CN116531411A - 使用乳酸菌菌株组合来提升肠胃道屏障功能 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及使用乳酸菌菌株组合来提升肠胃道屏障功能。本发明揭示一种乳酸菌菌株组合可被用于提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病。本发明也揭示该乳酸菌菌株组合可被用于抑制肠胃道病原菌生长。其中该乳酸菌菌株组合包含有呈范围落在1：0.2：0.67至1：9：9内的菌数比的鼠李糖乳杆菌MP108(CGMCC No.21225)、长双歧杆菌婴儿亚种BLI‑02(CGMCC No.15212)以及动物双歧杆菌乳亚种BB‑115(CGMCC No.21840)。
Description
技术领域
本发明涉及使用乳酸菌菌株组合来提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病，以及抑制肠胃道病原菌生长。
背景技术
肠胃道屏障(gastrointestinal barrier)是由紧密连接蛋白(tight junctionproteins)(特别是claudins)连结的肠胃道上皮细胞(gastrointestinal epithelialcells)所组成，能够隔绝肠胃道病原菌(gastrointestinal pathogenic bacteria)及其分泌物的进入。然而，肠胃道屏障功能也容易会受到肠胃道病原菌的影响，例如，当肠胃道菌丛失调(gastrointestinal dysbiosis)而肠胃道病原菌大量增生时，肠胃道病原菌可通过向下调节紧密连接蛋白的表达来损害肠胃道上皮的结构与功能，并异常提高肠胃道的通透性而有利于入侵宿主，进而引起一系列相关疾病[也就是肠胃道屏障功能异常相关疾病(gastrointestinal barrier dysfunction-related diseases)]，例如，发炎性肠道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)[诸如，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)与克罗恩病(Crohn's disease)]以及大肠激躁症(irritable bowel syndrome,IBS)。
目前大多使用抗生素来对抗肠胃道病原菌并改善肠胃道屏障功能异常相关疾病，然而，抗生素会使得肠胃道病原菌产生抗生素耐性(antibiotic resistance)，并且会导致严重副作用(side effect)与不良反应(adverse effect)。因此，本领域的相关研究人员皆致力于开发可以有效地提升肠胃道屏障功能和/或对抗肠胃道病原菌并且不会产生非所欲的副作用的药物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)属于一般被公认为安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)并且是为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。常见的乳酸菌包括：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及明串珠菌属(Leuconostoc)等。
目前已有研究在探讨乳酸菌菌株在肠胃道屏障功能上的相关应用。例如，在D.M.Commane et al.(2005),Nutrition and Cancer,51(1):102中，D.M.Commane等人测试了多种益生菌对于带有脱氧胆酸(deoxycholic acid,DCA)-诱发的肠道上皮屏障损伤的人类结肠腺癌细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)Caco-2的影响，并通过对Caco-2的细胞单层(monolayer)进行跨上皮电阻(transepithelial electricalresistance,TEER)的测定而发现到，动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BB-12在提升Caco-2细胞单层的TEER上具有最佳的效用，而被预期能够改善肠胃道上皮与紧密连接蛋白的完整性以及功能，以达致预防和/或改善肠胃道上皮屏障功能损伤的功效。
另外，在X.Han et al.(2019),Gut Microbes.,10(1):59–76中，X.Han等人测试了鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)GG(LGG)的预处理对于IFN-γ诱发的肠道上皮屏障损伤(IFN-γinduced epithelial barrier damage)的影响，而实验结果发现，鼠李糖乳杆菌GG能够有效地改善人类肠道上皮培养物的细胞通透性，并恢复紧密连接蛋白的表达。据此，鼠李糖乳杆菌GG被认为能够预防肠胃道屏障功能异常。
虽然已存在有上述文献报道，本领域中仍然存在有需要去筛选出可以有效提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病并且抑制肠胃道病原菌生长的乳酸菌以供产业界之用。
发明内容
于本发明中，申请人经实验而发现到，以特定的比例范围(也就是1：0.2：0.67至1：9：9)来组合使用鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108(CGMCC No.21225)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC No.15212)以及动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)BB-115(CGMCCNo.21840)能够协同地提升肠胃道屏障功能(gastrointestinal barrier function)，并有效地促进肠胃道细胞吸附能力且抑制肠胃道病原菌生长，而被预期可供应用于改善肠胃道屏障功能异常相关疾病。
于是，在第一个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株组合供应用于制备用来提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株组合包含有呈范围落在1：0.2：0.67至1：9：9内的菌数比的鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115。
较佳地，该肠胃道屏障功能的提升包括下列至少一者：改善肠胃道上皮结构与功能、对抗肠胃道病原菌感染、促进益生菌定殖，以及调节肠胃道菌相。
较佳地，该肠胃道屏障功能异常相关疾病选自于由下列所构成的群组：腹泻(diarrhea)、肠胃炎(gastroenteritis)、发炎性肠道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、大肠激躁症(irritable bowel syndrome,IBS)、伤寒热(typhoid fever)、短肠症候群(short bowel syndrome,SBS)、小肠细菌过度生长(small intestine bacterialovergrowth,SIBO)，以及它们的组合。
在第二个方面，本发明提供一种用来提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病的方法，其包括对有此需要的个体投予如上所述的乳酸菌菌株组合。
在第三个方面，本发明提供如上所述的乳酸菌菌株组合供应用于制备用来抑制肠胃道病原菌生长的组合物的用途。
较佳地，该肠胃道病原菌选自于由下列所构成的群组：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigella boydii)、痢疾志贺杆菌(Shigelladysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，以及它们的组合。
较佳地，鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115的菌数比落在1：0.67：0.67至1：1.5：1.5的范围内。
在第四个方面，本发明提供一种用来抑制肠胃道病原菌生长的方法，其包括对有此需要的个体投予如上所述的的乳酸菌菌株组合。
较佳地，该组合物是食品组合物。
较佳地，该组合物是药学组合物。
较佳地，该药学组合物进一步包含有药学上可接受的载剂。
更佳地，该药学组合物呈供口服投药、局部投药或非经肠道投药的剂型。
附图说明
图1显示各组Caco-2细胞被处理以不同的乳酸菌菌株的菌液后所测得的CLDN1基因的相对mRNA表达水平，其中英文字母表示统计学分析结果，若两组间有任一个相同的英文字母则代表没有统计学显著性，而若两组间完全没有相同的英文字母则代表有统计学显著性(p＜0.05)；
图2显示各组Caco-2细胞单层被处理以不同的乳酸菌菌株的菌液后所测得的TEER提升率，其中英文字母表示统计学分析结果，若两组间有任一个相同的英文字母则代表没有统计学显著性，而若两组间完全没有相同的英文字母则代表有统计学显著性(p＜0.05)；以及
图3显示各组Caco-2细胞单层在与不同的乳酸菌菌株的菌液进行共培养后所测得的吸附于其上的乳酸菌菌数(CFU)，其中“**”表示当与单菌组A’作比较，p＜0.01。
具体实施方式
为了本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
本发明提供一种乳酸菌菌株组合供应用于制备用来提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病的组合物的用途，其中该乳酸菌菌株组合包含有呈范围落在1：0.2：0.67至1：9：9内的菌数比的鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)MP108(CGMCC No.21225)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC No.15212)以及动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)BB-115(CGMCC No.21840)。
较佳地，该菌数比落在1：0.67：0.67至1：1.5：1.5的范围内。在本发明的一个较佳具体例中，该菌数比为1：0.67：1。在本发明的另一个较佳具体例中，该菌数比为1：1：1。
依据本发明，术语“肠胃道屏障功能(gastrointestinal barrier function)”与“肠胃道上皮屏障功能(gastrointestinal epithelial barrier function)”可被交替地使用。较佳地，该肠胃道屏障功能是肠道屏障功能(intestinal barrier function)。
依据本发明，该肠胃道屏障功能的提升包括下列至少一者：改善肠胃道上皮结构与功能、对抗肠胃道病原菌感染、促进益生菌定殖，以及调节肠胃道菌相。
依据本发明，该肠胃道屏障功能异常相关疾病可包括，但不限于：腹泻(diarrhea)[例如，旅行者腹泻(traveler’s diarrhea,TD)与渗透性腹泻(osmotic diarrhea)]、肠胃炎(gastroenteritis)[例如，肠炎(enteritis)与病毒性肠胃炎(viralgastroenteritis)]、发炎性肠道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)[例如，溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)与克罗恩病(Crohn's disease)]、大肠激躁症(irritable bowel syndrome,IBS)、伤寒热(typhoid fever)、短肠症候群(short bowelsyndrome,SBS)，以及小肠细菌过度生长(small intestine bacterial overgrowth,SIBO)。
依据本发明，该乳酸菌菌株组合可具有大约107至1012CFU/mL的细菌浓度，较佳地，108至1010CFU/mL。在本发明的一个较佳具体例中，该乳酸菌菌株组合的细菌浓度为大约109CFU/mL。
依据本发明，鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115可以是活菌或死菌、经浓缩的(concentrated)或未经浓缩的(non-concentrated)、液态(liquid)、糊状(paste)、半固态(semi-solid)，或固态(solid)[例如，丸(pellet)、细颗粒(granule)或粉末(powder)]，并且可以是经热去活的(heat-inactivated)、经冷冻的(frozen)、经干燥的(dried)，或经冷冻-干燥的(freeze-dried)[例如，可呈冷冻干燥形式或喷雾/流化床干燥(spray/fluid bed dried)形式]。
本发明也提供如上所述的乳酸菌菌株组合供应用于制备用来抑制肠胃道病原菌生长的组合物的用途。
依据本发明，该肠胃道病原菌选自于由下列所构成的群组：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigella boydii)、痢疾志贺杆菌(Shigelladysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)，以及它们的组合。较佳地，该肠胃道病原菌是肠道沙门氏菌肠道亚种、李斯特单胞菌、大肠杆菌以及肠炎弧菌。
如本文中所使用的，术语“抑制(inhibition)”或“抑制(inhibiting)”意指防止或减缓肠胃道病原菌在个体中生长。
依据本发明，该组合物可以是食品组合物(food composition)，例如，呈食品添加物(food additive)的形式，其可以被添加至可食性材料(edible material)中以制备供人类或动物食用的食品产品。依据本发明，该食物产品的种类可包括，但不限于：奶粉(milkpowder)、发酵乳(fermented milk)、优格(yogurt)、奶酪(butter)、饮料(beverages)(例如，茶、咖啡)、机能性饮料(functional beverages)、面制品(flour product)、烘焙食品(baked foods)、甜点(confectionery)、糖果(candies)、发酵食品(fermented foods)、动物饲料(animal feeds)、保健食品(health foods)、婴儿食品(infant food)，以及膳食补充品(dietary supplements)。
依据本发明，该组合物可以是药学组合物(pharmaceutical composition)。
依据本发明，该药学组合物可呈适合于口服投药(oral administration)、局部投药(topical administration)或非经肠道投药(parenteral administration)的剂型(dosage form)。
依据本发明，该药学组合物可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gelling agent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在本领域技术人员的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于口服投药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、酏剂(elixir)、浓浆(slurry)以及类似物。
依据本发明，该药学组合物可利用本领域技术人员所详知的技术而被制造成适合于非经肠道途径投药的剂型[包括注射品(injection)，例如，无菌的水性溶液(sterileaqueous solution)或分散液(dispersion)]，且以选自于由下列所构成的群组中的途径来投药：腹膜内注射(intraperitoneal injection)、皮下注射(subcutaneous injection)、皮内注射(intradermal injection)以及舌下投药(sublingual administration)。
此外，本发明也提供一种用来提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病的方法，其包括对有此需要的个体投予(administering)如上所述的乳酸菌菌株组合。本发明也提供一种用来抑制肠胃道病原菌生长的方法，其包括对有此需要的个体投予如上所述的乳酸菌菌株组合。
如本文中所使用的，术语“投予”以及“投药(administration)”可被交换地使用，并且意指通过任何合适的途径来对个体导入(introducing)、提供(providing)或递送(delivering)预定的活性成分以执行其预期的效用。
如本文中所使用的，术语“个体(subject)”意指任何感兴趣的哺乳类动物，诸如人(humans)、猴子(monkeys)、牛(cows)、绵羊(sheep)、马(horses)、猪(pigs)、山羊(goats)、狗(dogs)、猫(cats)、小鼠(mice)以及大鼠(rats)。
依据本发明，该乳酸菌菌株组合的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被改善的疾病的严重性，投药途径，以及要被改善的个体的体重、年龄、身体状况与反应。一般而言，该乳酸菌菌株组合可呈单一剂量或是分成多个剂量的形式而被口服地、局部地或非经肠地道投药。
<实施例>
一般实验材料：
1.乳酸菌菌株：
在下面实施例中拿来进行功效评估的乳酸菌菌株已被保藏于中国台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)；和/或依据布达佩斯条约(the Budapest Treaty)的规定被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)。为表清楚，各个乳酸菌菌株的相关信息(包括：学名、相关出处、保藏编号以及保藏日期)已被整合于下面表1中。
表1.各个乳酸菌菌株的相关信息
注：鼠李糖乳杆菌MP108以及长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02皆已公众可获得。
为供比较，也有使用下列已知具有保护肠胃道效用的市售乳酸菌菌株：购自于科汉森股份有限公司(Chr.Hansen A/S,Denmark)的动物双歧杆菌乳亚种BB-12以及鼠李糖乳杆菌GG(LGG)。
2.肠胃道病原菌菌株(gastrointestinal pathogenic bacteria strains)：
在下面实施例中所使用的肠胃道病原菌菌株皆是购自于FIRDI的BCRC。为表清楚，各个肠胃道病原菌菌株的学名与保藏编号)已被整合于下面表2中，而它们所适用的培养基与培养条件是如下面表3所示。
表2.各个肠胃道病原菌菌株的相关信息
表3.各个肠胃道病原菌株的培养基与培养条件
3.人类结肠腺癌细胞系(human colon adenocarcinoma cell line)Caco-2的来源与培养：
在下面实施例中所使用的人类结肠腺癌细胞系Caco-2(HTB-37TM)是购自于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection,ATCC)。Caco-2细胞被培养于含有杜贝可氏改良的依格氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium,DMEM)(Cytiva)[添加有10％胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)以及1％盘尼西林-链霉素(penicillin-streptomycin)]的10cm培养皿(Petri dish)中，并在培养条件被设定为37℃、5％CO2的培养箱中进行培养。之后，大约每隔2-3天更换新鲜的培养基。当细胞密度达到约80-90％汇聚(confluence)时，进行继代培养(subculture)。
4.乳酸菌菌株的菌液制备：
首先，将上面第1项当中所述的乳酸菌菌株分别接种至补充有0.05％半胱氨酸(cysteine)的MRS肉汤培养基(MRS broth)(Difco,Cat.No.288130)中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时24小时，以活化这些乳酸菌菌株。接着，将经活化的菌株分别以2％(v/v)的接种量接种至MRS肉汤培养基中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时24小时。之后，将所形成的培养物以3,000rpm来进行离心历时10分钟，接着去除上清液，而沉淀物(pellets)以适量的MRS肉汤培养基来予以散浮并将各个乳酸菌菌株调整成具有约为109CFU/mL的细菌浓度(以平板计数培养基来进行菌数计数)，借此而分别得到各个乳酸菌菌株的菌液。
实施例1.乳酸菌菌株在提升肠胃道屏障功能(gastrointestinal barrierfunction)上的效用评估
A.肠道细胞紧密连接蛋白(tight junctions protein)claudins的表达量分析
实验方法：
(i)以乳酸菌菌株的菌液处理人类结肠腺癌细胞Caco-2细胞：
将依据上面“一般实验材料”的第3项来进行继代培养的Caco-2细胞分为1个对照组、5个单菌组(也就是，单菌组R、L、A、R’与A’)、3个二菌组(也就是，二菌组LA、RA与RL)，以及8个三菌组(也就是，三菌组1至8)。将各组细胞以3×105细胞/孔的数量分别培养于含有3mL的DMEM培养基(添加有10％FBS以及1％盘尼西林-链霉素)的6-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时11天，期间每3天更换一次培养基。
接着，移除各孔中的培养基，将上面“一般实验材料”的第4项中所得到的各个乳酸菌菌株的菌液依据下面表4所示而添加至各个单菌组的细胞培养物中，以及将鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115的菌液依据下面表5所示的比例来予以混合，继而将所得到的混合菌液(细菌浓度为109CFU/mL)分别添加至对应的各个二菌组与三菌组的细胞培养物中，至于对照组则被添加以不含有任何乳酸菌菌液的DMEM培养基，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中予以进行共培养历时6小时。接着，将所得到的细胞培养物拿来进行下面第(ii)项的分析。
表4.各个单菌组所处理的乳酸菌菌株
表5.各个二菌组与三菌组所处理的乳酸菌菌株的菌数比
| 组别 | MP108：BLI-02：BB-115 |
| 二菌组LA | 0：1：1 |
| 二菌组RA | 1：0：1 |
| 二菌组RL | 1：1：0 |
| 三菌组1 | 1：0.11：1 |
| 三菌组2 | 1：0.2：1 |
| 三菌组3 | 1：0.67：1 |
| 三菌组4 | 1：1：0.67 |
| 三菌组5 | 1：1：1 |
| 三菌组6 | 1：1.5：1.5 |
| 三菌组7 | 1：5：5 |
| 三菌组8 | 1：9：9 |
(ii)CLDN1基因的mRNA水平的测定：
首先，使用总RNA微量提取系统试剂盒(Total RNA Extraction MiniprepSystem)(VIOGENE,Cat.No.GR1001)并依据制造商所提供的操作指引来进行各组细胞培养物的总RNAs(total RNAs)的提取。由此所得到的各组的总RNAs分别以cDNA反转录试剂(GoScriptTM Reverse Transcriptase,Promega,Cat.No.A5003)并且依据制造商所提供的操作指引来进行反转录反应(reverse transcription reaction)，以合成第一链cDNA(first-strand cDNA)。
接着，以所得到的第一链cDNA作为模板(template)，并参考Y.Jin andA.T.Blikslager,(2016),Am.J.Physiol.Cell Physiol.311(6):C996-C1004而使用针对CLDN1基因所设计的特异性引物对(specific primer pair)来进行定量实时聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，以下简称定量实时PCR)。另外，甘油醛-3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)的基因表达被使用作为内部对照组(internal control)。有关这些引物对的相关信息(包括：靶基因、各个引物的核苷酸序列以及所扩增出的PCR产物大小)已被整合于下面表6中。
表6.被用来进行定量实时PCR的引物
定量实时PCR是使用StepOnePlusTM实时PCR系统(StepOnePlusTM Real-Time PCRSystem)(Applied BiosystemsTM)并依据制造商的操作指引来执行的，而有关定量实时PCR的操作条件与反应条件被显示于下面的表7中。
表7.定量实时PCR的反应条件
由此所得到的各个PCR产物是以SYBR Green(双链DNA结合染料)的荧光(fluorescence)来进行侦测的，借此计算出CLDN1基因的循环阈值[cycle threshold(Ct)value]。各组CLDN1基因相对的mRNA表达水平(relative mRNA expression level)是使用比较性Ct方法(comparative Ct method)，将各自所得到的CLDN1基因循环阈值以GAPDH基因所得到的循环阈值来进行标准化，继而减去对照组所得到的经标准化的CLDN1基因循环阈值而获得的。
各组的实验被重复3次，而所得到的实验数据以“平均值(mean)±标准偏差(standard deviat ion,SD)”来表示，并且通过单因子变异数分析(one-way analysis ofvariance,one-way ANOVA)来作分析，以评估各组间的差异性。若所得到的统计分析结果是p<0.05，这表示有统计学显著性。
结果：
图1显示在各组Caco-2细胞中所测得的CLDN1基因的相对mRNA表达水平。由图1可见，在所有单菌组中，除了单菌组A，其余组别的表达水平彼此皆无明显的差异。而与单菌组R、L以及A相较下，三菌组2至8的表达水平皆呈现出显著的提升，三菌组1与这些二菌组的提升幅度则相对较为有限，其中甚至出现减低的情形。特别地，三菌组3至6达致最高的表达水平并且显著高于所有二菌组所具者。
由此可见，单独使用鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115在促进claudins表达上的效用是近似于已知具有保护肠胃道效用的相同菌属或菌种的市售菌株所具者，不过以特定的比例范围(也就是1：0.2：0.67至1：9：9)来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115这三者能够产生协同效应(synergistic effect)，大幅提升claudins表达，而以其中两者或其他比例来组合使用则无法展现此效用。
基于此结果，在上述三种乳酸菌菌株呈不同比例的混合菌液中，申请人选用效用最佳的两者(也就是1：0.67：1与1：1：1)作为代表来进行下面的实验，下称混合菌液1与2。
B.肠道细胞的跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance,TEER)的测定
实验方法：
首先，将依据上面“一般实验材料”的第3项来进行继代培养的Caco-2细胞分为5个单菌组(也就是，单菌组R、L、A、R’与A’)以及2个三菌组(也就是，三菌组1与2)。接着，将各组的Caco-2细胞以3×105细胞/孔的密度分别接种至含有2.5mL的DMEM培养基的嵌入皿(/>inserts)(Corning Inc.)[其具有4μm的孔洞的聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)]中，继而将这些嵌入皿放置于6-孔培养板的各孔(含有1.5mL的DMEM培养基)中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养历时6天，以使得Caco-2细胞贴附于这些嵌入皿的底部形成Caco-2细胞单层(monolayer)，期间每3天更换一次培养基。接着，移除各嵌入皿中的液体并以适量的磷酸盐缓冲生理盐水(phosphate bufferedsaline,PBS)予以洗涤2次，继而分别更换以新鲜的DMEM培养基，然后使用跨膜电阻仪EVOM2(WPI,Sarasota,FL,U.S.A.)并搭配STX2电极来对各组的Caco-2细胞单层进行TEER水平的测量。
之后，移除各嵌入皿中的培养基，将上面“一般实验材料”的第4项中所得到的各个乳酸菌菌株的菌液依据上面表4所示而添加至各个单菌组中，以及将混合菌液1与2分别添加至三菌组1与2中，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中予以进行共培养(co-culture)历时5小时。之后，移除各嵌入皿中的液体并如上所述进行PBS洗涤、培养基更换以及TEER水平的测量的步骤。
各组的TEER提升率(％)通过将各组在乳酸菌处理前后所测得的TEER水平代入下列公式(I)而被计算出：
公式(I)：A＝[(B-C)/C]×100
其中：A＝TEER提升率(％)
B＝乳酸菌处理后所测得的TEER水平
C＝乳酸菌处理前所测得的TEER水平
各组的实验被重复3次，而所得到的实验数据以“平均值±标准偏差”来表示，并且通过one-way ANOVA来作分析，以评估各组间的差异性。若所得到的统计分析结果是p<0.05，这表示有统计学显著性。
结果：
图2显示各组Caco-2细胞单层所测得的TEER提升率。由图2可见，三菌组1与2的TEER提升率显著高于各个单菌组所具者。这个实验结果显示：以特定的比例范围来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115能够在提升TEER上产生协同效应，其效用不仅显著优于单独使用其中任一者，更显著优于已知具有保护肠胃道效用的相同菌属或菌种的市售菌株所具者。
综合以上的实验结果可知：以特定的比例范围来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115能够协同地提升肠胃道屏障功能。
实施例2.乳酸菌菌株的肠道吸附能力测试(intestinal adhesion assay)
实验方法：
在本实施例中，大体上是参考P.S.Hsieh et al.(2021)Exp.Ther.Med.,21(3):188当中所述的方法来测定乳酸菌菌株对于肠道细胞的吸附能力。
首先，取多片经灭菌处理(sterilized)的盖玻片并分别置于6-孔培养板的各孔中，接着将依据上面“一般实验材料”的第3项来进行继代培养的Caco-2细胞分为2个单菌组(也就是，单菌组R’与A’)以及2个三菌组(也就是，三菌组1与2)，并将各组的Caco-2细胞以3×105细胞/孔的数量分别培养于含有5mL的DMEM培养基与盖玻片的6-孔培养板的各孔中，并在培养箱(37℃、5％CO2)中进行培养至细胞达至100％汇聚，也就是，形成Caco-2细胞单层。接着，将各组分别更换以新鲜的DMEM培养基，在培养箱(37℃、5％CO2)中予以培育1小时后，移除培养基，并以PBS洗涤细胞2次。
之后，将上面“一般实验材料”的第4项中所得到的各个乳酸菌菌株的菌液依据上面表4所示而添加至各个单菌组中，以及将混合菌液1与2分别添加至三菌组1与2中，再对各组分别添加以1.5mL的新鲜培养基，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中进行共培养(co-culture)历时2小时。
之后，移除各孔中的液体并以PBS予以洗涤后，使用无水甲醇溶液来固定细胞历时10分钟，接着进行革兰氏染色(Gram staining)，继而使用直立式显微镜(Carl ZeissMicroImaging,Inc.)并在1,500倍的放大倍率下观察，并计数在单个视野中附着于Caco-2细胞单层上的乳酸菌菌数。
各组的实验被重复3次，而所得到的实验数据以“平均值±标准偏差”来表示，并且通过史徒登氏t-试验(Student’s t-test)来作分析，以评估各组间的差异性。若所得到的统计分析结果是p<0.05，这表示有统计学显著性。
结果：
图3显示所测得的吸附于各组Caco-2细胞单层上的乳酸菌菌数。由图3可见，三菌组1与2皆有测得大量的乳酸菌，并且是略高于单菌组R’并显著高于单菌组A’所具者。这个实验结果显示：以特定的比例范围来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115能够展现优异的肠道细胞吸附能力，并且此吸附能力能达至甚至优于已知具有保护肠胃道效用的相同菌属或菌种的市售菌株所具者。
实施例3.乳酸菌菌株在抗肠胃道病原菌上的效用评估
实验材料：
1.MRS琼脂培养板(MRS agar plate)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末(agar powder)添加到MRS肉汤培养基中，并依据本领域技术人员所详知且惯用的技术来制备MRS琼脂培养板以供后续实验之用。
2.上层琼脂培养基(top agar medium)：
将1.5％(w/v)的琼脂粉末分别添加到如上面表3所示的NB培养基、BHI培养基以及添加有2.5％氯化钠的TSB培养基中，继而于121℃下进行灭菌处理历时15分钟。之后，将这些经融化的培养基置于45℃的水浴槽中，以供在后续实验中作为上层琼脂培养基之用。
3.肠胃道病原菌菌液的制备：
将上面“一般实验材料”第2项当中所述的各个肠胃道病原菌以上面表3所示的适用的培养基与培养条件来培养历时20小时，以活化菌株。接着，将经活化的菌株分别以2％(v/v)的接种量并以表3所示的培养基与培养条件进行培养，借此得到细菌浓度约为105至1011CFU/mL的各个肠胃道病原菌的菌液。
实验方法：
在本实施例中，大体上是参考Y.T.Chen et al.(2020),Lett.Appl.Microbiol.,70(4):310-317当中所述的方法来进行双层琼脂覆盖法(double agar overlay method)，以评估各个乳酸菌菌株培养物在抑制肠胃道病原菌生长上的效用。
首先，将上面“一般实验材料”的第4项当中所得到的鼠李糖乳杆菌GG的菌液作为单菌组，而将混合菌液1与2作为三菌组1与2。
接着，以经灭菌处理的棉棒分别沾取各组乳酸菌菌液(约1mL)，继而于MRS琼脂培养板沿着直径划一条约2cm宽的线，继而在37℃下进行培养历时48小时，而使得各组乳酸菌在MRS琼脂培养基表面形成一条约2cm宽的乳酸菌生长区(growth zone)。另外，以不含有任何乳酸菌的MRS培养基于MRS琼脂培养板上划线来作为空白对照组。
将经融化的NB琼脂培养基(即上层琼脂培养基)倒入各组的培养板并均匀覆盖于MRS琼脂培养基上，待NB琼脂培养基凝固后，以经灭菌处理的棉棒沾取肠道沙门氏菌肠道亚种菌液，并均匀涂抹于各组的NB琼脂培养基表面，继而在培养箱(37℃、5％CO2)中进一步进行培养历时24小时。各组乳酸菌菌液在抑制肠道沙门氏菌肠道亚种生长上的效用通过测量于各组在双层琼脂培养基表面上所形成的抑制区(inhibition zone)的宽度而被评估。
各组乳酸菌菌液对于大肠杆菌、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌的抑制效用大体上是参照上面针对肠道沙门氏菌肠道亚种所描述的方式来进行评估，不同处在于：分别以大肠杆菌、李斯特单胞菌以及肠炎弧菌菌液来代替肠道沙门氏菌肠道亚种菌液，并且以经融化的NB琼脂培养基、BHI琼脂培养基以及添加有2.5％氯化钠的TSB琼脂培养基来作为上层琼脂培养基。
结果：
各组乳酸菌对于各个肠胃道病原菌的抑制效用如下面表8所示。
表8.各组乳酸菌对于各个肠胃道病原菌的抑制效用
注：抑制效用是以所形成的抑制区宽度来衡量的，其中“－”表示抑制区宽度为0cm，“+”表示>0至<2cm，“++”表示2至<3cm，“+++”表示3至<4cm，“++++”表示4至<5cm，“+++++”表示5至<8.5cm，以及“++++++”表示≥8.5cm。
由表8可见，对于不同的肠胃道病原菌，各个三菌组的抑制效用皆显著优于单菌组所具者。这表示：以特定的比例范围来组合使用鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115能够有效地抑制肠胃道病原菌的生长，并且其效用显著优于已知具有保护肠胃道效用的相同菌属或菌种的市售菌株所具者。
综合以上的实验结果，申请人认为：鼠李糖乳杆菌MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及动物双歧杆菌乳亚种BB-115在特定的比例范围(也就是1：0.2：0.67至1：9：9)下能够有效地附着于肠道细胞上，并协同地提升肠胃道屏障功能且抑制肠胃道病原菌生长，而被预期可供应用于改善肠胃道屏障功能异常相关疾病。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考数据。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明仅受如随文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CGMCC No.21225
分类命名：Lactobacillus rhamnosus
保藏日期：2020年11月23日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.15212
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种Bifidobacterium longum subsp.infantis
保藏日期：2018年1月15日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏编号：CGMCC No.21840
分类命名：Bifidobacterium animalis subsp.lactis
保藏日期：2021年2月26日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
序列表
<110> 锦乔生物科技有限公司
<120> 使用乳酸菌菌株组合来提升肠胃道屏障功能
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增CLDN1基因的正向引物CLDN1-F
<400> 1
gcgcgatatt tcttcttgca gg 22
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增CLDN1基因的反向引物CLDN1-R
<400> 2
ttcgtacctg gcattgactg g 21
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增GAPDH基因的正向引物GAPDH-F
<400> 3
gaaggtgaag gtcggagt 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工的序列
<220>
<223> 用于扩增GAPDH基因的反向引物GAPDH-R
<400> 4
gaagatggtg atggatttc 19
Claims (10)
1.一种乳酸菌菌株组合供应用于制备用来提升肠胃道屏障功能和/或改善肠胃道屏障功能异常相关疾病的组合物的用途，其特征在于：该乳酸菌菌株组合包含有呈范围落在1：0.2：0.67至1：9：9内的菌数比的Lactobacillus rhamnosus MP108(CGMCC No.21225)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC No.15212)以及Bifidobacterium animalis subsp.lactis BB-115(CGMCC No.21840)。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：该肠胃道屏障功能的提升包括下列至少一者：改善肠胃道上皮结构与功能、对抗肠胃道病原菌感染、促进益生菌定殖，以及调节肠胃道菌相。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：该肠胃道屏障功能异常相关疾病选自于由下列所构成的群组：腹泻、肠胃炎、发炎性肠道疾病(inflammatory bowel disease,IBD)、大肠激躁症(irritable bowel syndrome,IBS)、伤寒热(typhoid fever)、短肠症候群(short bowel syndrome,SBS)、小肠细菌过度生长(small intestine bacterialovergrowth,SIBO)，以及它们的组合。
4.一种乳酸菌菌株组合供应用于制备用来抑制肠胃道病原菌生长的组合物的用途，其特征在于：该乳酸菌菌株组合包含有呈范围落在1：0.2：0.67至1：9：9内的菌数比的Lactobacillus rhamnosus MP108、长双歧杆菌婴儿亚种BLI-02以及Bifidobacteriumanimalis subsp.lactis BB-115。
5.根据权利要求2或4所述的用途，其特征在于：该肠胃道病原菌选自于由下列所构成的群组：肠道沙门氏菌肠道亚种(Salmonella enterica subsp.enterica)、李斯特单胞菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肠炎弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾杆菌(Shigellaboydii)、痢疾志贺杆菌(Shigella dysenteriae)、克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiellapneumoniae)、小肠大肠炎耶氏杆菌(Yersinia enterocolitica)、普通变形杆菌(Proteusvulgaris)，以及它们的组合。
6.根据权利要求1或4所述的用途，其特征在于：该菌数比落在1：0.67：0.67至1：1.5：1.5的范围内。
7.根据权利要求1或4所述的用途，其特征在于：该组合物是食品组合物。
8.根据权利要求1或4所述的用途，其特征在于：该组合物是药学组合物。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：该药学组合物进一步包含有药学上可接受的载剂。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：该药学组合物呈供口服投药、局部投药或非经肠道投药的剂型。
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117187117A (zh) * | 2023-08-16 | 2023-12-08 | 锦乔生物科技有限公司 | 一种缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的益生菌组合物及应用 |
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2022
- 2022-01-26 CN CN202210095600.5A patent/CN116531411A/zh active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117187117A (zh) * | 2023-08-16 | 2023-12-08 | 锦乔生物科技有限公司 | 一种缓解便秘并调节肠道菌群紊乱的益生菌组合物及应用 |
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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