CN113913322A - 乳双歧杆菌BLa80在缓解腹泻和提升肠道免疫能力中的应用 - Google Patents
乳双歧杆菌BLa80在缓解腹泻和提升肠道免疫能力中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了乳双歧杆菌BLa80在缓解腹泻和提升肠道免疫能力中的应用，属于微生物技术领域。本发明的乳双歧杆菌BLa80保藏编号为CGMCC No.22547，其对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有很强的抑菌能力和共聚能力，对肠道上皮细胞具有较强的黏附能力，能够改善实验小鼠的腹泻发生率和提升实验小鼠的肠道免疫力。本发明的乳双歧杆菌BLa80可用于制备抑菌、预防和/或缓解腹泻、提升肠道免疫能力的产品，市场价值高。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术领域，尤其涉及一种乳双歧杆菌BLa80在缓解腹泻和提升肠道免疫能力中的新应用。
背景技术
腹泻是人体最常见的消化系统疾病，引起腹泻的病原体主要包括大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等。益生菌是肠道菌群中的优势菌群，其中双歧杆菌和乳杆菌是肠道中典型的益生菌。已有研究表明，益生菌的有益作用是可以黏附在肠黏膜上，抑制病原菌对肠粘膜的黏附作用，抑制有害菌的生长，稳定微生物群落结构，从而预防消化道炎症疾病发生，防止腹泻，比如婴儿腹泻、急性腹泻、旅行者腹泻、抗生素相关腹泻以及轮状病毒引起的腹泻等，还能降低血清中的胆固醇，刺激免疫系统以及提升肠道的免疫能力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乳双歧杆菌BLa80的新应用。
所述的乳双歧杆菌BLa80来源于母乳，该菌株于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株分类命名为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，保藏编号为CGMCC No.22547。乳双歧杆菌BLa80能够耐受胃肠道环境，具有较强耐胃酸耐肠液能力；对15种常见抗生素红霉素、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、万古霉素、头孢克洛、苯唑西林、头孢曲松、新生霉素、新霉素、头孢噻吩、克林霉素、阿奇霉素、甲氧嘧啶和利福平均敏感，无抗生素耐性，安全性高；对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等病原菌均具有极强的抑菌能力。
进一步研究发现，乳双歧杆菌BLa80对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌有很强的共聚能力，病原菌大肠杆菌、鼠寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均为常见引起腹泻的病原菌，比如季节性腹泻和旅行相关性腹泻。乳双歧杆菌BLa80具有较强的黏附能力，能与肠道上皮细胞发生黏附，发挥其益生作用。乳双歧杆菌BLa80能显著改善实验小鼠的腹泻发生率，能够提升实验小鼠肠道免疫力，降低实验小鼠结肠组织中促炎因子的表达，提高抗炎因子的表达。
基于上述内容，本发明提供如下应用和产品：
一种上述乳双歧杆菌BLa80在制备抑菌产品中的应用，所述的抑菌包括抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等。
一种上述乳双歧杆菌BLa80在制备预防和/或缓解腹泻产品中的应用。
一种上述乳双歧杆菌BLa80在制备提升肠道免疫能力产品中的应用。
一种抑菌产品，含有上述乳双歧杆菌BLa80。所述的抑菌包括抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等。
一种用于预防和/或治疗腹泻的产品，含有上述乳双歧杆菌BLa80。
一种用于提升肠道免疫能力的产品，含有上述乳双歧杆菌BLa80。
上述产品是一种包含乳双歧杆菌BLa80的功能性菌剂、食品、保健品和/或药品。
本发明的有益效果在于：本发明提供乳双歧杆菌BLa80的新用途，该菌种在预防和/或缓解腹泻以及在提升肠道免疫力产品中的应用。BLa80的特点是分离来源于母乳，安全性高，具有较强的耐受能力，较强的拮抗病原菌的能力，以及与不同病原菌的共聚能力，较强的黏附能力，并与肠道上皮细胞发生黏附，发挥其益生作用，市场价值高。
附图说明
图1是乳双歧杆菌BLa80对不同病原菌的拮抗能力结果图。
图2是乳双歧杆菌BLa80与不同病原菌的共聚能力结果图。
图3是不同组小鼠的腹泻率。
图4是不同组小鼠结肠组织中TNF-α的含量。
图5是不同组小鼠结肠组织中IL-6的含量。
图6是不同组小鼠结肠组织中IL-4的含量。
图7是不同组小鼠结肠组织中IL-10的含量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1乳双歧杆菌BLa80分离、筛选和鉴定
(1)分离与筛选：
采集中国边远牧区的母乳样品，无菌生理盐水稀释至合适梯度，涂布于添加有5％(V/V)的莫匹罗星锂盐、且含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐的MRS琼脂平板上，37℃厌氧条件下培养48h。挑选不透明乳白色、圆形有光泽、边缘整齐、表面凸起且湿润的单克隆菌落，在MRS固体培养基上进行反复划线纯化培养，经过细胞形态和个体形态观察，获得双歧杆菌菌株。
(2)分子生物学鉴定：
将双歧杆菌菌株采用基因组DNA抽提试剂盒提取菌株基因组DNA，采用上游引物27F(AGTTTGATCMTGGCTCAG)和下游引物1492R(GGTTACCTTGTTACGACTT)，对16S rDNA序列进行扩增，得到PCR产物。并对PCR产物进行测序。其中PCR反应体系：10×Buffer20μL，引物dNTP 4μL，上、下游引物各1μL，DNA模板2μL，Taq酶0.5μL，ddH2O 34.5μL。PCR反应条件：95℃10min；94℃30s，56℃30s，72℃2min，35个循环；72℃10min。将PCR产物通过凝胶电泳检测后送往武汉金开瑞生物工程有限公司测序。将鉴定的基因序列提交至NCBI数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov)中进行BLAST分析比对。根据分子生物学的鉴定结果，确定该菌株为乳双歧杆菌，将其命名为乳双歧杆菌BLa80。乳双歧杆菌BLa80的16S rDNA序列如SEQ IDNo 1所示。
乳双歧杆菌BLa80于2021年05月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，该菌株分类命名为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)，保藏编号为CGMCC No.22547。
实施例2乳双歧杆菌BLa80通过胃肠道的环境评价
模拟人工胃液：配制0.5％NaCl溶液，加入0.3％胃蛋白酶，用1mol/L HCL调节pH值至2.5，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
模拟人工肠液：配制0.5％NaCl溶液，加入0.1％胰蛋白酶，用0.1mol/L NaOH调节pH值至8.0，然后充分溶解后用0.22μm微孔滤膜过滤除菌备用。
乳双歧杆菌BLa80在厌氧条件下活化培养2代。将活化后的乳双歧杆菌BLa80菌液离心，收集菌体。取0.4mL菌体悬液分别接入1.6mL配制好的pH2.5的模拟人工胃液和pH8.0的模拟人工肠液中混匀，37℃条件下消化，同时分别取0h和3h的消化液检测活菌数，计算存活率，结果见表3。其中，菌株存活率(％)＝Nt/N0×100％，式中N0表示菌株0h的活菌数(CFU/mL)，Nt表示菌株3h的活菌数(CFU/mL)。
表1乳双歧杆菌BLa80模拟消化道环境实验数据表
表1结果显示，乳双歧杆菌Bla80在pH2.5的人工胃液中3h存活率为96.7％，在pH8.0的人工肠液中3h存活率为93.6％。实验说明，该乳双歧杆菌BLa80具备较强的耐受胃肠道环境的能力。
实施例3乳双歧杆菌BLa80的抗生素敏感性评价
将待测菌在含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐的MRS固体平板上划线活化后，制备菌悬液并调整菌悬液浓度为108CFU/mL，取100μL菌悬液加入含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐MRS固体平板上，用无菌棉签将菌液均匀涂布在平板上，贴上抗生素药敏片，以无抗生素的纸片为空白对照。置于厌氧条件下，37℃正置培养，24h后用直尺测量菌株对抗生素敏感性直径，结果见表2。
表2乳双歧杆菌BLa80对抗生素敏感性数据(mm)
表2结果所示，乳双歧杆菌BLa80对评价的14种抗生素红霉素、青霉素、阿莫西林、氨苄西林、万古霉素、头孢克洛、苯唑西林、头孢曲松、新生霉素、头炮噻吩、克林霉素、阿奇霉素利福平和甲氧嘧啶是高度敏感，抑菌圈直径都大于20mm，其中有10种抗生素的抑菌圈直径大于30mm。实验说明，乳双歧杆菌BLa80是安全的益生菌。
实施例4乳双歧杆菌BLa80的抑菌活性评价
取拮抗菌株按2％(V/V)接种至含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃恒温静置培养12h。将致病菌株大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种于液体牛肉膏蛋白胨培养基中，37℃、转数250rpm、恒温摇床过夜培养，然后制备病原菌悬液。将MRS固体培养基冷却至55℃左右，与病原菌悬液按一定比例混匀，使体系病原菌活菌数在106CFU/mL数量级，然后迅速倾注于预先放置牛津杯的平板中，待培养基冷却凝固后，取出牛津杯，于每孔注入200μL拮抗菌株菌液，将平皿轻盖后正置于37℃恒温培养箱，培养适宜时间后观察，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。
结果如图1显示，乳双歧杆菌BLa80对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌拮抗直径分别是42mm、41mm、27mm。表现出对肠道致病菌极强的抑制作用，尤其对大肠杆菌和沙门氏菌的抑制能力。
实施例5乳双歧杆菌BLa80与大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的共聚能力
乳双歧杆菌在厌氧条件下活化培养2代。将活化后的乳双歧杆菌BLa80菌液离心，收集菌体，PBS缓冲液清洗菌体2次后，然后重悬，调整OD600在0.6左右。病原菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌分别活化后，离心，收集菌体，PBS缓冲液清洗菌体2次后，然后重悬，调整OD600在0.6左右。取4mL乳双歧杆菌与4mL病原菌等体积混合，涡旋，充分混匀，室温静置孵育24h后，分别吸取上清测定菌液OD600。观察乳双歧杆菌与三种病原菌在24h时的共聚能力。同时以菌株L.lactis Bb-12作为对照，该菌株是公认的具有多种益生功能的商业菌株。
共聚力计算方式：
共聚力(％)＝[(Ax+Ay)/2-A(x+y)]/[(Ax+Ay)/2]×100％
其Ax代表乳双歧杆菌初始OD600，Ay代表病原菌的初始OD600，A(x+y)代表混合后在不同测定时间的OD600。
由图2可知，与菌株L.lactis Bb-12相比较，乳双歧杆菌BLa80有较强的与大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的共聚能力。益生菌与病原菌的共聚能力越强，更能有效阻止病原菌黏附并定植于肠黏膜上，说明越有利于人体健康。
实施例6乳双歧杆菌BLa80的黏附能力测试
菌种活化：乳双歧杆菌BLa80按2％接种量接种于含有0.1％的L-半胱氨酸盐酸盐MRS液体培养基的厌氧玻璃管中，37℃培养14h，取发酵液离心、收集菌体，用PBS洗涤3次后，将菌体重悬于不含双抗的DMEM培养液中，调节菌悬液的浓度为108CFU/mL。
HT-29细胞培养：在细胞培养瓶中，加入5mL DMEM完全培养液(含10％胎牛血清，1％青霉素和链霉素溶液)，于5％CO2恒温培养箱中37℃孵育，每天换1次培养液，待细胞状态良好后(70％～80％融合)，用0.2％消化液(胰酶-EDTA)进行消化传代。
黏附性试验：将消化的HT-29细胞调整浓度到105cell/mL，接种到12孔细胞培养板中，每孔1mL，于5％CO2浓度的培养箱中孵育至细胞长至单层，用无菌PBS洗涤两次，其中1孔用胰酶消化，用血球计数板进行细胞计数；分别2孔加入BLa80菌悬液和对照菌鼠李糖乳杆菌LGG菌悬液各1mL，于5％CO2培养箱中37℃孵育2h后，用无菌PBS洗涤细胞5次，除去未黏附的菌悬液，每孔加入0.2mL胰酶-EDTA缓冲液消化细胞5min，消化完后加入0.8mL PBS吹打均匀，取菌液进行稀释活菌计数。上述细胞黏附性实验以鼠李糖乳杆菌LGG作为对比菌株，每个实验做3个平行，鼠李糖乳杆菌LGG是行业内公认的黏附性较好的商业菌株，通过黏附实验对菌株对HT-29细胞的黏附性进行检测，结果如表3。
表3乳双歧杆菌BLa80黏附特性测试结果
由表3结果可知，本发明的乳双歧杆菌BLa80菌株黏附性能有明显优势。
实施例7BLa80对BALB/c雄性小鼠无毒副作用
将乳双歧杆菌BLa80菌体重悬于PBS溶液中，制成浓度为2.0×109CFU/mL的菌悬液。取体重20g左右的健康雄性BALB/c小鼠10只，适应环境5天后，每日给予20mL/kg bw进行灌胃，观察一周，记录死亡和体重情况。
实验结果表明，乳双歧杆菌BLa80未对小鼠造成明显影响，体重无显著变化，无死亡现象产生。小鼠外观无明显病理症状。
实施例8乳双歧功能BLa80缓解小鼠腹泻的作用
实验取SPF级BALB/c雄性小鼠36只，体重18-20g。动物饲养室温温度23±2℃，湿度50％±10％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养5天后随机分组，每组12只，分为3组，包括对照组、模型组(葡聚糖硫酸钠DSS)和益生菌+DSS组(灌胃乳双歧杆菌BLa80菌液，同时饮用DSS)，试验期14天。对照组，试验开始到结束期间每天自由进食和饮水；模型组，前7天自由进食和饮水，第8天开始在小鼠饮水中添加2.5％(W/V)DSS溶液；益生菌+DSS组：前7天每天灌胃含2.0×109CFU/mL乳双歧杆菌BLa80的PBS溶液0.2mL；从第8天开始，灌胃含2.0×109CFU/mL乳双歧杆菌BLa80的PBS溶液0.2mL，同时小鼠饮水中添加2.5％DSS溶液。每天观察各组小鼠的粪便性状、便血和腹泻情况，并统计腹泻率。
结果(图3)显示，模型组(DSS)给药第3天，个别出现肉眼可见便血症状，第4天出现小鼠腹泻现象，给药7天后，小鼠腹泻症状(包括稀疏粪便)有56％。益生菌+DSS组给药第4天个别出现肉眼可见便血症状，给药7天后，出现小鼠腹泻症状(包括稀疏粪便)为19％。说明乳双歧杆菌BLa80能显著改善小鼠的腹泻发生率。
实施例9乳双歧杆菌BLa80对小鼠的免疫调节作用
实验取SFP级BALB/c雄性小鼠36只，体重18-20g。动物饲养室温温度23±2℃，湿度50％±10％，12h/12h昼夜交替，自由进食及饮水的条件下适应饲养7天后随机分组，每组12只，分为3组，包括对照组、模型组(DSS)和益生菌+DSS组(灌胃乳双歧杆菌BLa80菌液，同时饮用DSS)，试验期14天。对照组，试验开始到结束期间每天自由进食和饮水；模型组，前7天自由进食和饮水，第8天开始在小鼠饮水中添加2.5％(W/V)DSS溶液；益生菌+DSS组：前7天每天灌胃含2.0×109CFU/mL乳双歧杆菌BLa80的PBS溶液0.2mL；从第8天开始，灌胃含2.0×109CFU/mL乳双歧杆菌BLa80的PBS溶液0.2mL，同时小鼠饮水中添加2.5％DSS溶液。实验结束后，摘眼取血引颈处死所有小鼠，取各组小鼠结肠组织，通过ELISA酶联免疫法测定每组小鼠结肠组织匀浆中抗炎因子IL-10、IL-4和促炎因子TNF-α、IL-6的表达量。
结果如图4-7所示：与对照组比，模型组结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-6的含量显著升高，抗炎因子IL-4和IL-10的含量显著降低。与模型组比，益生菌+DSS组结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-6的含量显著降低，抗炎因子IL-4和IL-10的含量显著升高。与对照组，益生菌+DSS组的抗炎因子IL-4和IL-10的含量差异无显著。实验表明，乳双歧杆菌BLa80能够调节小鼠肠道免疫能力，降低小鼠结肠组织中促炎因子的表达，提高抗炎因子的表达。
上述实施例便于本领域技术人员更好的理解本发明，本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种乳双歧杆菌(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)在制备抑菌产品中的应用，其特征在于：所述的乳双歧杆菌为保藏编号为CGMCC No.22547的乳双歧杆菌BLa80，所述的抑菌包括抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
2.一种乳双歧杆菌在制备预防和/或缓解腹泻产品中的应用，其特征在于：所述的乳双歧杆菌为保藏编号为CGMCC No.22547的乳双歧杆菌BLa80。
3.一种乳双歧杆菌在制备提升肠道免疫能力产品中的应用，其特征在于：所述的乳双歧杆菌为保藏编号为CGMCC No.22547的乳双歧杆菌BLa80。
4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于：所述的产品为功能性菌剂、食品、保健品和/或药品。
5.一种抑菌产品，其特征在于：包含保藏编号为CGMCC No.22547的乳双歧杆菌BLa80，所述的抑菌包括抑制大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌。
6.一种预防和/或缓解腹泻的产品，其特征在于：包含保藏编号为CGMCC No.22547的乳双歧杆菌BLa80。
7.一种提升肠道免疫能力的产品，其特征在于：包含保藏编号为CGMCC No.22547的乳双歧杆菌BLa80。
8.根据权利要求5-7任一项所述的产品，其特征在于：所述的产品为功能性菌剂、食品、保健品和/或药品。
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