組RL | 1:1:0 |
三菌組1 | 1:0.11:1 |
三菌組2 | 1:0.2:1 |
三菌組3 | 1:0.67:1 |
三菌組4 | 1:1:0.67 |
三菌組5 | 1:1:1 |
三菌組6 | 1:1.5:1.5 |
三菌組7 | 1:5:5 |
三菌組8 | 1:9:9 |
首先,使用一總RNA微量萃取系統套組(Total RNA Extraction Miniprep System)(VIOGENE, Cat. No. GR1001)並依據製造商所提供的操作指引來進行各組細胞培養物的總RNAs (total RNAs)的萃取。由此所得到的各組的總RNAs分別以cDNA反轉錄試劑(GoScript™ Reverse Transcriptase, Promega, Cat. No. A5003)並且依據製造商所提供的操作指引來進行反轉錄反應(reverse transcription reaction),以合成第一股cDNA (first-strand cDNA)。
接著,以所得到的第一股cDNA作為模板(template),並參考Y. Jin and A.T. Blikslager, (2016),
Am. J. Physiol. Cell Physiol.311(6):C996-C1004而使用針對CLDN1基因所設計的專一性引子對(specific primer pair)來進行定量即時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,以下簡稱定量即時PCR)。另外,甘油醛-3-磷酸去氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的基因表現被使用作為內部對照組(internal control)。有關該等引子對的相關資訊(包括:標的基因、各個引子的核苷酸序列以及所擴增出的PCR產物大小)已被整合於下面表6中。
表6. 被用來進行定量即時PCR的引子
標的基因 | 核酸分子 | 核苷酸序列 (5’→3’) | PCR產物大小(bp) |
CLDN1 (對應於GenBank登錄編號AF115546.1) | 前向引子CLDN1-F | gcgcgatatttcttcttgcagg (序列辨識編號:1) | 112 |
反向引子CLDN1-R | ttcgtacctggcattgactgg (序列辨識編號:2) | ||
GAPDH (對應於NCBI參考編號NM_002046.2) | 前向引子GAPDH-F | gaaggtgaaggtcggagt (序列辨識編號:3) | 225 |
反向引子GAPDH-R | gaagatggtgatggatttc (序列辨識編號:4) |
定量即時PCR是使用一StepOnePlus™ 即時PCR系統(StepOnePlus™ Real-Time PCR System)(Applied Biosystems™)並依據製造商的操作指引來執行,而有關定量即時PCR的操作條件與反應條件被顯示於下面的表7中。
表7. 定量即時PCR的反應條件
內容物 | 體積(µL) |
第一股cDNA (0.1 µg/µL) | 2 |
前向引子(10 µM) | 0.8 |
反向引子(10 µM) | 0.8 |
qPCRBIO SyGreen Mix預混合試劑 (PCR Biosystems, Cat. No. PB20.12-05) | 10 |
去離子水 | 6.4 |
操作條件:40個循環如下:在95℃下進行變性反應(denaturation)歷時3分鐘,在95℃下進行黏合反應(annealing)歷時5秒,以及在60℃下進行延伸反應(extension)歷時30秒。 |
由此所得到的各個PCR產物是以SYBR Green (雙股DNA結合染料)的螢光(fluorescence)來進行偵測,藉此計算出CLDN1基因的循環閾值[cycle threshold (
C t) value]。各組CLDN1基因相對的mRNA表現位準(relative mRNA expression level)是使用比較性
C t方法(comparative
C tmethod),將各自所得到之CLDN1基因循環閾值以GAPDH基因所得到的循環閾值來進行標準化,繼而減去對照組所得到之經標準化的CLDN1基因循環閾值而獲得。
各組的實驗被重複3次,而所得到的實驗數據是以“平均值(mean)±標準偏差(standard deviation, SD)”來表示,並且藉由單因子變異數分析(one-way analysis of variance, one-way ANOVA)來作分析,俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是
p<0.05,這表示有統計學顯著性。
結果:
圖1顯示在各組Caco-2細胞中所測得的CLDN1基因的相對mRNA表現位準。由圖1可見,在所有單菌組中,除了單菌組A,其餘組別的表現位準彼此皆無明顯的差異。而與單菌組R、L以及A相較之下,三菌組2至8的表現位準皆呈現出顯著的提升,三菌組1與該等二菌組的提升幅度則相對較為有限,其中甚至出現減低的情形。特別地,三菌組3至6達致最高的表現位準並且顯著高於所有二菌組所具者。
由此可見,單獨使用鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115在促進claudins表現上的效用是近似於習知具有保護腸胃道效用之相同菌屬或菌種的市售菌株所具者,不過以特定的比例範圍(亦即1:0.2:0.67至1:9:9)來組合使用鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115這三者能夠產生協同效應(synergistic effect),大幅提升claudins表現,而以其中兩者或其他比例來組合使用則無法展現此效用。
基於此結果,在上述三種乳酸菌菌株呈不同比例的混合菌液中,申請人選用效用最佳的兩者(亦即1:0.67:1與1:1:1)作為代表來進行下面的實驗,下稱混合菌液1與2。
B. 腸道細胞的跨上皮電阻 ( transepithelial electrical resistance, TEER) 之測定 實驗方法:
首先,將依據上面“一般實驗材料”的第3項來進行繼代培養的Caco-2細胞分為5個單菌組(亦即,單菌組R、L、A、R’與A’)以及2個三菌組(亦即,三菌組1與2)。接著,將各組的Caco-2細胞以一為3×10
5細胞/井的密度分別接種至含有2.5 mL的DMEM培養基之Transwell
®嵌入皿(Transwell
®inserts)(Corning Inc.)[其具有4 μm之孔洞的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)]中,繼而將該等嵌入皿放置於6-井培養盤的各井(含有1.5 mL的DMEM培養基)中,並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養歷時6天,以使得Caco-2細胞貼附於該等嵌入皿的底部形成Caco-2細胞單層(monolayer),期間每3天更換一次培養基。接著,移除各嵌入皿中的液體並以適量的磷酸鹽緩衝生理鹽水(phosphate buffered saline, PBS)予以洗滌2次,繼而分別更換以新鮮的DMEM培養基,然後使用一跨膜電阻儀EVOM2 (WPI, Sarasota, FL, U.S.A.)並搭配STX2電極來對各組的Caco-2細胞單層進行TEER位準的測量。
之後,移除各嵌入皿中的培養基,將上面“一般實驗材料”的第4項中所得到的各個乳酸菌菌株的菌液依據上面表4所示而添加至各個單菌組中,以及將混合菌液1與2分別添加至三菌組1與2中,繼而在培養箱(37℃、5% CO
2)中予以進行共培養(co-culture)歷時5小時。之後,移除各嵌入皿中的液體並如上所述進行PBS洗滌、培養基更換以及TEER位準的測量之步驟。
各組的TEER提升率(%)是藉由將各組在乳酸菌處理前後所測得的TEER位準代入下列公式(I)而被計算出:
公式 (I) : A = [(B-C)/C] × 100其中:A=TEER提升率(%)
B=乳酸菌處理後所測得的TEER位準
C=乳酸菌處理前所測得的TEER位準
各組的實驗被重複3次,而所得到的實驗數據是以“平均值±標準偏差”來表示,並且藉由one-way ANOVA來作分析,俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是
p<0.05,這表示有統計學顯著性。
結果:
圖2顯示各組Caco-2細胞單層所測得的TEER提升率。由圖2可見,三菌組1與2的TEER提升率是顯著高於各個單菌組所具者。這個實驗結果顯示:以特定的比例範圍來組合使用鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115能夠在提升TEER上產生協同效應,其效用不僅顯著優於單獨使用其中任一者,更顯著優於習知具有保護腸胃道效用之相同菌屬或菌種的市售菌株所具者。
綜合以上的實驗結果可知:以特定的比例範圍來組合使用鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115能夠協同地提升腸胃道屏障功能。
實施例 2. 乳酸菌菌株的腸道吸附能力測試 (intestinal adhesion assay) 實驗方法:
在本實施例中,大體上是參考P.S. Hsieh
et al.(2021)
Exp. Ther. Med., 21(3):188當中所述的方法來測定乳酸菌菌株對於腸道細胞的吸附能力。
首先,取數片經滅菌處理(sterilized)的蓋玻片並分別置於6-井培養盤的各井中,接著將依據上面“一般實驗材料”的第3項來進行繼代培養的Caco-2細胞分為2個單菌組(亦即,單菌組R’與A’)以及2個三菌組(亦即,三菌組1與2),並將各組的Caco-2細胞以一為3×10
5細胞/井的數量分別培養於含有5 mL的DMEM培養基與蓋玻片的6-井培養盤的各井中,並在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行培養至細胞達至100%匯聚,亦即,形成Caco-2細胞單層。接著,將各組分別更換以新鮮的DMEM培養基,在培養箱(37℃、5% CO
2)中予以培育1小時之後,移除培養基,並以PBS洗滌細胞2次。
之後,將上面“一般實驗材料”的第4項中所得到的各個乳酸菌菌株的菌液依據上面表4所示而添加至各個單菌組中,以及將混合菌液1與2分別添加至三菌組1與2中,再對各組分別添加以1.5 mL的新鮮培養基,繼而在培養箱(37℃、5% CO
2)中進行共培養(co-culture)歷時2小時。
之後,移除各井中的液體並以PBS予以洗滌之後,使用無水甲醇溶液來固定細胞歷時10分鐘,接著進行革蘭氏染色(Gram staining),繼而使用一直立式顯微鏡(Carl Zeiss MicroImaging, Inc.)並在一為1,500倍的放大倍率下觀察,並計數在單個視野中附著於Caco-2細胞單層上的乳酸菌菌數。
各組的實驗被重複3次,而所得到的實驗數據是以“平均值±標準偏差”來表示,並且藉由史徒登氏t-試驗(Student’s t-test)來作分析,俾以評估各組之間的差異性。若所得到的統計分析結果是
p<0.05,這表示有統計學顯著性。
結果:
圖3顯示所測得之吸附於各組Caco-2細胞單層上的乳酸菌菌數。由圖3可見,三菌組1與2皆有測得大量的乳酸菌,並且是略高於單菌組R’並顯著高於單菌組A’所具者。這個實驗結果顯示:以特定的比例範圍來組合使用鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115能夠展現優異的腸道細胞吸附能力,並且此吸附能力能達至甚至優於習知具有保護腸胃道效用之相同菌屬或菌種的市售菌株所具者。
實施例 3. 乳酸菌菌株在抗 腸胃道 病原菌上的效用評估 實驗材料: 1. MRS瓊脂培養盤(MRS agar plate):
將1.5% (w/v)的瓊脂粉末(agar powder)添加到MRS肉湯培養基中,並依據熟習此技藝者所詳知且慣用的技術來製備MRS瓊脂培養板以供後續實驗之用。
2. 上層瓊脂培養基(top agar medium):
將1.5% (w/v)的瓊脂粉末分別添加到如上面表3所示的NB培養基、BHI培養基以及添加有2.5%氯化鈉的TSB培養基中,繼而於121℃下進行滅菌處理歷時15分鐘。之後,將該等經融化的培養基置於45℃的水浴槽中,以供在後續實驗中作為上層瓊脂培養基之用。
3. 腸胃道病原菌菌液的製備:
將上面“一般實驗材料”第2項當中所述的各個腸胃道病原菌以上面表3所示的適用的培養基與培養條件來培養歷時20小時,俾以活化菌株。接著,將經活化的菌株分別以一為2% (v/v)的接種量並以表3所示的培養基與培養條件進行培養,藉此得到細菌濃度約為10
5至10
11CFU/mL的各個腸胃道病原菌的菌液。
實驗方法:
在本實施例中,大體上是參考Y.T. Chen
et al.(2020),
Lett. Appl. Microbiol., 70(4):310-317當中所述的方法來進行雙層瓊脂覆蓋法(double agar overlay method),俾以評估各個乳酸菌菌株培養物在抑制腸胃道病原菌生長上的效用。
首先,將上面“一般實驗材料”的第4項當中所得到的鼠李糖乳桿菌GG的菌液作為單菌組,而將混合菌液1與2作為三菌組1與2。
接著,以經滅菌處理的棉棒分別沾取各組乳酸菌菌液(約1 mL),繼而於MRS瓊脂培養盤沿著直徑劃一條約2 cm寬的線,繼而在37℃下進行培養歷時48小時,而使得各組乳酸菌在MRS瓊脂培養基表面形成一條約2 cm寬的乳酸菌生長區(growth zone)。另外,以不含有任何乳酸菌的MRS培養基於一MRS瓊脂培養盤上劃線來作為空白對照組。
將經融化的NB瓊脂培養基(即上層瓊脂培養基)倒入各組的培養盤並均勻覆蓋於MRS瓊脂培養基上,待NB瓊脂培養基凝固後,以經滅菌處理的棉棒沾取腸道沙門氏菌腸道亞種菌液,並均勻塗抹於各組的NB瓊脂培養基表面,繼而在培養箱(37℃、5% CO
2)中進一步進行培養歷時24小時。各組乳酸菌菌液在抑制腸道沙門氏菌腸道亞種生長上的效用是藉由測量於各組在雙層瓊脂培養基表面上所形成的抑制區(inhibition zone)的寬度而被評估。
各組乳酸菌菌液對於大腸桿菌、李斯特單胞菌以及腸炎弧菌的抑制效用大體上是參照上面針對腸道沙門氏菌腸道亞種所描述的方式來進行評估,不同之處在於:分別以大腸桿菌、李斯特單胞菌以及腸炎弧菌菌液來代替腸道沙門氏菌腸道亞種菌液,並且以經融化的NB瓊脂培養基、BHI瓊脂培養基以及添加有2.5%氯化鈉的TSB瓊脂培養基來作為上層瓊脂培養基。
結果:
各組乳酸菌對於各個腸胃道病原菌的抑制效用是如下面表8所示。
表8. 各組乳酸菌對於各個腸胃道病原菌的抑制效用
註:抑制效用是以所形成的抑制區寬度來衡量,其中“-”表示抑制區寬度為0 cm,“+”表示>0至<2 cm,“++”表示2至<3 cm,“+++”表示3至<4 cm,“++++”表示4至<5 cm,“+++++”表示5至<8.5 cm,以及“++++++”表示≧8.5 cm。
組別 | 抑制效用 | |||
腸道沙門氏菌腸道亞種 | 李斯特單胞菌 | 大腸桿菌 | 腸炎弧菌 | |
空白對照組 | - | - | - | - |
單菌組 | +++ | +++ | ++++ | ++++ |
三菌組1 | +++++ | ++++ | +++++ | +++++ |
三菌組2 | +++++ | ++++ | ++++++ | +++++ |
由表8可見,對於不同的腸胃道病原菌,各個三菌組的抑制效用皆顯著優於單菌組所具者。這表示:以特定的比例範圍來組合使用鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115能夠有效地抑制腸胃道病原菌的生長,並且其效用是顯著優於習知具有保護腸胃道效用之相同菌屬或菌種的市售菌株所具者。
綜合以上的實驗結果,申請人認為:鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115在特定的比例範圍(亦即1:0.2:0.67至1:9:9)下能夠有效地附著於腸道細胞上,並協同地提升腸胃道屏障功能且抑制腸胃道病原菌生長,而被預期可供應用於改善腸胃道屏障功能異常相關疾病。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時,本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述,明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是,本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點,在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後,將變得明顯,其中:
圖1顯示各組Caco-2細胞被處理以不同的乳酸菌菌株的菌液後所測得的CLDN1基因的相對mRNA表現位準,其中英文字母表示統計學分析結果,若兩組之間有任一個相同的英文字母則代表沒有統計學顯著性,而若兩組之間完全沒有相同的英文字母則代表有統計學顯著性(
p<0.05);
圖2顯示各組Caco-2細胞單層被處理以不同的乳酸菌菌株的菌液後所測得的TEER提升率,其中英文字母表示統計學分析結果,若兩組之間有任一個相同的英文字母則代表沒有統計學顯著性,而若兩組之間完全沒有相同的英文字母則代表有統計學顯著性(
p<0.05);以及
圖3顯示各組Caco-2細胞單層在與不同的乳酸菌菌株的菌液進行共培養後所測得之吸附於其上的乳酸菌菌數(CFU),其中“**”表示當與單菌組A’作比較,
p<0.01。
TW中華民國;食品工業發展研究所生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI);2021/03/25;BCRC 911045。
Claims (10)
- 一種乳酸菌菌株組合供應用於製備一用來提升腸胃道屏障功能和/或改善腸胃道屏障功能異常相關疾病之組成物的用途,其中該乳酸菌菌株組合包含有呈一範圍落在1:0.2:0.67至1:9:9內之菌數比的鼠李糖乳桿菌( Lactobacillus rhamnosus) MP108 (CGMCC No.21225)、長雙歧桿菌嬰兒亞種( Bifidobacterium longumsubsp. infantis) BLI-02 (BCRC 910812)以及動物雙歧桿菌乳亞種( Bifidobacterium animalissubsp. lactis) BB-115 (BCRC 911045)。
- 如請求項1的用途,其中該腸胃道屏障功能的提升包括下列至少一者:改善腸胃道上皮結構與功能、對抗腸胃道病原菌感染、促進益生菌定殖,以及調節腸胃道菌相。
- 如請求項1的用途,其中該腸胃道屏障功能異常相關疾病是選自於由下列所構成的群組:腹瀉、腸胃炎、發炎性腸道疾病(inflammatory bowel disease, IBD)、大腸激躁症(irritable bowel syndrome, IBS)、傷寒熱(typhoid fever)、短腸症候群(short bowel syndrome, SBS)、小腸細菌過度生長(small intestine bacterial overgrowth, SIBO),以及它們的組合。
- 一種乳酸菌菌株組合供應用於製備一用來抑制腸胃道病原菌生長之組成物的用途,其中該乳酸菌菌株組合包含有呈一範圍落在1:0.2:0.67至1:9:9內之菌數比的鼠李糖乳桿菌MP108、長雙歧桿菌嬰兒亞種BLI-02以及動物雙歧桿菌乳亞種BB-115。
- 如請求項2或4的用途,其中該腸胃道病原菌是選自於由下列所構成的群組:腸道沙門氏菌腸道亞種( Salmonella entericasubsp. enterica)、李斯特單胞菌( Listeria monocytogenes)、大腸桿菌( Escherichia coli)、腸炎弧菌 (Vibrio parahaemolyticus)、金黃色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)、痢疾桿菌( Shigella boydii)、痢疾志賀桿菌( Shigella dysenteriae)、克雷伯氏肺炎桿菌( Klebsiella pneumoniae)、小腸大腸炎耶氏桿菌( Yersinia enterocolitica)、普通變形桿菌( Proteus vulgaris),以及它們的組合。
- 如請求項1或4的用途,其中該菌數比是落在1:0.67:0.67至1:1.5:1.5的範圍內。
- 如請求項1或4的用途,其中該組成物是食品組成物。
- 如請求項1或4的用途,其中該組成物是藥學組成物。
- 如請求項8的用途,其中該藥學組成物進一步包含有一藥學上可接受的載劑。
- 如請求項8的用途,其中該藥學組成物是呈一供口服投藥、局部投藥或非經腸道投藥的劑型。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW110148434A TWI801057B (zh) | 2021-12-23 | 2021-12-23 | 使用乳酸菌菌株組合來提升腸胃道屏障功能 |
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